[0001] 本发明涉及一种以PET水解液为原料高产PET降解酶的基因工程菌及应用，属于微生物工程技术领域。

[0002] 聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)是塑料的一种，因其具有高机械强度、低透气性、重量轻、成本价格低等优点，目前已在全世界范围内得到了广泛的应用。大量PET废弃物在自然状态下难以降解，导致PET在全球生态体系中积累使得土地营养成分流失土壤板结，并且大量漂流在海洋上的塑料会对海洋生态系统造成不利影响。

[0003] 据统计，全球瓶级PET的产量由2014年的1976万吨跃至2022年的3021万吨，PET全球需求的不断增长和对环境的持续负面影响，使PET塑料的积累成为了一个日益关注的问题，因此急需开拓新技术实现塑料的循环经济。

[0004] 生物循环通过微生物解聚是目前研究的热点方法，是目前认为最有前景的降解方案，利用微生物或酶进行降解，产生含对苯二甲酸(TPA)和乙二醇(EG)的水解液。其中，TPA单体可经碱溶酸沉获得，工艺简单、成本低。而水解液中的EG则需要精馏获得，分离成本高。因此，残留在PET水解液中的EG的高值化研究逐渐受到关注，如果能实现以PET水解液为原料获得高附加值的产品，将会产生巨大的经济和社会效益。目前，将EG作为微生物的发酵原料仍然存在难点，能有效进行EG代谢的工程菌较少，若能开发高效利用残留PET水解液中EG作为碳源用于PET降解酶等重组蛋白的表达的工程菌株，则可实现PET‑EG的连续进行。不仅能降低纯化单体产物的成本，也使PET降解物的利用进一步提高。

[0049] 本文中所用术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”的含义为“包含但不限于”、“包括但不限于”、“具有但不限于”、“含有但不限于”，并且可与相应的短语进行互换使用。除非上下文另有明确说明，否则本文中所用术语“或”在本文中用于意指术语“和/或”，并且可与其互换使用。除非另有解释，否则本文所用所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域技术人员通常所了解的相同的意义。尽管在本发明的实践或测试中可使用与本文所述方法和材料类似或等效的方法和材料，但下文阐述适宜的方法、材料实例仅具有说明性而并不对本发明进行任何的限定。

[0050] 本发明构建了可在微生物细胞(尤其是大肠杆菌或枯草芽孢杆菌)中代谢EG产PETase的重组表达质粒pCDFDuet‑1_FucO‑AldA‑BhrPETase。

[0051] 具体而言，所述pCDFDuet‑1_FucO‑AldA‑BhrPETase表达质粒的核心单元从5’到3’方向构建顺序为：组成型启动子(Ptrc)+蛋白翻译RBS序列(RBS)+EG代谢转基因FucO和AldA+PET降解酶BhrPETase+蛋白表达终止子(Teminator_1)。

[0052] 在上述重组表达质粒中，组成型启动子(Ptrc)还可替换为Ptac或PT7。

[0053] 在上述重组表达质粒中，蛋白表达终止子可选自SEQ ID NO.5所示的Teminator_1、SEQ IDNO.6所示的Teminator_2或SEQ ID NO.7所示的Teminator_3，在不做特别说明的情况下，上述终止子构建的重组表达质粒具有相当水平的表达效果。

[0054] 进一步，将所述重组质粒pCDFDuet‑1_FucO‑AldA‑BhrPETase导入宿主细胞中，即获得能够利用PET水解液产PET降解酶的重组微生物细胞。

[0055] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下结合具体实施例对本发明进行一步描述，以便更好理解本发明，但本发明的保护范围并不仅限定于以下描述。

[0056] (一)试剂

[0057] 下述实施例中涉及的乙二醇(EG)购自Sigma公司。下述实施例中涉及的PCR酶购自宝日医生物技术有限公司。下述实施例中涉及的基因测序由金唯智生物科技有限公司承担。下述实施例中涉及的乙二醇(EG)、对硝基苯丁酸酯(pNPB)购自Sigma公司。下述实施例中涉及的大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)、枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis ATCC 6051a。

[0058] (二)培养基配方(g/L)：

[0059] LB液体培养基：蛋白胨10，分子级酵母粉5，NaCl 10。

[0060] LB固体培养基：每100mL LB液体培养基中加入1.5～2.0g琼脂。

[0061] M9培养基：Na2HPO4 6.78，KH2PO4 3.0，NaCl 0.5，NH4Cl 1.0，MgSO4 7H2O 0.493，CaCl20.011。

[0062] (三)检测方法

[0063] EG浓度测定：

[0064] 标准品处理：称取EG的标准品溶于ddH2O中制成母液，利用无菌水将母液稀释成0.1mg/mL标准品溶液，用0.22μM的滤头过滤，用注射器注入液相瓶进行HPLC检测。以EG浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制EG的标准曲线。

[0065] 样品处理：取1mL培养液12000rpm离心5min，用0.22μM的滤头过滤，用注射器注入液相瓶，进行HPLC检测。具体检测方法为：Agilent 1260高效液相色谱仪，折光率检测器(RID)，使用Aminex柱(HPX‑87H,300×7.8mm,Bio‑Rad)；高效液相色谱条件：流动相：5mM硫酸；流速0.6mL/min；进样量5μL，柱温60℃。

