[0001] 本发明属于畜禽养殖领域，涉及一种抑制沙门氏菌生长的抗生素替代品研制。

[0002] 抗生素的抗药、耐药及在畜产品中的残留，给畜禽健康养殖和人类健康构成了严重威胁，寻找可代替抗生素类的饲料添加剂势在必行。随着抗生素禁止作为饲料添加剂在饲料工业中的应用，抗生素替代品的研制与应用变得越来越重要。

[0003] 近年来饲用抗生素替代品的研究已成为科技工作者关注的重点，开发低毒、高效、无害的抗菌添加剂势在必行。抗生素替代品一般具有以下特点：物质本身或其代谢产物不影响饲料适口性，对动物无毒副作用，杀灭或抑制病原微生物的生长繁殖，不易或不诱发耐药菌产生，也不易诱发交叉耐药菌的产生，环境优好。当前饲用抗生素替代品不断的推陈出新，概括起来，目前饲用抗生素替代品主要有如下：酸化剂，酶制剂，低聚糖类，中草药及植物提取物类，微生态制剂，抗菌肽等。但是这些替代品不同程度上存在诸如效率低、生产技术不完善、产品质量难以保证、对饲料加工条件不稳定、破坏饲料中营养物质等问题。公开号CN104304675A公开了一种抗菌饲料添加剂与应用，该饲料添加剂由乳酸甘油酯组成，主要是用于鲫鱼的，对肉鸡的效果未可知。而在肉鸡饲养领域，常用抗生素金霉素来治疗肉鸡的腹泻，降低死亡率；但存在抗药、耐药、残留及效果差等问题。为了寻求一种替代抗生素的饲料添加剂，本课题组进行了深入的研究。

[0021] 下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0022] 下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

[0023] 试验材料

[0024] 干酪乳杆菌(Lactobacillus casein,CGMCC 1.2884)购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。沙门氏菌为市售产品。盐酸小檗碱(BBR)和盐酸金霉素(CHH)由河南德邻生物制品有限公司提供。

[0025] MRS培养基：胰蛋白胨1.5g，酵母提取物1g，葡萄糖2g，吐温0.1mL，磷酸氢二钾0.2g，乙酸钠0.5g，硫酸锰0.005g，柠檬酸铵0.2g，硫酸镁0.02g，蒸馏水100mL；固体培养基另加2％(w/v)琼脂粉，121℃、0.15MPa高压灭菌20min。用于干酪乳杆菌的静止培养。

[0026] SS培养基(g/L)：牛肉膏5，脙胨5，胆盐3.5，琼脂17，乳糖10，柠檬酸钠8.5，硫代硫酸钠8.5，10％柠檬酸铁溶液10mL，1％中性红溶液2.5mL，0.1％煌绿溶液0.33mL，pH＝7；121℃、0.15MPa高压灭菌20min。用于沙门氏菌的培养和鉴别。

[0027] 实施例1：盐酸小檗碱和干酪乳杆菌的体外抑菌试验

[0028] 1不同浓度盐酸小檗碱对沙门氏菌生长的抑制试验

[0029] 将盐酸小檗碱配制成终浓度为0％、0.002％、0.004％和0.008％的MRS培养液，接入1％沙门氏菌，于37℃摇床中以60r/min培养，分别在8h、16h和24h取样，用SS培养基进行平板培养计数。微生物的活菌数用自然对数(lg)表示，单位是每毫升样品中所含的菌落数(CFU/mL)。结果如表1所示：

[0030] 表1不同浓度盐酸小檗碱对沙门氏菌生长的抑制作用(lg，CFU/mL)

[0031]

[0032]

[0033] 注：同列中不同小写字母表示差异显著(P<0.05),同列中相同小写字母表示差异不显著(P>0.05),下同。

[0034] 由表1可知，不同浓度BBR与沙门氏菌共培养8～16h，对沙门氏菌生长无显著抑制作用；0.004％以上的BBR与沙门氏菌共培养24h，可显著抑制沙门氏菌的生长。金霉素(CHH)对沙门氏菌生长具有显著抑制作用，并且优于盐酸小檗碱。

