[0001] 本发明属于生物防治技术领域，具体来说涉及一种用于检测烟草叶部病原喀斯特炭疽菌的RPA‑LFD引物组合物，同时涉及该用于检测烟草喀斯特炭疽菌的RPA‑LFD引物组合物在检测烟草喀斯特炭疽菌方面的应用。

[0002] 烟草炭疽病是烟草叶部发生的主要真菌病害之一，在中国烟草产区均有发生，但在西南烟区发生普遍。其中，喀斯特炭疽菌是烟草炭疽病的重要病原菌。在烟草生长的中后期，赤星病、炭疽病、靶斑病等多种叶斑病混合发生，较为复杂，且这些病害的症状相似且难以区分。传统的病害识别需要通过病害症状、病原菌的生物学形态等特点，进行病害识别，易受到人为因素的影响，鉴定耗时长，精准度低。随着技术的发展，聚合酶链反应( PCR )、q‑PCR等分子生物学检测技术已被成功应用于植物病原菌的检测。如与传统病害识别方法相比，这些检测方法具有高精准度，但大多需要专业技术人员和设备，检测速度较慢，严重限制了烟草叶斑类病害的快速识别诊断。因此，开发快速简便的烟草炭疽病病原菌检测技术对烟草的生产具有重要意义。

[0003] 重组酶聚合酶扩增法( RPA )是一种新型核酸等温扩增方法，与传统PCR扩增法、q‑PCR和LAMP检测相比，其显著的优势是温和的反应温度范围和更短的反应时间。通过与荧光基团标记的反应，RPA技术与侧流层析试纸条( LFD )相结合，实现扩增产物的可视化检测，不需复杂仪器设备，适合现场快速检测，可以实现病原物高特异性、高灵敏度的可视化快速检测，具有极为广泛的应用前景。RPA检测的关键在于特异性引物的设计，目前对于喀斯特炭疽菌的RPA检测方法尚未见报道。

[0018] 下面结合附图及具体实施例对本发明的具体实施方式、特征及其功效进行进一步描述。

[0019] 使用的主要试剂及仪器为：A 缓冲液（安普未来生物科技有限公司）、B 缓冲液 （安普未来生物科技有限公司）、HybriDetect胶体金试纸条（安普未来生物科技有限公司）、ddH2O水、分子质量标准DNA Marker （TaKaRa生物工程公司基因组）、PEG200（生工生物工程股份有限公司）、PCR仪。

[0020] 实施例1：一种用于快速检测喀斯特炭疽菌（Colletotrichum karstii）的RPA‑LFD引物组合物，包括用于检测的引物对和探针，所述引物对：
上游引物：5’‑GAAGATTGTCGTCTGCGTAGTCAGCGACGGTCG‑3’
下游引物：5’‑ Biotin‑ GTTCTTTTCCTTCAAGCAGAACAGCATCTGAACGG‑3’
探针：
5’‑6‑FAM‑ GCAGCGGGCTTCGTGGCTTTCGCCTGCTGCTGC/idSp/GCTTGGGGCGCATAT ‑ Spacer C3 ‑ 3’；
所述下游引物5’端使用生物素标记，所述探针5’端的荧光基团为6‑羚基荧光素，
3’端的荧光基团为亚磷酰胺。

[0021] 含有上述快速检测植物喀斯特炭疽菌的RPA‑LFD引物组合物的试剂盒，包括重组酶聚合酶扩增引物混合液和LFD引物混合液，50 μL检测反应体系中含有A 缓冲液 29.4 μL、10 μM的正向引物2 μL，10 μM的反向引物2 μL，10 μM的探针0.6 μL，B 缓冲液5 μL，10 ng/μL待测DNA模板2 μL，无菌水补足至50 μL。

[0022] 实施例2：实施例得到的试剂盒快速检测植物喀斯特炭疽菌的方法，包括以下步骤：
（1）提取样本核酸；
（2）采用组合物对步骤(1)提取的样本核酸进行RPA扩增反应，50 μL检测反应体系中含有A 缓冲液 29.4 μL、10 μM的正向引物2 μL，10 μM的反向引物2 μL，10 μM的探针0.6 μL，B 缓冲液5 μL，10 ng/μL待测DNA模板2 μL，无菌水补足至50 μL；RPA‑LFD扩增反应程序为：39℃，8 min；
（3）取10 μL步骤(2)得到的反应产物加入至190 μL ddH2O中，混匀后取50 μL稀释后的扩增产物滴入Hybri Detect胶体金试纸条加样孔，5 min内记录控制线和检测线，判定试验结果，若控制线可见，检测线不可见，此为阴性结果（即判定DNA模板对应的待测物中不含有植物病原喀斯特炭疽）；若检测线和控制线均可见，此为阳性结果（即判定DNA模板对应的待测物中含有植物病原喀斯特炭疽）；若检测线和控制线均不可见，需要重新进行检测。

