[0001] 本发明涉及细胞冻存技术领域，尤其涉及一种细胞冻存液、制备方法、应用与冻存细胞的方法。

[0002] NK，是人体免疫系统中的一种重要细胞类型。它们具有无需预先激活即可识别并杀死癌细胞和感染细胞的能力，因此被视为抗癌的第一道防线。CAR‑NK是通过基因工程技术将人工合成的CAR结构转录到NK细胞上而得到的。这种技术相当于给NK细胞装上“GPS”装置，使其在保留NK细胞原有功能的前提下，又能将目标精准锁定在特定的抗原蛋白，从而更有效地杀死癌细胞。NK和CAR‑NK细胞作为重要的免疫细胞，在肿瘤免疫治疗中扮演着关键角色。然而，目前NK，CAR‑NK细胞的冻存仍然面临一些技术挑战。

[0003] 首先，NK、CR‑NK细胞的冻存过程中，如何尽量减少，或者完全避免使用DMSO等毒性物质是一个重要问题。研究人员正在探索无DMSO的冻存方法，如使用蔗糖、甘油等替代品，以提高NK、CR‑NK细胞在解冻后的活性和功能。这些替代冻存剂可以有效降低细胞损伤，提高细胞存活率。

[0004] 其次，冻存后的NK、CR‑NK细胞如何保持其活性和杀伤能力也是一个关键问题。研究发现，合理的冻存条件和解冻方法可以最大程度地保护NK细胞的功能。例如，采用缓慢冷冻和快速解冻的方法，可以有效减少细胞损伤，提高细胞活性。此外，添加一些保护剂如牛血清白蛋白、乳糖等也可以提高NK、CAR‑NK细胞在冻存和解冻过程中的存活率。

[0005] 目前，NK、CAR‑NK细胞冻存后活率和杀伤能力下降是一个亟待解决的技术难点。通过开发新型冻存介质、优化制备和冻存流程、针对不同来源细胞进行个性化处理等措施，可以有效提高CAR‑NK细胞冻存后的性能,为CAR‑NK细胞治疗的临床应用奠定基础。因此，亟需一种冻存效果好的冻存液。

[0018] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

[0019] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

[0020] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

[0021] 在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

[0022] 关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

[0023] 实施例1本发明实施例1提供了一种细胞冻存液的制备方法，具体包括如下步骤：
取细胞冷冻保护液CS10（美国Biolife品牌CryoStor临床级即用型冻存液产品）、右旋糖苷40葡萄糖注射液（国药准字：H51020230）、复方电解质注射液（国药准字：
H20000475）、人血白蛋白注射液，按照5：1：3：1的体积比例将上述溶液混合均匀，得到细胞冻存液（QM冻存液）。

[0024] 试验例1本发明试验例1采取了程序降温盒冻存方法，以异丙醇为冻存媒介，检测了实施例
1制备的细胞冻存液（QM冻存液）对NK细胞的冻存效果，具体步骤如下：
（1）取活率相同的同一批NK细胞分别使用细胞冻存液（QM冻存液）、10%DMSO+自体血浆、CS10、商品化冻存液（对照‑1）、商品化冻存液（对照‑2）将细胞重悬，得到浓度为1×
8
10/mL细胞悬液，将细胞悬液装入冻存管中，盖好盖子，将装有细胞悬液的冻存管放入程序降温盒的孔洞中，确保管子完全插入，将程序降温盒放置‑80℃冰箱过夜，次日转移至液氮罐中储存。

[0025] （2）NK细胞冻存复苏后的活率与NK细胞复苏后的杀伤，扩增能力有非常直接的关系，复苏后的活率高，意味着具有杀伤，扩增能力的NK细胞多，杀伤肿瘤细胞的效果就更明显，带来的临床治疗效果就更明确。因此，本发明将冻存复苏后的活率作为重要的观察指标，将步骤（1）冻存的细胞进行复苏，并检测细胞存活率结果如表1和图1所示。

[0026] 复苏步骤如下：首先，将水浴锅升温至37℃。然后，将细胞冻存管或冻存袋浸入水浴锅中，观察冻存液逐渐融化，直至完全融化。最后，拿出冻存管或袋，表面喷洒75%酒精消毒。转入生物安全柜进行下一步操作。

[0027] 表1 NK细胞冻存复苏后的活率评价

[0028] 由表1和图1可知，复苏后即刻检测，细胞冻存液（QM冻存液）的活率达到93%，在五种冻存液中下降幅度最小。复苏后24小时，理论上来说NK细胞的活率下降达到最低点，通常来说活率会下降到50‑60%。但是细胞冻存液（QM冻存液）可以很好的保护NK细胞，此时NK细胞的活率高达80%。后续培养NK细胞的活率会逐渐上升，复苏48小时后活率恢复到83%，复苏72小时后活率恢复到90%。在3天内恢复到了与NK细胞冻存前相仿的状态。

[0029] 10%DMSO+自体血浆，该配方是最常见的实验室自配冻存液配方，一般包括10%DMSO，10‑20%自体血浆以及70‑80%培养基。该配方配制简单，成本最低，但是冻存NK细胞的效果最差。复苏后即刻检测，活率达到87%，下降还不是很明显，但是复苏后24小时，活率下降到49%。后续培养NK细胞的活率恢复的也不明显，复苏48小时后活率50%，复苏72小时活率56%。