[0066] EG利用度的计算：

[0067] EG利用度＝([(C0‑C1)/C0]*100％；

[0068] C0::反应前的溶液中乙二醇的含量(mg/mL).C1:反应后的溶液中乙二醇的含量(mg/mL)。

[0069] PET降解酶活力测定

[0070] 1、对硝基苯酚pNP标准曲线的绘制：

[0071] 称取适量对硝基苯酚，用10mM pH 8.0KH2PO4‑K2HPO4缓冲液定容至1000mL，配制成100μmol/L的对硝基苯酚母液，再用KH2PO4‑K2HPO4缓冲液稀释至0、20、40、60、80、100μmol/L。测定波长为405nm时的吸光值，以对硝基苯酚浓度C为横坐标，吸光值A为纵坐标，绘制标准曲线A＝a*C+b。

[0072] 2、酶活测定底物的配制：

[0073] 准确称取适量的对硝基苯丁酸酯(pNPB，Sigma，CAS2635‑84‑9)，用乙腈定容，配制‑1成浓度为50mmol·L 的pNPB溶液。

[0074] 3、待测酶液制备：

[0075] 发酵液在8000rpm和4℃下离心15分钟后，收获上清液。经硫酸铵沉淀步骤，随后用10mMpH 8.0KH2PO4‑K2HPO4缓冲液进行复溶，置于60℃，温浴1h热处理后，于8000rpm的条件下离心15min去除杂蛋白，获得纯化后的酶液。取纯化酶液进行适当稀释，稀释倍数以控制在A值在0.2‑0.8为宜。在37℃下测定PET降解酶酶活。取1.5ml KH2PO4‑K2HPO4缓冲液至
0.5cm玻璃比色皿中，在吸收波长405nm处调零。取提前预热10mM pH 8.0KH2PO4‑K2HPO4缓冲液1.44mL至石英比色皿中，用移液枪移取30μL待测稀释样品，加入上述石英比色皿中，然后加入30μL底物溶液，摇匀后立即放入可见分光光度计中，在吸收波长405nm处测A值。每隔5秒钟记录一次A值，反应时间为1分钟。酶活定义：单位时间内催化底物生成1μmol pNP需要的酶量定义为一个酶活力单位。

[0076] 计算：

[0077] 酶活力(U/mL)＝[[(K‑b)V1]/[a V2×1000]]×N；

[0078] 式中：K：酶反应所测不同时间A值和时间(min)所呈曲线的斜率；

[0079] V1：反应体积(mL)；

[0080] V2：加酶量(mL)；

[0081] N：稀释倍数。

[0082] PET降解酶产量的测定：

[0083] 将发酵液在4℃、8000rpm离心15分钟后，收获上清液。经80％(w/v)硫酸铵沉淀步骤，随后用10mM pH 8.0KH2PO4‑K2HPO4缓冲液进行复溶，置于60℃，温浴1h热处理后，于8000rpm的条件下离心15min去除杂蛋白，获得纯化后的酶液。使用Bradford检测试剂盒(P0006,碧云天,中国上海)测量蛋白质浓度。

[0084] 重组菌菌浓测定

[0085] 首先使用蒸馏水作为空白对照，将分光光度计调整至零位。取一定体积的发酵液进行适当稀释，以确保菌液在分光光度计的检测范围内。将适当稀释的发酵液移至1cm比色皿，将其放入分光光度计中，于600nm处测定样品的吸光值，用OD600值估计重组菌体浓度。

[0086] 实施例1PET水解液的制备

[0087] 参照发明人团队前期的研究成果，按照论文《Directional‑path modification strategyenhances PET hydrolase catalysis of plastic degradation》的方法制备PET降解酶(4Mz)的酶蛋白。在3L反应器中加入1L 100mM pH 8的磷酸钾缓冲液、200g PET粉末与0.2g 4Mz酶蛋白，于60℃、200rpm条件下反应96h。在反应过程中，用6M NaOH维持pH值8。反应液过滤除杂质，获得PET水解液并加100mM pH 8的磷酸钾缓冲液稀释，获得不同稀释倍数的PET水解液(表1)。

[0088] 表1不同稀释倍数的PET水解液

[0089]

[0090] 实施例2去除TPA后的残留PET水解液制备

[0091] 参照实施例1所述方法获得PET水解液。向1L PET水解液加入6M NaOH溶液，调节PET水解液体系pH＝9.0，使PET水解液中的TPA溶解在碱溶液中，随后过滤除杂质，获得上清液。在向上清液中滴加6M HCl溶液，逐步调节到pH＝4.0，使TPA在酸性环境下重新沉淀，静置过夜。离心过滤，弃沉淀物，将上清液pH调回7.0，即为仅含有EG的残留PET水解液。随后加100mM pH 8的磷酸钾缓冲液稀释，获得不同稀释倍数的残留PET水解液(表2)。

[0092] 表2不同稀释倍数的残留PET水解液

[0093]

