[0001] 本发明涉及蚓激酶效价测定技术领域，具体涉及一种测定蚓激酶效价的方法。

[0002] 蚓激酶（Lumbrukinase），是从特种蚯蚓中提取的一组蛋白水解酶，分子量为16000‑45000Da。蚓激酶为抗血栓药，临床上主要用于血栓性疾病，尤其是伴纤维蛋白原增高及血小板聚集率增高的患者；用于缺血性心脑血管疾病，可改善症状、防止病情发展。

[0003] 目前蚓激酶效价测定采用《WS1‑(X‑052)‑2001Z‑2010》的标准进行测定，该方法因采用手工打孔及手工测量，人为因素干扰较大，存在以下缺陷：溶圈大小易受打孔深浅的影响，孔的深度与溶圈直径成反比例关系；由于溶圈直径的边界效应，测量存在5%‑10%的误差；由于打孔及溶圈的测量均为人工操作，存在较大的不可避免的测量误差；反应时间较长，需要反应18小时后才能进行效价测定。

[0004] 中国专利申请CN201711166331.2公开了一种近红外光谱测定地龙提取中间体中蚓激酶效价的方法，但是该方法相关性低、专属性不强，且也需要反应18h后才能进行效价的测定。

[0005] 因此，开发一种自动化程度高、准确度好、检测速度快的蚓激酶效价的测定方法是非常必要的。

[0026] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

[0027] 实施例11.1试剂、标准品：
试剂：磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、琼脂糖、纤维蛋白原、凝血酶；
标准品：蚓激酶标准品。

[0028] 1.2 操作：1.2.1试剂的配制：
0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.8）：取磷酸氢二钠3.58 g，加水使溶解并稀释至
1000 mL为A液；取磷酸二氢钠（NaH2PO4· 2H2O）0.78 g，加水使溶解并释释至500 mL为B液；
将A、B两液混合至pH值为7.8。

[0029] 0.9%氯化钠溶液：取氯化钠（NaCl）9 g，加水使溶解并稀释至1000 mL。

[0030] 工作溶液：取0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.8）与0.9%氯化钠溶液（1：17，V/V）混合。

[0031] 琼脂糖溶液：取琼脂糖1.4 g，加工作溶液100 mL加热溶解。

[0032] 纤维蛋白原溶液：取纤维蛋白原适量，加工作溶液制成每1 mL中含1.4 mg可凝蛋白溶液。纤维蛋白原购自中国食品药品检定研究院，货号为140607‑202244。

[0033] 凝血酶溶液：取凝血酶，加0.9%氯化钠溶液制成每1 mL中含0.9 BP单位的溶液。凝血酶购自中国食品药品检定研究院，货号为140605‑202228。

[0034] 1.2.2 标准品溶液的制备：取蚓激酶标准品，用0.9%氯化钠溶液制成浓度分别为每1 mL中含10000 IU、9000 IU、8000 IU、7000 IU、6000 IU、5000 IU、4000 IU蚓激酶单位的溶液。蚓激酶标准品购自中国食品药品检定研究院，货号为140650‑201804。

[0035] 1.2.3 供试品溶液的制备：取蚓激酶供试品适量，加0.9%氯化钠溶液使溶解并稀释成标准曲线范围内的浓度。

[0036] 1.3 测定：取纤维蛋白原溶液130 mL，置烧杯中，边搅拌边加入50℃琼脂糖溶液130 mL，凝血酶溶液10 mL，立即混匀，快速倒入96孔酶标板，室温水平放置0.5小时待混合溶液凝固。在
490 nm波长下用酶标仪测定各孔OD值，剔除OD值偏差较大的孔不用，精密量取不同浓度的蚓激酶标准品溶液及供试品溶液各20 µL，分别加入同一酶标板的不同测定孔中，使测定孔中蚓激酶标准品效价为200 IU、180 IU、160 IU、140 IU、120 IU、100 IU、80 IU，在490 nm波长下用酶标仪测定各孔OD值（记作OD空白）。加盖，置36℃恒温箱中反应5小时。取出后用酶标仪在490 nm下测定OD值（记作OD测定），按下式计算OD值变化差异率。

[0037] 。

[0038] 以蚓激酶标准品效价为横坐标，OD值变化差异率为纵坐标，得到标准曲线，如图12
所示，计算回归方程，得到回归方程：Y = 0.001547*X + 0.4213，R=0.9979。