[0030] CS10，是免疫细胞产品冻存使用最广泛的商品化的冻存液，广泛用于CAR‑T,NK，CAR‑NK细胞产品的冻存。从本发明的实验对比结果来看，CS10可以较好的保护NK细胞冻存复苏后的活性。复苏后即刻检测，活率达到90%，复苏后24小时，活率下降到61%。48小时后活率68%， 72小时活率80%。

[0031] 商品化冻存液 对照‑1（批号：MED2403008），对照‑2（批号：20240312），是两款国产的商品化的冻存液。均称可以用于CAR‑T,NK，CAR‑NK细胞产品的冻存。但从实验结果看，这两款产品对NK细胞的活性保护能力均不及CS10，比细胞冻存液（QM冻存液）的差距更为明显。

[0032] 试验例2本发明试验例2采取了程序降温盒冻存方法，以异丙醇为冻存媒介，检测了实施例
1制备的细胞冻存液（QM冻存液）对CAR‑NK细胞的冻存效果，具体步骤如下：
（1）取活率相同的同一批对CAR‑NK细胞分别使用细胞冻存液（QM冻存液）、10%DMSO+自体血浆、CS10、商品化冻存液（对照‑1）、商品化冻存液（对照‑2）将细胞重悬，得到浓度为
8
1×10/mL细胞悬液，将细胞悬液装入冻存管中，盖好盖子，将装有细胞悬液的冻存管放入程序降温盒的孔洞中，确保管子完全插入，将程序降温盒放置‑80℃冰箱过夜，次日转移至液氮罐中储存。

[0033] （2）CAR‑NK细胞冻存复苏后的活率与CAR‑NK细胞复苏后的杀伤，扩增能力有非常直接的关系，复苏后的活率高，意味着具有杀伤，扩增能力的CAR‑NK细胞多，杀伤肿瘤细胞的效果就更明显，带来的临床治疗效果就更明确。因此，本发明将冻存复苏后的活率作为重要的观察指标，将步骤（1）冻存的细胞进行复苏，并检测细胞存活率，结果如表2和图2所示。

[0034] 表2 CAR‑NK细胞冻存复苏后的活率评价

[0035] 由表2和图2可知，复苏后即刻检测，细胞冻存液（QM冻存液）的活率达到90%，在五种冻存液中下降幅度最小。复苏后24小时，CAR‑NK细胞的活率高达80%。复苏48小时活率82%，复苏72小时活率89%。细胞冻存液（QM冻存液）复苏的CAR‑NK细胞在3天内迅速恢复到了冻存前的状态，细胞冻存液（QM冻存液）可以很好的保护CAR‑NK细胞的活性，也保证了杀伤效果是五种冻存液中效果最好。

[0036] 10%DMSO+自体血浆，虽然该配方配制简单，成本最低，但是对CAR‑NK细胞的活性保护最差。复苏后活率不断下降， 24小时活率下降到45%， 48小时活率33%，72小时活率2%。也就是说复苏后3天，该组CAR‑NK细胞完全死亡，该冻存液没有起到保护CAR‑NK细胞活性的作用。

[0037] CS10，虽然是最受认可的冻存液产品，但是在复苏24小时，CAR‑NK细胞活率也只有57%，远低于细胞冻存液的同期数据。48小时后活率63%，72小时活率78%，CAR‑NK细胞活率有所回升。

[0038] 商品化冻存液 对照‑1，对照‑2，是两款国产的商品化的冻存液。从实验结果看，这两款产品对CAR‑NK细胞的活性保护能力均弱于CS10。对照‑2强于对照‑1，从复苏后活率的结果看，对照‑2接近于CS10的冻存效果，但与细胞冻存液（QM冻存液）有显著的差距。

[0039] 试验例3本发明试验例3采取了实施例2步骤（1）的冻存方法，检测了实施例1制备的细胞冻存液实施例1制备的细胞冻存液（QM冻存液）对CAR‑NK细胞冻存复苏后杀伤能力的影响，具体步骤如下：
采取实施例2步骤（1）冻存CAR‑NK细胞，并进行复苏，然后与靶细胞MM.1S‑GFP按照效靶比2:1混合，流式检测不同时间点对靶细胞的杀伤效果，结果如图3所示。

[0040] 图3显示，在0h，可以看到包括对照的NK细胞在内，共6组冻存复苏后的NK，CAR‑NK细胞，与靶细胞的效靶比均在2:1左右。在24hrs，除了细胞冻存液（QM冻存液）组的CAR‑NK细胞仍多于靶细胞以外，其余各组的CAR‑NK细胞比例显著下降，远低于靶细胞。这意味着CAR‑NK细胞的数量减少，不能对靶细胞产生有效的杀伤。在48hrs，如箭头所示，细胞冻存液（QM冻存液）组的CAR‑NK细胞比例进一步增加，靶细胞比例非常低，这意味着细胞冻存液（QM冻存液）复苏后的CAR‑NK细胞具有很好的杀伤靶细胞杀伤活性，几乎将靶细胞完全清楚干净。CS10组的CAR‑NK细胞比例也逐渐超过了靶细胞。其余各组的CAR‑NK细胞仍远远低于靶细胞。这意味着其余各冻存液组不能很好的保护CAR‑NK细胞的杀伤活性。

[0041] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。