[0094] 实施例3大肠杆菌BL21的感受态的制备

[0095] 感受态溶液A：1.47g醋酸钾、4.44g氯化钙定容于500mL的去离子水里，用1M的醋酸(冰乙酸)调PH至5.8

[0096] 感受态溶液B：1.47g醋酸钾、4.44g氯化钙75mL、甘油定容于500mL的去离子水里，用1M的醋酸(冰乙酸)调pH至5.8。

[0097] 感受态制备方法如下：

[0098] (1)将大肠杆菌BL21感受态菌株从甘油管中划线到无抗平板，37℃培养10.5h。

[0099] (2)挑取上述划线平板上的单菌落到10mL的LB培养基中，37℃，200r/min培养10h。

[0100] (3)以1％的转接量接种到50mL LB培养基中培养，37℃，200r/min培养2‑2.5小时。

[0101] (4)上述发酵液置于冰中冷却30min，转移到两个预冷过的50mL离心管中，4℃，3500r/min离心10min，弃上清。

[0102] (5)取适量感受态A液(提前预冷)缓慢吹洗重悬菌体，冰浴30min，随后3500r/min 4℃离心10min，弃上清。

[0103] (6)重复步骤(5)一次。

[0104] (7)根据需要加入适量B液，缓慢悬浮菌体，使用预冷过的枪头吸取0.1mL菌体到预冷过的1.5mL EP管中，置于‑80℃于保存。

[0105] 实施例4高产PET降解酶的重组菌构建及验证

[0106] 以Escherichia coli MG1655DE3菌株基因组为模版，克隆fucO基因(核苷酸序列如SEQID NO.2所示)和aldA基因(SEQ ID NO.3所示)，并将其构建在pACYCDuet‑1载体上，同时将BhrPETase基因(SEQ ID NO.4所示)连接到该质粒上，获得含有“PgyrA+RBS+FucO+AldA+BhrPETase+终止子Terminator_1”所示结构的表达框pACYADuet‑1_FucO‑aldA‑BhrPETase。

[0107] 具体结构描述如下：

[0108] (1)PgyrA：组成型启动子，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

[0109] (2)RBS：蛋白翻译RBS序列，核苷酸序列为tttgtttaactttaagaaggaga(SEQ ID NO.11)；

[0110] (3)FucO和AldAEG到乙醇酸途径基因，fucO和aldA基因来源于Escherichia coliMG1655，FucO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，AldA基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；

[0111] (4)BhrPETase：降解酶合成基因，BhrPETase基因来源于细菌HR29，BhrPETase基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

[0112] (6)Teminator_1：蛋白表达终止子，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

[0113] 进一步，用电转化法将重组质粒导入大肠杆菌BL21，经过氯霉素抗性筛选、菌落PCR验证、测序符合，得到大肠杆菌工程菌BL21_pACYADuet‑1_FucO‑aldA‑BhrPETase。

[0114] 将构建的大肠杆菌工程菌BL21_pACYADuet‑1_FucO‑aldA‑BhrPETase接种至LB液体种子培养基，于30℃培养6‑12h，4000r/min、4℃离心10min收集工程菌菌体。按2wt％接种量接种至转化液中进行培养(使接种后的菌体OD达0.95±0.5)，所述转化液为含5mg/mL EG的M9培养基。发酵过程中pH控制在7.0，温度30℃，150rpm，发酵72h。以仅含PETase表达框(PgyrA+RBS+BhrPETase+终止子Terminator_1)的重组质粒pACYADuet‑1_PETase转化大肠杆菌构建的重组菌BL21_pACYADuet‑1_BhrPETase为对照菌。结果如图1～4所示，重组菌BL21_pACYADuet‑1_FucO‑aldA‑BhrPETase对EG的利用度远高于对照菌。72h后，重组菌培养液中残留EG含量为1.3mg/mL；48h后，重组菌密度(OD600)可达4.3；72h后，重组菌产的PET降解酶活力最高，约105U/mL、产量为0.59mg/mL。

[0115] 实施例5不同EG浓度对重组菌产PET降解酶的影响

[0116] 将实施例4构建的重组菌大肠杆菌BL21_pACYADuet‑1_FucO‑aldA‑BhrPETase接种至LB液体种子培养基中，于30℃培养6‑12h，4000r/min、4℃离心10min收集工程菌菌体。按2wt％接种量接种至含有不同浓度EG(1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、40mg/mL、60mg/mL、100mg/mL)的M9培养基中进行培养(使接种后的菌体OD达0.95±0.5)。发酵过程中pH控制在7.0，温度30℃，发酵48h。结果如表3所示，随着EG浓度上升，重组菌密度、降解酶活力与产量先上升再下降。当EG浓度达到20mg/mL时，降解酶活力与产量最高，分别为119.6U/mL与
0.67mg/mL。

[0117] 表3不同EG浓度对工程化大肠杆菌生产降解酶的影响

[0118]

[0119] 实施例6不同温度对工程化大肠杆菌生产PET降解酶的影响

[0120] 将实施例5构建的重组菌BL21_pACYADuet‑1_FucO‑aldA‑BhrPETase接种至LB液体培养基中，于30℃培养6‑12h，4000r/min、4℃离心10min收集工程菌菌体。按2wt％接种量接种至含有20mg/mL EG的M9培养基中(使接种后的菌浓达OD600＝1.0)进行培养。发酵过程中pH控制在7.0，不同温度(15℃、25℃、30℃、35℃、40℃)，发酵48h。结果如表4所示，随着反应温度上升，重组菌密度、降解酶活力与产量先上升后略有下降。当温度达到25℃时，降解酶活力与产量最高，分别为129.3U/mL与0.72mg/mL。

[0121] 表4不同温度对重组大肠杆菌产PET降解酶的影响

[0122]

[0123]

