[0001] 本发明属于冻存剂领域，具体涉及一种多肽基冻存保护剂及其制备方法和应用。

[0002] 冠状动脉疾病在发达国家中已成为主要的发病和死亡原因。根据统计数据，全球心血管疾病的死亡率预计将从2012年的1750万人增加至2030年的2220万人。当前治疗心血管疾病的黄金标准是自体血管移植，但由于自体血管供体的稀缺性以及手术对供体的潜在损伤，异体血管移植成为了一种不可或缺的选择。然而，异体血管的保存面临着显著挑战。供体血管通常需要在4℃条件下保存，但即使在此低温下，细胞的代谢活性仍然存在约10％的正常水平。这种代谢活性的残留会导致大量代谢废物的产生，从而对血管内皮、血小板以及白细胞的粘附产生广泛的初始破坏。此种破坏会引起内皮剥蚀和功能障碍，从而影响血管的长期功能。因此，开发和研究有效的长期保存技术对于改善异体血管移植的临床应用至关重要。

[0003] 冷冻保存技术通过减缓甚至暂停生理代谢来实现组织的长期保存，避免变质。传统的冷冻保存方法通常采用慢速降温(降温速率约为1℃/min)至深低温，以实现组织的保存。同时，低浓度的保护剂被添加以抑制冰晶的过度生长，从而保护细胞和组织结构。然而，这种方法不可避免地导致冰晶损伤，从而对细胞和组织造成不可逆的损害。

[0004] 与此相比，玻璃化保存技术通过形成无定形的冰，避免了冰晶的形成，从而避免了冰晶损伤。目前，玻璃化保存被认为是成功冷冻保存器官的最有希望的方法。然而，实现玻7
璃化状态通常需要高达10 ℃/min的降温速率，这对于组织和器官的冷冻保存来说是不现实的。

[0005] 因此，通常需要添加高浓度的冷冻保护剂(CPAs)，以降低实现玻璃化所需的降温速率。例如，高浓度的CPAs(如6.4M的二甲基亚砜(DMSO)、6.5M的甘油(G ly)、6.0M的DP6以及8.4M的VS55)能够有效抑制冰晶形成，但同时也带来了新的挑战。传统的冷冻保护剂如DMSO和甘油可能会引起较大的毒性和难以洗脱的问题，而高浓度的CPAs使用则会加剧这些问题。因此，开发低浓度且具有良好生物安全性的玻璃化冷冻保护剂成为当前研究的关键方向。

[0039] 为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。

[0040] 实施例1：纳米粒子与玻璃化冻存保护剂的制备与浓度选择

[0041] 磁性纳米粒子溶液的制备：

[0042] 1)采用共沉淀法制备Fe3O4纳米粒子。具体来说，在氮气保护中将4.9gFeC l 3·6H2O溶解于去离子水中，加入2.1g FeC l 2·4H2O搅拌溶解，缓慢滴加8mL浓氨水后加热至
70℃反应1小时，随后用乙醇与去离子水反复清洗3次。

[0043] 2)阿拉伯胶包覆的Fe3O4磁性纳米粒子的制备：将0.6g Fe3O4纳米粒子加入到300g 10％阿拉伯树胶溶液中，机械搅拌20分钟后用去离子水洗3次，得到阿拉伯胶包覆的Fe3O4磁性纳米粒子(GA‑MNPs)。图2所示粒径约为100nm。

[0044] 将阿拉伯树胶包覆的Fe3O4磁性纳米粒子分散与PBS溶液中，配备成5 mg/mL（图3a中的Nanowarming‑1）、10 mg/mL（Nanowarming‑2）、20 mg/mL（Nanowarming‑3）、30 mg/mL（Nanowarming‑4）溶液。

[0045] 如图3所示将上述溶液加入离心管中通过液氮降温后置于磁感应线圈中加热，同时用温度传感器进行测量溶液的温度变化，溶液的复温速率随着纳米粒子的浓度增加而增加，当纳米粒子浓度为20mg/mL时，复温速率为14.2℃/s，比对流再暖(37℃水浴加热)提高了446％，综合考虑纳米粒子的含量与复温速率，选择20mg/mL为纳米粒子的使用浓度。

