[0001] 本发明属于医学生物学领域，涉及一类对抗脱发等问题的多肽及相关物及其应用。

[0002] 脱发(Hair Loss，Loss ofhair)是指头发脱落的现象，分为生理性脱发和病理性脱发。其中，生理性脱发是指头发在退行期和休止期正常脱落，以维持正常数量的头发。而病理性脱发是指头发异常或过度的脱落。

[0003] 2017年《中国脱发人群调查报告》数据表明：目前我国脱发人群大约在2亿左右，且每年正在以至少15％的速度不断增加。脱发人群中以男性居多，约为1.3亿。

[0004] 造成脱发的原因很多，遗传因素、免疫因素、精神压力过大、熬夜、药物(如化疗脱发)、环境因素、内分泌紊乱等都会引起脱发。

[0005] 根据病因可将脱发分为压力性脱发、雄激素/脂溢性脱发、病理性脱发、物理/化学性脱发、营养性脱发、肥胖性脱发、遗传性脱发以及瘢痕性脱发等。目前已被美国食品和药物管理局(FDA)批准的治疗脱发的药物有两种——米诺地尔和非那雄胺。其中米诺地尔为头皮局部涂抹药物，存在“狂脱期”，见效时间长且有一定的副作用；非那雄胺为口服药物，但其对女性生育有重大隐患，且对绝经后女性无效，因此不建议女性服用。临床上需要开发出更安全、有效、适用于多样人群和多种脱发类型的干预药物。

[0006] 雄激素性脱发(AGA)分为男性型(MPHL)和女性型(FPHL)，是由遗传因素和雄激素的作用引起的。男性和女性在性激素方面的不同使得男性脱发和女性脱发有很大的差异性，在病因、诊断和治疗等方面均有所不同。男性体内雄激素水平较高，睾酮到达毛囊后会被5α‑还原酶转换为双氢睾酮DHT，引起毛囊萎缩，头发逐渐变细，在具有遗传因素的男性中引起脱发，主要表现为发际线后移，M型脱发，最后形成秃顶。对女性来说，体内雄激素水平较低，且雌激素能够抑制雄激素，然而当体内激素平衡被打破或中年期以后雌激素减少时，就会因为雌激素分泌不足/雄激素过多而导致脱发，主要呈现渐进性的掉发，以渐进性毛囊微小化为临床特征，头顶中心头发逐渐变细、稀疏。

[0007] 雄激素在男性型雄激素性脱发发病机制中的作用已经基本明确，而在女性型雄激素性脱发发病中的作用机制尚不明确，除雄激素外，可能还涉及非雄激素依赖途径，如头皮慢性低度炎症、雄激素不敏感综合征、雌激素不足、甲状腺功能异常、代谢综合征等【参考自“女性雄激素性脱发诊断与治疗中国专家共识(2022版)”】。

[0076] 为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施案例，对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限以下实施例。

[0077] 术语

[0078] 压力造成的毛囊衰退和/或脱发是指慢性压力造成的肾上腺释放压力激素即皮质激素，会造成毛囊休止期延长，影响毛囊干细胞活化，造成毛发再生障碍。

[0079] 脂溢性的毛囊衰退和/或脱发是指雄激素促进皮脂腺分泌油脂过多，在毛囊周围堆积，引起毛囊微小化，最终导致脱发。

[0080] 压力造成的痤疮和/或皮炎是指压力通过作用于下丘脑‑垂体‑肾上腺轴，促进压力激素和促炎介质的释放，刺激皮脂腺和毛囊，导致皮肤炎症增加。

[0081] 脂溢性的痤疮和/或皮炎是指由于毛囊油脂积聚过多，引发炎症反应从而导致的痤疮和/或皮炎。

[0082] 本发明中多肽选自如下SEQ ID NO.1‑9任一项所示的多肽序列：

[0083]

[0084] 所述多肽衍生肽为包含上述序列的多肽，或与上述序列同源性高于50％的序列；

[0085] 多肽以及多肽衍生肽的衍生物为上述多肽或多肽衍生肽的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行常规修饰得到的产物，或连接用于多肽或蛋白检测或纯化的标签所得到的产物，或经过同位素标记修饰得到的产物。

[0086] 实施例1：多肽序列的制备

[0087] 采用人工合成的方法合成多肽序列，

[0088] 所述多肽序列如下所述：

[0089]

[0090]

[0091] 采用常规的固相合成或液相合成的方法合成上述多肽。其中利用固相合成多肽法为从C端的氨基酸向N端反应，经过树脂活化、氨基酸链接、洗脱保护、检测等步骤，逐个完成氨基酸链接，然后用过量乙醚沉淀离心，对粗肽经过HPLC纯化后，质谱分析，在液氮中速冷冻干备用。