[0124] 实施例7不同接种量对工程化大肠杆菌生产PET降解酶的影响

[0125] 将实施例5构建的重组菌BL21_pACYADuet‑1_FucO‑aldA‑BhrPETase接种至LB液体种子培养基培养6‑12h，4000r/min、4℃离心10min收集工程菌菌体。按不同接种量(1wt％、2wt％、4wt％、6wt％、8wt％、10wt％、12wt％)接种至含有20mg/mL EG的M9培养基中进行培养，使对应的OD600分别为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0。发酵过程中pH控制在7.0，于25℃发酵48h。结果如表5所示，随着接种量的上升，重组菌密度、降解酶活力与产量逐渐上升并保持不变。当接种量为8wt％时，降解酶活力与产量最高，分别为161.0U/mL与0.89mg/mL。

[0126] 表5不同接种量对重组大肠杆菌产PET降解酶的影响

[0127]

[0128] 实施例8重组大肠杆菌利用PET水解液生产PET降解酶

[0129] 将实施例5构建的重组菌BL21_pACYADuet‑1_FucO‑aldA‑BhrPETase接种至LB液体种子培养基，于30℃培养6‑12h，4000r/min、4℃离心10min收集工程菌菌体。按6wt％接种量分别接种至按照实施例1的方法制备的PET水解液，和按照实施例2的方法制备的去除TPA的残留PET水解液中进行培养。发酵过程中pH控制在7.0，温度25℃，发酵48h。结果如表6所示，重组菌对去除TPA的残留PET水解液的利用度远高于PET水解液。以PET水解液为原料时，重组菌在×15PET水解液中降解酶活力可达51.2U/mL，PET降解酶产量为0.28mg/mL。以残留PET水解液为原料时，重组菌在×10残留PET水解液中降解酶活力可达109.7U/mL，PET降解酶产量为0.60mg/mL。

[0130] 表6重组大肠杆菌产PET降解酶分析

[0131]

[0132]

[0133] 实施例9不同PET降解酶表达框导入大肠杆菌中的测试

[0134] 按照实施例4的方法构建不同PET降解酶的表达框，区别在于，将实施例4中重组质粒pACYADuet‑1_FucO‑aldA‑BhrPETase中的BhrPETase基因分别替换成FastPETase基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)、DuraPETase基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)、4Mz基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)，分别获得重组质粒pACYADuet‑1_FucO‑aldA‑FastPETase、pACYADuet‑1_FucO‑aldA‑DuraPETase、pACYADuet‑1_FucO‑aldA‑4Mz。

[0135] 用实施例4中的转化法将上述重组质粒导入大肠杆菌，BL21_pACYADuet‑1_FucO‑aldA‑FastPETase、BL21_pACYADuet‑1_FucO‑aldA‑DuraPETase、BL21_pACYADuet‑1_FucO‑aldA‑4Mz。上述重组菌接种至LB液体种子培养基，于30℃培养6‑12h，4000r/min、4℃离心10min收集工程菌菌体。按6wt％接种量接种至×10残留PET水解液中进行培养。发酵过程中pH控制在7.0，温度25℃，发酵48h。结果如表7所示，重组菌可利用PET水降解液产PET降解酶。重组菌产生104.8U/mL(0.57mg/mL)的FastPETase、112.1U/mL(0.61mg/mL)的
DuraPETase、124.3U/mL(0.68mg/mL)的4Mz。

[0136] 表7重组大肠杆菌产不同类型PET降解酶的情况

[0137]

[0138] 实施例10表达框导入枯草芽孢杆菌中用于生产PET降解酶

[0139] 将实施例4构建的重组质粒pACYADuet‑1_FucO‑aldA‑BhrPETase用电转化法将其导入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ATCC 6051a(菌株公开于论文《Multigene disruption inundomesticated Bacillus subtilis ATCC 6051a using the CRISPR/Cas9》)，构建重组菌B.subtilis_pACYADuet‑1_FucO‑aldA‑BhrPETase，经过氯霉素抗性筛选、菌落PCR验证、测序符合，得到枯草芽孢杆菌工程菌。将构建的枯草芽孢杆菌工程菌接入LB液体培养基培养6‑12h，4000r/min、4℃离心10min收集工程菌菌体。按6wt％接种量接入不同培养基中进行培养。发酵过程中pH控制在7.0，25℃温度，发酵48h。结果如表8所示，枯草芽孢杆菌工程菌在20mg/mL EG M9培养基中发酵48h，BhrPETase降解酶活力约135.3U/mL、产量为0.71mg/mL；枯草芽孢杆菌工程菌在×15PET水解液中发酵48h，BhrPETase降解酶活力约66.0U/mL、产量为0.34mg/mL；枯草芽孢杆菌工程菌在×10残留PET水解液中发酵48h，BhrPETase降解酶活力约100.6U/mL、产量为0.52mg/mL；

[0140] 表8工程化枯草芽孢杆菌产PET降解酶

[0141]

[0142] 实施例11重组菌BL21_pACYADuet‑1_FucO‑aldA‑BhrPETase在3吨发酵罐培养[0143] 发酵培养基：Na2HPO4 6.78g/L,KH2PO4 3.0g/L,NaCl 0.5g/L,NH4Cl 1.0g/L,MgSO47H2O 0.493g/L,CaCl2 0.011g/L。