[0046] 冻存保护剂的制备：依次将甜菜碱、海藻糖、多肽冰阻剂溶解于PBS缓冲液中，溶解均匀后加入上述磁性纳米粒子，使纳米粒子的浓度为20mg/mL；

[0047] 将600mg甜菜碱溶解于PBS溶液中(60B)，分别将300mg、400mg、450mg甜菜碱与50mg海藻糖依次分别溶解于PBS缓冲溶液中，溶液总质量为1g，分别配置成30B+5T,40B+5T,45B+5T溶液；将400mg甜菜碱、50mg海藻糖与5mg聚谷氨酸依次溶解于545mg PBS缓冲溶液中，配置成40B+5T+0.5PG l u(3.6M)溶液。

[0048] 如图4所示将上述溶液加入离心管中通过液氮降温后置于磁感应线圈中加热，同时用温度传感器进行测量溶液的温度变化，发现纯甜菜碱浓度达到60％时，能成功玻璃化，纯海藻糖溶解性较低而无法成功玻璃化；

[0049] 当甜菜碱与海藻糖混合后，溶液浓度较低时(如40B+5T)升温曲线出现折点，说明有冰晶的形成，当浓度增加到45％甜菜碱与5％海藻糖(45B+5T)时溶液能够成功玻璃化，说明最低浓度为45％甜菜碱与5％海藻糖组合；

[0050] 而当加入0.5％聚谷氨酸时，能降低玻璃化溶液浓度为40％甜菜碱和5％海藻糖组合(40B+5T+0.5PG l u)。

[0051] 为研究其他水溶性多肽对该体系降低玻璃化浓度的影响，以40B+5T(BT)为基础保护剂依次分别加入5mg聚赖氨酸(PLys)、聚天冬氨酸(PAsn)、聚丝氨酸(PSer)和聚脯氨酸(PPro)。如图5所示将上述溶液加入离心管中通过液氮降温后置于磁感应线圈中加热，同时用温度传感器进行测量溶液的温度变化，发现仅有BT+PG l u溶液在复温阶段曲线平滑，未出现脱玻璃化行为。

[0052] 为探究聚谷氨酸的聚合度对体系玻璃化能力的影响，以40B+5T(BT)为基础保护剂依次分别加入5mg聚合度为5的聚谷氨酸、聚合度为10的聚谷氨酸、聚合度为15的聚谷氨酸、聚合度为20的聚谷氨酸，分别配置成BT+PG l u5、BT+PG l u10、BT+PG l u15和BT+PG l u20溶液。如图6所示将上述溶液加入离心管中通过液氮降温后置于磁感应线圈中加热，同时用温度传感器进行测量溶液的温度变化，发现当聚合度浓度在5‑15之间时均能使BT溶液玻璃化，综合考虑合成的成本，选取聚合度为5的聚谷氨酸溶液，最终得到最低浓度为3.6M(总摩尔浓度)的玻璃化溶液(BTP)。

[0053] 实施例2：该玻璃化冷冻保护剂的冻存及复温程序设定

[0054] 为了设定合适的降温与升温程序，对上述低浓度玻璃化冻存保护剂的临界降温速率与临界升温速率进行研究，通过差示扫描量热仪分别对不同降温速率与升温速率下上述低浓度玻璃化冻存保护剂的热流进行分析，降温速率分别为0.2℃/min、1℃/min、5℃/min、10℃/min、20℃/min与40℃/min；通过对DSC曲线中热流峰面积拟合，绘制出冰含量(q)与降温速率曲线，其符合Boutron曲线模型。升温速率分别为5℃/min、10℃/min、20℃/min、40℃/min与80℃/min；通过对DSC曲线中熔点(Tm)与脱玻璃化温度(Td)分析，绘制出Tm‑Td与升温速率的关系，其符合线性关系。