[0092] 实施例2：多肽与受体结合

[0093] 人与小鼠GPR1氨基酸序列一致性(sequence identity)为80％，申请人已成功在HEK293细胞中构建过表达human GPR1和mouse GPR1细胞株，将荧光标记的多肽(Rhodamine标记的LRH‑G3)与细胞共培养，通过免疫荧光染色观察多肽与过表达human GPR1和mouse GPR1的细胞的结合情况。

[0094] 实验结果见图1，分子对接模拟显示，LRH‑G3可与human GPR1和mouse GPR1胞外域结合(图A)。过表达human GPR1和mouse GPR1的细胞株经qPCR鉴定构建成功(图B)。荧光染色结果显示，LRH‑G3可HEK293‑hGPR1和HEK293‑mGPR1细胞结合(图C)。

[0095] 实施例3：多肽通过与受体作用缓解chemerin对cAMP信号通路的抑制作用[0096] (1)环磷酸腺苷(cAMP)酶联免疫吸附实验：

[0097] ①细胞铺板：高表达GPR1的293T细胞(293T GPR1+/+)，分别以5ⅹ105个/孔接种于6孔细胞培养板中，每孔培养基体积为1mL，放置于培养箱中培养24h后，饥饿过夜，加入不同浓度梯度(3μM，0.3μM，0.03μM)的LRH‑G3和LRH‑G5多肽，Fosklin(25μM)以及chemerin(30nM)作用6h；

[0098] ②样品制备：每孔加入300μL的细胞裂解液，4℃放置20分钟，用细胞刮刀刮取收集细胞，上下颠倒混匀后，12,000rpm离心10分钟，收集上清；

[0099] ③样品浓度测定：样品浓度通过BCA法测定；

[0100] ④环磷酸腺苷(cAMP)酶联免疫吸附测试：

[0101] a,准备所需试剂，每个样品准备3个复孔；

[0102] b,将50μL的样品或标准品加入包被有抗体的96孔板中；再在每孔中加入25μL cAMP过氧化物酶示踪剂缀合物；

[0103] c,每孔加入50μLAnti‑cAMP抗体，室温，摇床上缓慢孵育30分钟；

[0104] d,使用洗脱液清洗5次，每孔加入100μL化学反光剂，室温孵育5分钟；

[0105] e,酶标仪读板，记录发光值。

[0106] 图2A显示，在高表达GPR1的293T细胞(293T CMKLR1+/+)中加入加入Forskolin，可以刺激cAMP水平，而chemerin可以抑制Forskolin刺激cAMP的作用，再加入不同浓度的LRH‑G3和LRH‑G5(3μM，0.3μM，0.03μM)作用后，可以抑制chemerin的作用。

[0107] 综上所述，可以推断出，LRH‑G3和LRH‑G5多肽可以特异性的通过与GPR1作用来进一步抑制chemerin对cAMP浓度的降低作用。

[0108] 实施例4：多肽可以有效抑制chemerin引起的钙(Ca2+)内流作用

[0109] ①细胞铺板：将野生型293T细胞和高表达GPR1的293T细胞(293T GPR1+/+)，分别以3
5ⅹ10个/孔接种于96孔细胞培养板中，每孔培养基体积为200μL，放置于培养箱中培养24h后，饥饿过夜；

[0110] ②试剂配置：将丙磺舒融入1mL缓冲溶液中，配置成浓度为250nM的丙磺舒，摇匀后，加入荧光试剂中准备待用；

[0111] ③去掉细胞培养基，加入不同浓度梯度(30μM，3μM，0.3μM，0.03μM，0.003μM)的LRH‑G3和LRH‑G5多肽以及chemerin(0.3nM)作用30分钟，然后每孔加入100μL上述荧光试剂；

[0112] ④37℃放置30分钟，然后室温放置30分钟；

[0113] ⑤在激发光494nm和发射光516nm处测量荧光吸光值。

[0114] 图2B显示，在高表达GPR1的293T细胞(293T GPR1+/+)中，chemerin在作用浓度为2+ 2+
0.3nM时，可以促进钙(Ca )流信号通路，增高钙离子(Ca )浓度。而在加入不同浓度的LRH‑
2+ 2+
G3和LRH‑G5多肽后，可以显著降低钙离子(Ca )浓度，抑制chemerin对钙(Ca )流信号通路
2+
的激活。但是在野生型不表达GPR1的293T细胞中，chemerin对钙(Ca )流信号通路无激活作
2+
用，LRH‑G3和LRH‑G5多肽对钙(Ca )流信号通路也无作用效果，通过该实验可以推断出，
2+
chemerin可以通过与受体GPR1结合来激活钙(Ca )流信号通路，而LRH‑G3和LRH‑G5多肽可
2+
以特异性的抑制chemerin/GPR1信号通路来降低钙离子(Ca )浓度。