[0144] 补料培养基：MgSO4 7H2O 18.35g/L,工业酵母粉4.8g/L,乙二醇500g/L,猪骨蛋白胨2.4g/L。

[0145] (1)种子活化阶段

[0146] 从‑80℃的甘油管，以2.0‰的接种体积接菌至含有50mL的LB液体培养(卡那霉素终浓度30μg/mL)中，共计2瓶，使用回旋恒温调速摇床进行培养，控制温度37℃，转速200rpm，初始pH 7.0，培养10h。

[0147] (2)种子罐培养

[0148] 于超净工作台中将2瓶种子液并瓶至1L无菌三角瓶中，接种前对种子液进行镜检以确认无杂菌污染。火焰接种接入500L种子罐，培养20‑24h。

[0149] (3)3吨发酵罐发酵阶段

[0150] 种子罐镜检无杂菌，菌体形态正常，转种至3吨发酵罐。加入终浓度为30mg/L卡那霉素，并每隔24h补加一次卡那霉素。发酵过程中始终用循环冷凝水控制发酵温度在33℃，‑1 ‑1用30％(v·v )的氨水溶液和20％(v·v )的磷酸溶液控制发酵过程的pH值在7.0±0.5。
将转速与溶氧(DO)进行偶联，使发酵过程的DO值在30％±2.5％。及时关注DO曲线的变化情况，当出现溶氧反弹后，及时加入补料培养基，之后根据OD600的生长情况变速流加补料培养基。发酵过程中每隔12h取一次样，测定酶活剂浓度。结果如图5所示，结果表明PET降解酶酶活随着培养时间的延长而逐渐增加，在108h时酶活力达到峰值，约1542.2U/mL。此时的PET降解酶的蛋白浓度达到9.6g/L。

[0151] 对比例1不同来源乙二醇代谢基因(FucO和AldA)对大肠杆菌产PET降解酶的影响[0152] 具体实施方式同实施例4，区别在于，调整表达框的乙二醇代谢基因(FucO和AldA)，替换成Pseudomonas putida KT2440来源的FucO和AldA，Rhodococcus jostii RHA1来源的FucO和AldA，Ideonella sakaiensis来源的FucO和AldA。

[0153] Pseudomonas putida KT2440来源的FucO：atgacaataagatcgctacccgccctttccccgctggccctgagcgtgcgcgtcctgctgatggccggtagcctggccctgggcaatgtggcaacagcggccagcacacccgctgcacctgccggcaagaacgtcacctgggaagacatcgccaatgaccacctgaccacccaggacgtgctgcagtacggcatgggcaccaatgcccagcgctggagcccgctggcccaggtcaatgacaagaacgtgttcaagctgaccccggcctggtcctactccttcggcgacgagaagcagcgcggccaggaatcccaggccatcgtcagcgatggcgtggtctacgtcaccggttcgtactcacgggtattcgccctcgatgccaagaccggcaaacgcctgtggacctacaaccaccgcctgcccgacaacattcgtccctgctgcgacgtggtcaaccgcggggcggcgatctacggcgacaagatctactttggcaccctcgatgcgcgtgtcatcgccctcgacaagcgcaccggcaaagtggtgtggaacaagaagttcggcgaccacagcgccggctacaccatgaccggtgcgccagtgctgatcaaggacaagaccagcggcaaggtgctgctgatccacggcagctccggcgatgaattcggcgtggtcggccagctgttcgcgcgcgacccggacaccggtgaagaagtgtggatgcggcccttcgtggagggccacatgggccgcctgaacggcaaggacagcaccccgaccggtgacgtcaaggcgccgtcctggccagacgaccctaccaccgaaaccggcaaggtcgaagcctggagccacggcggcggtgccccttggcaaagcgcgagcttcgaccccgaaaccaacaccatcattgtcggcgctggcaaccccggcccttggaatacctgggcgcgcacgtcgaaggacggcaacccgcatgacttcgacagcctgtacacctccggccaggtcggcgtcgacccgagcaccggcgaggtcaagtggttctaccagcacacccccaacgatgcctgggacttctccggcaacaacgagctggtgctgttcgactacaaggacaagaacggcaacgtggtcaaggccaccgcccacgccgaccgcaacggtttcttctatgtggttgaccgcaacaacggcaagctgcaaaacgctttccccttcgtcgacaacatcacctgggccagccatatcgacctgaagaccgggcgcccggtggaaaaccccggccaacgcccggccaagccgctgccgggtgaaaccaagggcaagccggtggaagtctcgccaccgttcctgggcggcaagaactggaaccccatggcctacagccaggacaccgggctgttctacatccccggcaaccagtggaaagaggaatactggaccgaggaagtgaactacaagaagggctcggcttatctgggcatgggcttccgtatcaagcgcatgtacgacgaccacgtcggcacgttgcgcgccatggacccgaccaccggcaagctggtgtgggaacacaaggaacacctgccgttatgggccggtgtgttggcgaccaagggcaacctggtgttcaccggcacgggcgacggcttcttcaaggccttcgacgccaagacgggcaaagagctgtggaagttccagaccggcagcggcatcgtctcgccgcccatcacctgggagcaggacggcgagcagtacatcggcgtgaccgtgggctacggcggtgcagtaccgctgtggggcggcgacatggccgagctgaccaaaccggtggctcagggtggttcgttctgggtgttcaagatcccgagctgggacaacaagactgcacaacgttga；