[0055] 如图7所示，根据Boutron方法，当冰含量小于0.2％时，认为溶液玻璃化可以玻璃化，此时的降温速率为临界降温速率，上述玻璃化冻存保护剂的临界降温速率为11.02℃/min；对于升温阶段认为冰含量小于0.5％时，脱玻璃化行为可以忽略，此时上述玻璃化冻存保护剂的临界升温速率为202.24℃/min。

[0056] 为了减轻冻存过程中由于快速降温热梯度过大带来的热应力问题，选择以大于该保护剂临界降温速率的程序降温，优化的，降温速率为30℃/min，当溶液降温至‑120℃时，保持20min进行退火，随后继续降温至‑150℃/min，最后在液氮中冷冻保存。

[0057] 将上述低浓度玻璃化冻存保护剂放置于50mL离心管中，以上述降温程序进行降温，随后使用磁热复温的方式，对其扩大体积后的温度变化进行测试。如图8，发现扩大体积为50mL后，该溶液仍能成功玻璃化，且升温速率为262.4℃/min，超过了其临界升温速率。

[0058] 实施例3：血管的玻璃化冷冻保存

[0059] 将血管浸没于以实施例1中低浓度玻璃化冻存保护剂中，对保护剂的渗透能力进行测试，如图9所示，当平衡时间为20min时，保护剂的加载浓度超过90％，因此选择20min为保护剂梯度加载周期。

[0060] 使用实施例1中低浓度玻璃化冻存保护剂对血管的玻璃化冻存保护策略：将血管依次置于浓度分别为1.2M、2.4M、3.6M的玻璃化冻存保护剂中，分别平衡20min；加载完成后将含有血管的冻存管利用程序控温仪进行降温，在4℃平衡10min后，以30℃/min速率降温至‑120℃，退火20min后，降温至‑150℃，最后放置于液氮罐中冷冻保存。待冻存结束后，将装有血管的冻存管迅速放入磁感应线圈中进行磁热复温，待溶液温度升高至0℃后取出。

[0061] 对比例1：血管在PBS溶液中的冷冻保存：将血管放置于含有30mL PBS溶液的冻存管中，使用上述冻存程序进行冻存后，采用对流加热的方式复温，具体地，将装有血管的冻存管放置于37℃水浴中加热。

[0062] 对比例2：常用玻璃化冻存保护VS55对血管的冷冻保存：VS55由3.1M DMSO、3.1M甲酰胺和2.2M 1,2‑丙二醇组成。将血管置于VS55溶液中，使用上述冻存程序进行冻存后，采用对流加热的方式复温。

[0063] 以实施例1中玻璃化冻存保护剂的血管解冻步骤：

[0064] 将含有血管的冻存管复温后依次转移至浓度为2.4M、1.2M、0.6M(总摩尔浓度)溶液中分别平衡20min后，用PBS溶液清清洗后得到血管。

[0065] 血管的玻璃化冻存保护结果检测与分析。

[0066] 1、将玻璃化冷冻保存1周和2个月并复温后的血管进行以下功能检测

[0067] (1)组织形态学检测：对实施例3中获得的血管样本进行裁剪后，采用苏木精‑伊红(H&E)和胶原纤维‑弹力纤维复合(EVG)染色方法进行处理，按照试剂盒的说明操作。这些染色技术用于分析冻存后血管组织的密度和形态变化，以评估其组织结构的完整性。

[0068] (2)纤维与糖胺聚糖含量检测：通过使用羟脯氨酸(HYP)试剂盒、羟赖氨酰吡啶啉(HP)试剂盒、赖氨酰吡啶啉(LP)试剂盒及糖胺聚糖(GAGs)试剂盒对冻存血管进行分析。按照试剂盒说明书的方法，分别测量血管样本中的羟脯氨酸、羟基赖氨酰吡啶啉、赖氨酰吡啶啉以及糖胺聚糖的含量，以评估胶原纤维及糖胺聚糖的含量变化。