[0039] 将供试品OD值变化差异率代入回归方程，计算供试品效价单位数。标准品与供试品应各做6孔，以平均值计算。

[0040] 实施例21.1试剂、标准品：
试剂：磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、琼脂糖、纤维蛋白原、凝血酶；
标准品：蚓激酶标准品。

[0041] 1.2 操作：1.2.1试剂的配制：
0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.8）：取磷酸氢二钠3.58 g，加水使溶解并稀释至
1000 mL为A液；取磷酸二氢钠（NaH2PO4· 2H2O）0.78 g，加水使溶解并释释至500 mL为B液；
将A、B两液混合至pH值为7.8。

[0042] 0.9%氯化钠溶液：取氯化钠（NaCl）9 g，加水使溶解并稀释至1000 mL。

[0043] 工作溶液：取0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.8）与0.9%氯化钠溶液（1：17，V/V）混合。

[0044] 琼脂糖溶液：取琼脂糖1.6 g，加工作溶液100 mL加热溶解。

[0045] 纤维蛋白原溶液：取纤维蛋白原适量，加工作溶液制成每1 mL中含1.6 mg可凝蛋白溶液。纤维蛋白原购自中国食品药品检定研究院，货号为140607‑202244。

[0046] 凝血酶溶液：取凝血酶，加0.9%氯化钠溶液制成每1 mL中含1.1 BP单位的溶液。凝血酶购自中国食品药品检定研究院，货号为140605‑202228。

[0047] 1.2.2 标准品溶液的制备：取蚓激酶标准品，用0.9%氯化钠溶液制成浓度分别为每1 mL中含10000 IU、9000 IU、8000 IU、7000 IU、6000 IU、5000 IU、4000 IU蚓激酶单位的溶液。蚓激酶标准品购自中国食品药品检定研究院，货号为140650‑201804。

[0048] 1.2.3 供试品溶液的制备：取蚓激酶供试品适量，加0.9%氯化钠溶液使溶解并稀释成标准曲线范围内的浓度。

[0049] 1.3 测定：取纤维蛋白原溶液130 mL，置烧杯中，边搅拌边加入60℃琼脂糖溶液130 mL，凝血酶溶液10 mL，立即混匀，快速倒入96孔酶标板，室温水平放置1小时待混合溶液凝固。在490 nm波长下用酶标仪测定各孔OD值，剔除OD值偏差较大的孔不用，精密量取不同浓度的蚓激酶标准品溶液及供试品溶液各20 µL，分别加入同一酶标板的不同测定孔中，使测定孔中蚓激酶标准品效价为200 IU、180 IU、160 IU、140 IU、120 IU、100 IU、80 IU，在490 nm波长下用酶标仪测定各孔OD值（记作OD空白）。加盖，置38℃恒温箱中反应6小时。取出后用酶标仪在490 nm下测定OD值（记作OD测定），按下式计算OD值变化差异率。

[0050] 。

[0051] 以蚓激酶标准品效价为横坐标，OD值变化差异率为纵坐标，得到标准曲线，如图22
所示，计算回归方程，得到回归方程：Y = 0.001662*X + 0.4127，R=0.9936。

[0052] 将供试品OD值变化差异率代入回归方程，计算供试品效价单位数。标准品与供试品应各做6孔，以平均值计算。

[0053] 测试结果以下描述中将《WS1‑(X‑052)‑2001Z‑2010》方法称为原方法，将本发明实施例1的方法称为新方法1，本发明实施例2的方法称为新方法2。

[0054] 1、采用原方法与新方法1分别对蚓激酶（批号：2004001，江中药业股份有限公司）进行六次效价测定，评价方法的精密度。数据如表1所示。

[0055] 表1六次效价测定结果（IU）与RSD值

[0056] 2、采用原方法与新方法2分别对蚓激酶（批号：2004001，江中药业股份有限公司）进行六次效价测定，评价方法的精密度。数据如表2所示。

[0057] 表2六次效价测定结果（IU）与RSD值

[0058] 3、采用原方法与新方法1分别对已知效价含量的蚓激酶（批号：2004001，江中药业股份有限公司）进行加样回收测定，评价方法的准确度。数据如表3所示。

[0059] 表3

[0060] 4、采用原方法与新方法2分别对已知效价含量的蚓激酶（批号：2004001，江中药业股份有限公司）进行加样回收测定，评价方法的准确度。数据如表4所示。

[0061] 表4

[0062] 5、采用新方法1和2所需反应时间为5‑6 h，相比于原方法所需反应时间为18 h，缩短了检测时间，提高了检测效率。

[0063] 上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。