[0154] Pseudomonas putida KT2440来源的AldA：atgatctacgcacaacccggaactccaggcgccgtcgtatccttcaaaccccgttatggcaacttcatcggtggcgagttcgtgcagccgttggctggccagtacttcatcaacagctcgccggtcaatggccagccgattgccgaattcccgcgctccacggcccaggacgtcgagcgcgccctggacgccgcgcatgccgccgccgaagcctggggcaagacctcggtgcaagaccgtgcgcgggtactgctgaaaattgccgaccgcatcgaacagaacctggaagtgctggcggttaccgaaagctgggacaacggcaaggccatacgcgaaaccttgaatgccgacgtgccgctggcagcggaccacttccgctattttgccggttgcatccgcgcccaggagggtggcgtaggcgagatcaacgaaggcaccgtggcttatcacattcacgagccgctgggtgtggtggggcagatcatcccgtggaacttcccgctgctgatggccgcctggaagctcgccccggccttggccgctggcaactgcgtggtgctcaagcccgcggagcagacgccgctgtcgattaccgtctttgccgaactgatcgccgacctgttgccggcaggcgtactgaacatcgtccagggctttggccgtgaggccggtgaggcgctggccaccagcaagcgcattgccaagatcgcgttcaccgggtccaccccggtgggctcgcacatcatgaagtgcgcggccgagaacatcatcccgtccaccgtcgaactgggtggcaagtcgccgaacattttcttcgaagacatcatgcaggccgagccggcgttcatcgagaaggctgccgaaggcctggtgctggcgttcttcaaccagggcgaggtgtgcacctgcccgtcacgggcgctgatccaggagtcgatctacgaaccgttcatggccgaggtgatgaagaagatcgccaagatcacccgcggcaacccgctggataccgaaaccatggtgggtgctcaggcgtccgagcaacagtacgacaagatcctttcgtacctggaaattgcccgggaggagggcgcgcagctgctcaccggcggtggtgccgagcggctgcagggtgacctggccagcggttactacattcagccaaccctgctcaagggcaacaacaagatgcgcgtgttccaggaagaaatcttcgggccagtggtgggcgtgaccaccttcaaggacgaagccgaagcgctggcgatcgccaacgacagtgaattcggcctgggcgccggcctgtggacccgcgacatcaaccgcgcttaccgcatgggccgcgggatcaaggccgggcgagtgtggaccaactgctaccacctgtacccggcgcatgcggcgttcggggggtacaagaagtccggtgttggccgtgagacccacaagatgatgcttgaccattatcagcagaccaagaacctgctggtgagctacgacatcaatccgctgggcttcttctaa；

[0155] Rhodococcus jostii来源的FucO：atggccatcgagctcaaccagatctgggacttccccatcaaggaattccacccgttcccgcgggcactgatgggagtgggcgcccacgacatcatcggcgtcgaggcgaagaacctcggattcaagaggaccctgctcatgaccacgggcctgcgcggctcgggcatcatcgaggaactggtcggcaagatcgagtaccagggcgtcgaggtcgtgctctacgacaaggtcgagtccaatcccaaggactacaacgtcatggaggcggcagcgctctaccagaaggagaagtgcgactcgatcatctccgtcggcggcggctcgagccacgacgccgccaagggcgcccgtgtggtggtcgcgcacgacggccgcaacatcaacgagttcgagggattcgcgaagtccaccaacaaggagaacccgccccacatcgccgtatccaccacggccggtacgggttcggagacgtcatgggcgtacgtcatcaccgacacgtcggacatgaacaacccgcacaagtgggtgggattcgacgaggcgaccatcgtgaccctcgcgatcgacgacccgctgctgtactacacctgcccccagcacttcacggcgtactgcggattcgacgtcctcgcgcacggcagtgagccgtacgtgtcgcgtctcgacttcgcgccgtcgctcggcaatgcgttgtattcggtggaactcgtcgcgaagaacctgcgcgaggccgtgttcgagccgcgcaacctgaaggcccgcgagggaatgatgaacgcgcagtacatcgccggccaggcattcaactccggcggtctcggcatcgtgcactccatctcgcacgcggtcagcgcgttcttcgacagccaccacggtctgaacaacgcgatcgccctgccccgcgtctgggagtacaacctgccgtcgcggtacgagcgctacgcccagctggccggggcgctgggggtcgacacccgcaacctcaccacggtgcaggccgcggacgctgcggtcgaggcggccatccgcctggcgaaggacgtcggcattccggacaacttcggtcaggtgcgcaccgactcgtacgacaagaaccagatgaacaccaagaagtacgagggtcgcggtgacaccatccggggcgacgagaagaccgtgcgggccatctccgagcacatccagggcgactggtgcacgccgggcaacccgcgcgaggtgacggtcgagtcgatgctccccgtggtcgatcacgcgatcaacagcgcgtactga；