[0069] (3)生物力学性能检测：使用万能试验机对血管的生物力学特性进行测定。首先，采用哑铃型裁刀对血管样本进行切割。将标距设置为1cm，并将血管样本夹紧于测试仪器的夹具中，然后以10mm/min的速率进行单轴拉伸实验，直到血管样本断裂。通过分析拉伸应力‑应变曲线，确定断裂伸长率，并通过计算曲线的线性区域的斜率来得到杨氏模量。

[0070] (4)收缩张力的评估：通过将不同的激动剂和拮抗剂加入器官浴液中来评估血管的等长收缩和松弛反应，并使用通用万能试验机记录测量数据。血管样本先施加0.01N的预‑8 ‑4加载张力，并使其稳定在基线。通过逐步施加去甲肾上腺素(剂量范围从10 M到10 M)，诱‑5
导血管收缩。为了评估血管的松弛反应，首先使用10 M的去甲肾上腺素将血管预收缩至稳‑4 ‑4
定水平。随后，使用10 M的硝普钠和10 M的乙酰胆碱分别评估血管的非内皮依赖性松弛(non‑EDR)和内皮依赖性松弛(EDR)反应。

[0071] 2、结果分析

[0072] (1)图10示出血管冻存后的H&E染色、EVG染色及纤维含量结果，表明使用低浓度该配方玻璃化冻存1周后的血管组织与新鲜组织相比，结构形态变化较小，并且显著优于使用常规玻璃化冻存保护剂VS55。相反，对流加热组血管样品显示出明显的纤维断裂、细胞核泄露及组织间隙增多，羟赖氨酰吡啶啉和赖氨酰吡啶啉含量增多，表明胶原蛋白的三螺旋链发生了更多的交联，从而导致胶原蛋白变性，这可能由于冰晶的形成所致。即使冻存时间延长至2个月，使用该配方的样品仍保留了92.1％的组织致密度，并且保留了相似比例的胶原蛋白和糖胺聚糖，显示出优良的冻存效果。

[0073] (2)图11示出血管冻存后的生物力学性能结果，结果显示，使用此BTP玻璃化冻存1周或2个月后，血管的断裂伸长率和杨氏模量仍与新鲜组无显著差异。而使用常用玻璃化冻存保护剂VS55处理的血管在冻存2个月后，断裂伸长率显著降低，同时杨氏模量明显升高，表明血管硬度增加，弹性显著下降。

[0074] (3)图12示出血管冻存后是收缩与舒张能力，结果显示，随着去甲肾上腺素浓度的增加，血管的收缩程度也随之增强。对照组由于冰晶对平滑肌细胞的损害，其收缩反应显著降低。而使用BTP玻璃化冻存保护剂处理的血管，即使冻存2个月，仍能保持良好的收缩能力。此外，我们使用非内皮性平滑肌松弛剂硝普钠和内皮性平滑肌松弛剂乙酰胆碱评估血管的舒张能力。结果显示，BTP组在冻存2个月后的血管最大舒张能力分别达到新鲜组的87％和79％，表现出较高的敏感性和功能保留。

[0075] 综上所述，本发明为了解决现有玻璃化冻存保护剂浓度高、毒性大的问题，我们开发了一种新型的生物相容性低浓度玻璃化冷冻保护剂(CPA)配方，用于血管的冷冻保存。该配方基于聚谷氨酸的优良水合作用，能够有效扰乱水分子形成冰晶，从而成功将玻璃化保护剂的浓度降低至3.6M。为提高复温效率避免脱玻璃化，我们设计了一种具有良好生物相容性的磁性纳米粒子(GA‑MNPs)，该纳米粒子不仅提升了升温速率，还有效降低了升温过程中的热应力，从而显著提升了血管的复温效果。采用这一玻璃化冷冻保存策略，我们成功地将血管冷冻保存了2个月，复温后保留了血管的结构完整性、生物力学性能和良好的收缩与舒张能力。本发明首次通过多肽实现了浓度低至3.6M的玻璃化冻存保护剂并应用于血管的玻璃化保存，这一低浓度玻璃化保存策略有望进一步优化，以实现更广泛的生物组织和器官的冷冻保存，推动相关领域的研究和临床应用。

[0076] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。