[0035] 2不同活菌数干酪乳杆菌对沙门氏菌生长的抑制试验

[0036] 配制活菌数分别为1×105、1×106和1×107CFU/mL的干酪乳杆菌在MRS培养液中，接入1％沙门氏菌，于37℃摇床中以60r/min培养，分别在8h、16h和24h取样，用SS培养基进行平板培养计数。结果如表2所示。

[0037] 表2不同活菌数干酪乳杆菌对沙门氏菌生长的抑制作用(lg，CFU/mL)

[0038]

[0039] 由表2可知，干酪乳杆菌(1×105～1×107CFU/mL)与150mg/kg CHH具有同样抑制沙门氏菌生长的作用。

[0040] 3盐酸小檗碱对干酪乳杆菌生长的影响试验

[0041] 配制终浓度为0.002％、0.004％和0.008％的BBR分别与活菌数为1×105、1×106和7
1×10CFU/mL的干酪乳杆菌在MRS培养液中，于37℃培养箱中静置培养，分别在12h、24h、
36h和48h取样，用MRS培养基进行平板培养计数。结果如表3所示：

[0042] 表3盐酸小檗碱对不同活菌数干酪乳杆菌生长的影响(lg，CFU/mL)

[0043]

[0044]

[0045] 由表3可知，0.002％ BBR对干酪乳杆菌生长无明显抑制作用，从而为盐酸小檗碱与干酪乳杆菌的组合奠定了基础。

[0046] 4盐酸小檗碱和干酪乳杆菌复合对沙门氏菌生长的抑制作用试验

[0047] 配制终浓度为0.002％～0.008％的BBR分别与活菌数为1×105、1×106和1×7
10CFU/mL的干酪乳杆菌进行混合，在MRS培养液中接入1％沙门氏菌，于37℃摇床中以60r/min培养，分别在8h、16h、24h取样，用SS固体培养基进行平板培养计数。结果如表4所示：

[0048] 表4盐酸小檗碱和干酪乳杆菌复合对沙门氏菌生长的抑制作用(lg，CFU/mL)[0049]

[0050] 由表4可知，0.002％～0.008％ BBR盐酸小檗碱与1×105～1×107CFU/mL干酪乳杆菌配合，可显著地抑制沙门氏菌的生长，而且随培养时间的延长，抑菌效果越好；其抑菌效6
果优于150mg/kg金霉素。从经济角度考虑，0.002％ BBR与1×10CFU/mL干酪乳杆菌组合比较合适，而且两者在抑制沙门氏菌生长方面具有叠加功效，其抑菌效果优于金霉素。

[0051] 应用例1

[0052] 1饲养试验设计

[0053] 选择1日龄健康雄性AA肉鸡180只，共分为3组，每组6个重复，每个重复10只鸡。整个饲养试验分为前期(1‑21d)和后期(22‑42d)两个阶段。采用多层笼养的饲养模式，自由采食和饮水，24h光照。免疫程序：1d鸡新城疫活疫苗，7d鸡新城疫、传支二联活疫苗，饮水免疫。试验设计及分组如下：

[0054] A组：基础日粮

[0055] B组：基础日粮+150mg/kg金霉素

[0056] C组：基础日粮+0.002％ BBR+1×106CFU/g干酪乳杆菌

[0057] 2日粮组成与营养水平

[0058] 试验基础日粮以NRC(1994)肉鸡饲养标准为依据进行配制，见表5。

[0059] 表5肉鸡日粮组成与营养水平(％)

[0060]