[0156] Rhodococcus jostii来源的AldA：atgaccgtgtatgcccgcccgggttcgccggacgccgtcatgtccttccaatcgcgttacgacaactggatcggcggccagtgggttgcgcccgtcaagggccagtacttcgagaatccgacacccgtcaccggacagccgttttgcgaggtcgcgcgttcgacgtccgaggacatcgaacttgcgctcgacgccgcacacgctgcggctccggcctggggcaagacgtcggtggcggagcgcgccatcatcctgaacaagatcgcggaccgcatcgaggagaacctcgagtccatcgcgctcgccgagtcctgggacaacggcaagccgatccgcgagaccctgaacgccgacattccgctggccgtcgaccacttccgctacttcgccggcgcgatccgggcgcaggaaggcgcactgtcggagatcgactccgacaccgtcgcctaccacttccacgagccgctcggcgtcgtcggccagatcatcccctggaacttcccgatcctcatggccgtgtggaagctcgctcccgcactcgccgcgggcaacgcggtcgtcctcaagcccgccgagcagaccccggcgtcgatcctgcacctgatctccgtcatcggcgacctgctgcccgccggtgtggtgaacatcgtcaacggattcggtgtggaggcgggcaagccgctcgcctcgagcccacggatccggaagatcgcgttcaccggtgagaccaccacgggccggctcatcatgcagtacgcgtcgcagaacctgatcccggtcaccctcgaactcggtggcaagagccccaacatcttcttctccgacgtgctgtcctccaacgacgactaccaggacaaggcgctcgagggcttcacgatgttcgccctcaaccagggcgaggtgtgcacctgcccgtcgcgttcgctgatccaggaggacatcttcgacgagttcctcgcgatggcggccatccgcaccaaggccgtccgccagggcgacccgctcgacaccgacacgatgatcggcgcgcaggcctcgaacgatcagctcgagaagatcctgtcgtacatcgagatcggcaagggcgaaggcgccaaggtcgtcaccggcggtgagcgcgccgaactcggcggcgacctgtccggcggctactacgtgcagccgacgatcttcaccggtcagaacaagatgcggatcttccaggaggagatcttcggtcccgtcgtctccgtcacgtcgttcaaggactacgaccaggccatcgagatcgccaacgacacgctgtacggcctcggcgccggcgtgtggtcgcgggacggtggcgtcgcctaccgcgccggtcgcgacatccaggccgggcgcgtgtggaccaacacgtaccaccagtaccccgcgcacgcggcgttcggtggctacaagcagtccggcatcggccgcgagaaccacctgatgatgctcgagcactaccagcagacgaagaacctgctggtcagctacgcccagaaggctcagggcttcttctga；

[0157] Ideonella sakaiensis来源的FucO：atgaacccgacccctgcccatcgcgcacccttgcgccgctgcgcccgcgccctggccgccgcgtcgctcgccgtcggcgccggtggcaccgccctggccgcccagggcagccgtcccgtgacctgggacgacatcgccaacgaccaccgcaccggccaggacgtgctcacctacggcctgggcctgaaggcccagcgacacagcccgctcaagcaggtcagcacccgcaacgtgaagcagttggtgccggcctggagcttctcgttcggtggcgagaagcagcgcggccaggaggcgcaggcgctggtgcacgacggcgtgatctacgtcaccgcctcgtactcgcgcctgttcgcgctggacgccaagaccggccgccagctctgggcctacgaacatcgcctgcccgaggacatccggccgtgctgcgacgtggtcaaccgcggcgccgcgatctatggcgacaaggtgtacttcgggacgctggacgcgcgcatcatcgcgctcgacaaggccaccgggaaggtggtctggaacgagaagttcggcgaccacaaggtcggctacacgatgacgggcgcgcccttcgtcgtgaaggagaagggcggccgggtgctgctggtgcacggctcctccggggacgagttcggcgtggtcggctggctctatgcgcgcgatcccgacaccggcgccgaggtctgggcccggcccttcgtcgaaggccatgtcggccgcatgaacgggcaggacgccgggccgaccggcgaccccaaggcgccgagctggccgcgcgacaaggacggcaagctggtcgaggcctggagccagggcggcggcgcgccgtggcagaccgccagctacgaccccgagacgaacacggtggtcatcggcaccggcaacccggcgccttggaatacctggaaacgcaccgccgagggcggcgacccgcgcgactgggacagcctctacacctccggccaggcctacgtcgacgccagctcgggccagctcaagggcttcttccagcacacgccgaacgatgcctgggacttctccggcaacaactcgatcgtgctgttcgagtacaaggacaagggcggcaagctggtgaaggccggcgcccacgcggaccgcaatggcttcttcttcgtgaccgatcgcgagaagctggcgggcgcccccggggcgccgaacaagcccaccgcgctgatcaatgcctggcccttcgtcgacggcatcacctggtcgacgggcttcgacccgaagaccggccgcccgaacgtggtcaagggccagcacccgccgctgccgaagccaggcagcgacaagggcgaggcgatcttcgtgtcgccgcccttcctcggcggcacgaactggatgccgatgtcctactcgccggacaccggcctgttctacatcccggccaaccactgggcgatggactactggacggagaacgtcacctacaaggccggctccgcctacctcggccagggcttccgcatcaagcggctgttcgacgaccacgtcggcatcctgcgggcgatcgacccgcgatccggcaagatcgtctggcagcagaaggagaagttcccgctgtgggccggcacgctcacgaccgccggcggcctgctgatcaccggcacctccgacggctacgtgaaggccttcgacgcgaagaccggtgaggaactctggcacttccagaccggctcgggcatcgtctcggtgccgatcacctgggagcaggacggcgagcagtacatcgggctgtcctccggctacggcggcgcggtgccgctgtggggcggcgacatggcggagctgaccaagcaggtcacccagggcggcagcttctgggccttcaagctgccgcggcgctga；