[0115] 实施例5：多肽及其衍生物的受体的表达和分布

[0116] 利用The human ProteinAtlas(人的蛋白图谱)，检索多肽及其衍生物的受体在人脑、睾丸和卵巢组织细胞中的表达和定位。

[0117] 检索结果见图3，通过单细胞测序结果，可见chemerin及其受体GPR1在人脑、睾丸和卵巢组织中各种细胞和神经元的表达情况。

[0118] 实施例6：Cy5标记的多肽靶向雌性小鼠脑、肾上腺、卵巢和皮肤组织能力的检测[0119] 成年雌性小鼠尾静脉注射Cy5标记的乱序不相关多肽、Cy5标记的G3和G5多肽，每只小鼠注射100μL，24小时后，在小动物成像仪下检测。

[0120] 实验结果见图4，通过对比结果可见可见脑组织、卵巢、肾上腺和皮肤组织较对照组有明显荧光信号，表明G3和G5多肽在脑、卵巢、肾上腺和皮肤组织有特异的定位结合能力。

[0121] 实施例7：Cy5标记的多肽靶向雄性小鼠脑、性//肾上腺和皮肤组织能力的检测[0122] 成年雄性小鼠尾静脉注射Cy5标记的乱序不相关多肽、Cy5标记的G3和G5多肽，每只小鼠注射100μL，24小时后，在小动物成像仪下检测。

[0123] 实验结果见图5，通过对比结果可见脑、肾上腺、睾丸和附睾以及皮肤组织都较对照组有明显荧光信号，表明多肽在雄性脑、肾上腺、性腺和皮肤组织有特异的定位结合能力。

[0124] 综上，实施例6和7的结果证明多肽能够在体内靶向雌性和雄性小鼠脑、肾上腺、性腺和皮肤组织，对压力脱发模型和雄激素脱发模型来说，脑(大脑皮层神经元)和肾上腺(皮质激素)与压力调控相关，雌雄性腺与激素调控相关，多肽可能通过作用压力和激素调控的靶组织调控脱发过程。

[0125] 实施例8：受体GPR1在小鼠下丘脑中的表达和定位

[0126] 对成年C57雌性小鼠4％多聚甲醛灌注后，进行下丘脑组织的解剖分离，冰冻切片后，用GPR1、CRF和GnRH抗体免疫荧光染色。

[0127] 实验结果见图6，可见GPR1在下丘脑有特异的表达，且与促肾上腺皮质激素释放因子(corticotropinreleasing factor，CRF)和促性腺素释放激素(Gonadotropin‑Releasing Hormone，GnRH)共定位。

[0128] 实施例9：受体GPR1在小鼠垂体中的表达和定位

[0129] 对成年C57雌性小鼠4％多聚甲醛灌注后，进行垂体组织的解剖分离，冰冻切片后，用GPR1、FSH/LH、GH、TSH、ACTH抗体免疫荧光染色。

[0130] 实验结果见图7，可见GPR1在垂体有特异的表达，且与垂体分泌激素(卵泡刺激素FSH、黄体生成素LH、生长激素GH、促甲状腺激素TSH、促肾上腺皮质激素ACTH)共定位。

[0131] 实施例10：小鼠压力性脱发模型

[0132] 7周龄雄性C57BL/6小鼠使用类固醇皮质激素地塞米松建立压力性脱发模型(造模周期23天)，治疗组在造模的同时皮肤局部涂抹多肽G5。

[0133] 去除背部处于休止期的毛发，并用脱毛膏脱毛。模型组小鼠每天一次在脱毛区域局部使用地塞米松溶液(100nM，0.1mL，溶于丙二醇)进行涂抹，连续23天。治疗组小鼠在每天涂抹药物的同时，灌胃多肽，浓度为0.5mg/kg/day。

[0134] 实验结果见图8，通过对比结果可知，G多肽能缓解皮肤局部类固醇皮质激素地塞米松诱导的小鼠脱发现象。

[0135] 实施例11：小鼠雄激素(脂溢性)脱发模型

[0136] 7周龄C57BL/6小鼠使用DHT涂抹处理(造模与实验周期共28天)

[0137] 去除背部2*2cm处于休止期的毛发，并用脱毛膏脱毛。DHT溶液(0.2％，w/v)在乙醇2
溶液(50％，v/v)中制备。每天一次在脱毛区域局部使用DHT溶液(0.1mL/cm)进行涂抹，连续28天，另一组小鼠在每天涂抹DHT的同时，皮肤局部涂抹多肽G5，浓度为1mg/kg/day。