[0061] 注：预混料包括(每kg全价料中计)：VA 12 000IU；VD3 3000IU；VE 20IU；VK3 1.0mg；VB1 2.0mg；核黄素(VB2)6mg；烟酸(尼克酸)35mg；胆碱1.3g；泛酸钙10mg；VB6 3.5mg；
VB12 0.01mg；生物素0.15mg；叶酸1.25mg；铜(硫酸铜)8mg；铁(硫酸亚铁)100mg；锰(硫酸锰)
80mg；锌(氧化锌)60mg；碘I(碘酸钙)0.45mg；硒(亚硒酸钠)0.35mg。

[0062] 3生长性能指标的测定

[0063] 记录肉鸡初始体重、21d和42d空腹12h的体重，每天称量并记录每组重复鸡只的采食量，观察并记录每组重复鸡只的健康状况、死亡情况以及腹泻情况。计算每组重复鸡只的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)、死亡率(MR)、腹泻率(DR)。结果如表6所示：

[0064] 表6抗生素替代品对肉鸡生长性能的影响(n＝6)

[0065]

[0066]

[0067] 注：A组：空白对照组；B组：150mg/kg金霉素组；C组：0.002％ BBR+1×106CFU/g干酪乳杆菌组

[0068] 注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)，下同。

[0069] 由表6可知，与对照组相比，由盐酸小檗碱和干酪乳杆菌组合制备的抗生素替代品，使肉鸡腹泻率和死亡率分别降低了37％和80％，使肉鸡日增重和饲料效率分别提高了4％和3％；其功效优于抗生素，为抗生素的替代及畜禽健康生产奠定了基础。

[0070] 实施例2：抗生素替代品对遭受沙门氏菌感染肉鸡的保护作用

[0071] 1试验设计与分组

[0072] 肉鸡饲养试验结束后，选择50日龄的健康雄性AA肉鸡60只，共分为4组，每组5个重复，每个重复3只鸡。各组饲喂1周相应日粮后，空白对照组每组肉鸡灌喂2mL生理盐水，其余9
组肉鸡灌服2mL 2.3×10CFU/mL沙门氏菌，再继续饲养1周，试验分组如下：

[0073] A组：基础日粮(空白对照组)

[0074] B组：基础日粮(负对照组)

[0075] C组：基础日粮+150mg/kg金霉素

[0076] D组：基础日粮+0.002％ BBR+1×106CFU/mL干酪乳杆菌

[0077] 2 测定指标与方法

[0078] 2.1 生长性能指标

[0079] 在整个饲养周期内称量肉鸡的初始体重、攻毒前体重、腹泻停止时体重和试验结束后体重，每天称量并记录每组重复鸡只的采食量，观察并记录每组重复鸡只的健康状况、死亡情况以及腹泻情况。计算每组重复鸡只的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)、死亡率(MR)以及腹泻率(DR)，腹泻率(DR)＝总腹泻天数/(鸡只总数×试验天数)。结果如表7所示：

[0080] 表7抗生素替代品对沙门氏菌攻毒肉鸡生长性能的影响

[0081]

[0082] 由表7可知，负对照组(B)的日增重最低，腹泻率最高；与负对照组相比，抗生素替代组(D)的日增重显著提高15.02％，料肉比显著下降9.15％，腹泻率显著下降48.62％；而且抗生素替代组的各项指标均优于抗生素组(C)。

[0083] 2.2营养物质代谢率的测定

[0084] 采用全收粪法，收集攻毒后第4‑6d的排泄物，并记录每天的采食量和粪重。将所收集的排泄物去除杂物后充分混匀，加入10％硫酸固氮，于‑20℃保存。将饲料样和粪样于65℃烘箱中烘干至恒重并回潮24h后粉碎过40目筛备用，取样测定粗蛋白、粗脂肪、钙和磷。结果如表8所示：

[0085] 表8抗生素替代品对沙门氏菌感染肉鸡营养物质代谢率的影响(％)

[0086]

[0087] 由表8可知，负对照组(B)的粗蛋白质、粗脂肪和磷的代谢率最低；与负对照组相比，抗生素替代组(D)的粗蛋白质、粗脂肪和磷的代谢率显著提高，且高于抗生素组(C)。