[0158] Ideonella sakaiensis来源的AldA：atggacatgctcgagcccggcaaattcggcaccccggtggcgttcaagaaacgctacggcaactacatcggcggcgagtgggtcgcgccgtccggcaaccagtacttcgagaacgtcacgcccgtcaccggccgtgcattctgcgagattccccgctcgaccgcggaggacatcgagcgcgcacttgacgcagcgcatcgcgcgaaggacgcctggggccgcagttcgccggccgagcgggcccaggtgctgaaccgcatcgcggaccgcatggagcagcacctgccgatgctggccgccgccgagacctgggacaacggcaagccgatccgcgagacgacccacgccgacctgccgctggcgatcgaccacttccgctacttcgcgtcggtggtgcgggcccaggagggcggcatcagcgagatcgaccaccagacctatgcctaccacttccacgagccgctgggcgtggtcggccagatcatcccgtggaacttcccgctgctgatggcggtgtggaagctggcgcccgcgctggcggccggcaactgcgtggtgctgaagccggccgagcagacgccggtctcgatcctggtgctgatggaactgatcggcgacctgctgccgcccggcgtgctgaacgtcgtcaacggcttcggcgtcgaggccggcaagccgctggcctccagcccgcgcatcgccaagatcgccttcaccggcgagaccaccaccggccggctgatcatgcagtacgcgagccagaacctgatcccggtgacgctggagctcggcggcaagtcgccgaacatcttcttcgccgacgtgatggacaaggacgacgccttcttcgacaaggcgctcgagggcttcgcgatgttcgcgctgaaccagggcgaggtctgcacctgcccctcgcgcgtgctggtccaggcctcgatctacgaacgcttcatggagcgcgcgctgcagcgcgtggccgcgatcaggcagggcaacccgctggacatggccacgatgatcggcgcccaggcctcgagcgagcagctcgagaagatcctcggctacctcgacatcggccgccaggaaggcgccaagctgctgatcggcggcgagcgcaaccgcctcggcggcgacctggaaggcggctactacgtgaagcccaccgtcttccagggacacaaccggatgcgcatcttccaggaggagatcttcgggccggtgacctcggtgacgaccttcgaggacgaggccgaggcgctggcgatcgccaacgacacgctctacggcctcggcgcgggcgtgtggagccgcgacatgaacacggccttccgcatgggccgcggcatccaggccggccgcgtctggaccaactgctaccacgcctacccggcccacgccgccttcggcggctacaagcagtcgggcatcggccgcgagacccacaagatgatgctcgaccactaccagcagaccaagaacctgctggtcagctacagcgagagcaagctgggcttcttctga。

[0159] 用实施例4中的转化法将构建的重组质粒导入大肠杆菌，分别获得重组菌BL21_pACYADuet‑1_PpFucO‑PpaldA‑BhrPETase、BL21_pACYADuet‑1_RjFucO‑RjaldA‑BhrPETase、BL21_pACYADuet‑1_IsFucO‑IsaldA‑BhrPETase。分别以20mg/mL EG M9培养基、实施例1制备的×15PET水解液、实施例2制备的×10残留PET水解液为原料，按照实施例8的方法发酵。结果如表9所示，替换了乙二醇代谢基因的菌株产酶能力显著降低。

[0160] 表9工程化大肠杆菌产PET降解酶

[0161]

[0162] 对比例2不同启动子对大肠杆菌产PET降解酶的影响

[0163] 具体实施方式同实施例4，区别在于，将表达框的组成型启动子PgyrA分别替换成启动子Pro04351、Ptac和PamiC；启动子序列如下：

[0164] 启动子Pro04351：

[0165] TGATGTCTCCGGGCTGTCGTAGGGTACGGGCGAGTAGCTTCCACACCGCCACGACCTGC

[0166] GCATTTGATGATAACGAGTCCTTTTCCGGGGCTGTCGCCCGGGGTGTCGTGACCCCCGC

[0167] GCCAATCCGCTGTTTCGTGCCTGTTCGCTACAAGATCAACTTTTTGTGTGAATTGTTCGG

[0168] ATTTCGACTGTTGCGTTCGCGGAGTTCATGGTTGACTACAACTGGTCGCAGCTTCTGTGT

[0169] TCGTAGGCTTGAAAGAGTGAACGTTCGCAGGATCGATGTTGCGAACGCGGTGCTCTGCT

[0170] TTTCCTGAGGGGGAAATCTAGAAGTACAGCGGTCGGAACCGGCCCGGCGGACTGTATGTGCTGTCCGCCGAATCCGGTGGTTAGAAAGAGAAGGAAAAGC；

[0171] 启动子Ptac：TTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATG；

[0172] 启动子PamiC：

[0173] GAGATTACGGAGAACGGGGCTTGTGGCCGTCCCTGTCGTGTCGTAACGTGTCCACAACGTTGCAGTTCA。

[0174] 参照实施例4的转化法将上述替换了启动子的重组质粒导入大肠杆菌，分别以20mg/mLEG M9培养基、实施例1制备的×15PET水解液、实施例2制备的×10残留PET水解液为原料，按照实施例8的方法发酵。结果如表10所示，应用启动子Pro04351、Ptac或PamiC构建的表达框表达效果远不如启动子PgyrA。

[0175] 表10工程化大肠杆菌产PET降解酶

[0176]

[0177] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。