[0138] 实验结果见图9(雌鼠)和图10(雄鼠)，通过对比结果可知，G多肽能缓解雄激素造成的小鼠脱发现象。

[0139] 实施例12：GPR1KO小鼠雄激素(脂溢性)脱发模型

[0140] 野生型雄鼠和GPR1KO雄性小鼠建立雄激素脱发模型，造模方法同实施例11。

[0141] 实验结果见图11，通过对比两种小鼠的造模过程可见，GPR1KO小鼠在造模第14天时，其背部因雄激素导致的脱发现象缓解程度显著优于野生型小鼠。

[0142] 实施例13：DHT造模第14天野生型与GPR1KO雄鼠皮肤相关基因表达检测

[0143] 通过对实施例12中造模第14天的野生型小鼠和GPR1KO小鼠颈背部皮肤的相关基因检测结果(图12)可见，DHT造模14天后，雄鼠皮肤中雄激素受体AR、5α‑还原酶(促进睾酮转化为双氢睾酮DHT)、睾酮生成相关酶基因3βHSD和17βHSD、促毛囊细胞凋亡因子TGFβ、炎性因子TNFα和IL‑6、毛囊退化标志物MMP‑9、Wnt信号通路拮抗剂DKK1、脂肪分化因子PPARγ和脂肪酸结合蛋白FABP3的基因表达显著升高，Wnt信号通路相关因子Wnt7a表达显著降低。GPR1KO雄鼠在DHT造模14天时相关基因的变化趋势得到显著缓解。

[0144] 实施例14：DHT诱导雄激素/脂溢性脱发细胞模型

[0145] 人原代真皮毛乳头细胞去除血清饥饿细胞24小时后，使用10nM DHT添加至培养基中进行高雄激素处理，检测24小时后细胞分子标志物(5α‑脱氢酶、AR、CD200、IL‑6、BCL2、BAX、FABP3等)的表达情况。同时添加不同序列多肽(G1‑G9)共培养，检测24小时后细胞分子标志物的表达情况。

[0146] 如图13和14的结果可见，DHT处理后细胞雄激素受体AR、5α还原酶和雄激素合成相关酶(3βHSD，17βHSD)的表达显著增加，同时毛囊细胞凋亡(Caspase‑3、BCL2、BAX)增加、促毛囊细胞凋亡因子TGF‑β、炎性因子(TNF‑α、IL‑6)表达增加，毛囊退化标志物MMP‑9表达增加，毛囊干细胞标志物CD133和CD200表达降低，脂肪酸结合蛋白FABP3和脂肪分化因子PPARγ表达增加，Wnt信号通路拮抗剂DKK1表达增加，Wnt信号通路相关因子Wnt7a表达显著降低。G1‑G9序列多肽能够在一定程度上缓解这些变化。

[0147] 说明本发明的多肽能够用于缓解雄激素脱发，尤其是由于雄激素受体AR5α还原酶和雄激素合成相关酶(3βHSD，17βHSD3)的表达显著增加、毛囊细胞凋亡、炎性因子表达异常增加、毛囊退化导致的雄激素/脂溢性毛囊衰退或脱发，以及雄激素/脂溢性痤疮或皮炎。

[0148] 实施例15：皮质醇诱导压力脱发细胞模型

[0149] 人原代真皮毛乳头细胞去除血清饥饿细胞24小时后，使用含有1μM皮质醇培养液进行24小时培养。检测24小时后细胞分子标志物(5α‑脱氢酶、GR、AR、CD200、IL‑6、BCL2、BAX等)的表达情况。同时添加不同序列多肽(G1‑G9)共培养，检测24小时后细胞分子标志物的表达情况。

[0150] 如图15和16结果可见，皮质醇处理后细胞雄激素受体AR、糖皮质激素受体GR和皮质醇生成相关酶Cyp21的表达显著增加，同时毛囊细胞凋亡(Caspase‑3、Bcl2)增加、压力引发的磷酸化蛋白STIP1和促毛囊凋亡因子TGFβ、炎性因子(TNF、IL‑6)表达增加，毛囊退化标志物MMP‑9表达增加，毛发生长标志物GAS和毛囊干细胞标志物CD200表达降低，Wnt信号通路拮抗剂DKK1表达增加，Wnt信号通路相关因子Wnt7a表达显著降低。G1‑G9序列多肽能够在一定程度上缓解这些变化。

[0151] 说明本发明的多肽能够用于缓解压力性脱发，尤其是由于毛囊细胞凋亡、磷酸化蛋白STIP1异常增加的表达、炎性因子异常增加的表达、毛囊生长降低导致的压力造成的毛囊衰退或脱发，以及压力造成的痤疮或皮炎。

[0152] 综上，本发明提供的一种多肽及其相关物可用于制备对抗因压力、和/或雄激素、和/或脂溢性造成的毛囊衰退、和/或脱发等相关疾病治疗药物。

[0153] 以上所述仅为本发明的具体实施方式，不是全部的实施方式，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。