[0088] 2.3血清生化指标的测定

[0089] 每组选择与平均体重接近的5只鸡进行屠宰，每只鸡进行翅静脉采血至促凝管，3000rpm离心10min，取血清分装保存于‑20℃。

[0090] 血清生化指标的测定：利用生化全自动分析仪测定血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)、葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、总蛋白、白蛋白、球蛋白、尿素氮(BUN)、c反应蛋白(CRP)。结果如表9所示：

[0091] 表9抗生素替代品对沙门氏菌感染肉鸡血清生化指标的影响

[0092]

[0093] 注：A组：空白对照组；B组：负对照组；C组：150mg/kg金霉素组；D组：0.002％ BBR+16
×10CFU/mL干酪乳杆菌组。

[0094] 注：同行数据含不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

[0095] 由表9可知，负对照组(B)肉鸡血清中天门冬氨酸转移酶、碱性磷酸酶和乳酸脱氢酶活力显著高于其余各组，预示沙门氏菌造成了肉鸡肝脏等器官的损伤，而抗生素替代品与抗生素一样具有保护组织器官免受病原微生物的危害作用。抗生素的应用显著提高肉鸡血清中白蛋白含量，降低球蛋白及白蛋白/球蛋白比值，说明抗生素的应用扰乱了肉鸡的免疫系统。负对照组肉鸡血清中尿素氮含量显著其余各组，说明蛋白质的代谢受到了沙门氏菌的影响，这与低蛋白质的代谢率相一致。负对照组肉鸡血清中C反应蛋白含量显著高于其他组，说明沙门氏菌导致了机体炎症反应，而抗生素及抗生素替代品具有降低沙门氏菌引起的炎症反应。

[0096] 抗氧化和免疫指标的测定：肉鸡血清中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH‑Px)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化力(T‑AOC)、丙二醛(MDA)及免疫指标(IgA、IgG、IgM)的含量，采用上海酶联生物科技有限公司(中国上海)的ELISA试剂盒进行测定。结果如表10、表11所示：

[0097] 表10抗生素替代品对沙门氏菌感染肉鸡血清抗氧化指标的影响

[0098]

[0099] 注：A组：空白对照组；B组：负对照组；C组：150mg/kg金霉素组；D组：0.002％ BBR+16
×10CFU/mL干酪乳杆菌组。

[0100] 注：同列数据含不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)，下同。

[0101] 表11抗生素替代品对沙门氏菌感染肉鸡血清免疫指标的影响(μg/mL)[0102]

[0103] 注：A组：空白对照组；B组：负对照组；C组：150mg/kg金霉素组；D组：0.002％ BBR+16
×10CFU/mL干酪乳杆菌组。

[0104] 表10和表11结果表明，沙门氏菌感染肉鸡可降低其血清抗氧化指标及IgG和IgM的含量，而抗生素及抗生素替代品的添加可提高血清抗氧化指标和免疫参数。

[0105] 2.4空肠组织形态的测定

[0106] 空肠取中段约2cm，用生理盐水冲洗干净后置于10％的福尔马林固定液中固定，用于组织切片的制作。经过石蜡包埋、切片脱蜡、苏木素染色、水洗、脱水、封固过程，空肠形态学分析在光学显微镜下进行，并计算绒毛长度和隐窝深度。结果如图1所示，由图1可知，沙门氏菌感染肉鸡的空肠组织粘膜出现损伤(B组)，抗生素(C组)及抗生素替代品(D组)具有减缓沙门氏菌对肉鸡空肠组织粘膜损伤的功能。

[0107] 由上可知：由盐酸小檗碱和干酪乳杆菌组合制备的抗生素替代品，具有较好的抑制沙门氏菌生长及缓解其对肉鸡肠道损伤的功能，可降低肉鸡腹泻率和死亡率，提高日增重和饲料效率，提高机体抗氧化特性和免疫力，其功效优于抗生素，为抗生素的替代及畜禽健康生产奠定了基础。

[0108] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。