[0023] 试验例1：引物的特异性基于烟草炭疽菌C. karstii的基因组序列，比对烟草常见病原菌属：烟草赤星病
菌（A. alternata），立枯丝核菌(R. solani)，棒孢霉(C. cassiicola)，弯孢霉(C. lunata)，附球菌(E. nigrum)，黑孢霉(Nigrosporaspp.)，茎点霉(Phomaspp. ),镰刀菌(Fusariumspp. ) 序列差异位点设计了3对喀斯特炭疽菌特异性引物，见表1。

[0024] 表1引物序列信息使用常规PCR对表1所述的引物特异性进行验证，PCR反应体系见发明过程中特异
性引物的设计与筛选。扩增结果见图2，编号3的引物对仅能对烟草炭疽菌扩增出单一目的片段，而其他菌株扩不出条带。片段长度为244 bp，经测序验证符合度100%。ITS1、ITS4引物与编号3引物对比，编号3引物仅能扩增出喀斯特炭疽菌，表明本研究所设引物具有特异性。
A为编号1的引物对测定结果；B为编号2的引物对测定结果；C为编号3的引物对测定结果；D为ITS1、ITS4引物对的测定结果。泳道Marker：DNA Marker；泳道1‑12：烟草炭疽菌(Colletotrichum karstii)；泳道13‑14: 烟草赤星病菌(Alternaria alternata)；泳道
15‑16：立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)；泳道17‑18：棒孢霉(Corynespora cassiicola)；泳道19：弯孢霉(Curvularia lunata)；泳道20：附球菌(Epicoccum nigrum)；
泳道21：黑孢霉(Nigrosporaspp.)；泳道22：茎点霉(Phomaspp. )；泳道23：镰刀菌(Fusariumspp. )；泳道24：空白对照。

[0025] 将筛选出的引物对添加标记物生物素，并和相应的探针一样使用HPLC纯化，如表2所述。

[0026] 表2 RPA‑ LFD检测引物探针标记试验例2：检测体系的特异性分析
使用实施例1筛选得到的标记后的引物和探针进行检测体系的特异性分析，以引
起烟草炭疽病的C. karstii作为阳性对照，以烟草赤星病菌（A. alternata），立枯丝核菌(R. solani)，棒孢霉(C. cassiicola)，弯孢霉(C. lunata)，附球菌(E. nigrum)，黑孢霉(Nigrosporaspp.)，茎点霉(Phomaspp. ),镰刀菌(Fusariumspp. ) 8种真菌作为阴性对照，并以ddH2O作为空白对照。RPA检测体系见发明过程中特异性“引物+探针”组合的筛选。

[0027] 将反应产物加入至190 μL ddH2O中，混匀后取50 μL稀释后的扩增产物滴入Hybri Detect胶体金试纸条加样孔，5 min内记录控制线和检测线，判定试验结果。反应结果见图3所示，以烟草炭疽菌DNA为模版的样品检测线可见， 1‑12:喀斯特炭疽菌（C. karstii），检测结果为阳性；而其他8种真菌DNA为模版及ddH2O对照的样品检测线不可见，其中13‑14: 烟草赤星病菌（A. alternata）；15‑16：立枯丝核菌(R. solani)；17‑18:棒孢霉(C. cassiicola)；19:弯孢霉(C.  lunata)；20：附球菌(E. nigrum)；21:黑孢霉(Nigrosporaspp.)；22:茎点霉( Phoma spp. )；23：镰刀菌(Fusariumspp. )；24：空白对照。检测结果为阴性。检测结果表明，筛选得到的RPA‑ LFD引物探针组能特异性地检测喀斯特炭疽；
试验例3：RPA‑ LFD检测条件的优化
使用筛选得到的引物和探针组进行检测条件的优化，使用10 ng/μL的C. 
karstiiDNA作为模版。图4A中1‑7：反应温度分别为：33°C、35°C、37°C、39°C、41°C和43°C,优化结果显示，在37‑43℃时，HybriDetect LFD的检测线上可以观察到清晰的条带。根据反应的稳定性，选择39℃作为最佳反应温度。在39℃下进行不同时间RPA‑LFD的反应，图4B中1‑
6：反应时间分别为：4 min、6 min、8 min、10 min和12 min。扩增8 min时检测区条带最为清晰。结果表明，所建立的RPA‑ LFD检测的最佳反应条件为39℃，8 min。反应体系见发明过程中特异性“引物+探针”组合的筛选，将反应条件确定为：39℃，8 min。

[0028] 试验例4：RPA‑ LFD检测技术的灵敏度使用上述建立的引物和探针组及反应条件，使用不同浓度的的C. karstiiDNA作
为模版进行测试，图5中1‑6：浓度分别未10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL。测试结果表面，本RPA‑ LFD检测技术在C. karstiiDNA浓度为10 ng/μL能产生清晰的阳性检测线，10 pg/μL、1 pg/μL时仍有弱的阳性检测线，但当C. karstiiDNA浓度为100 fg/μL时没有阳性检测线。说明本技术的检测限可达pg级别。

[0029] 试验例5：对接种喀斯特炭疽及其他病原菌烟草叶片的检测将喀斯特炭疽及其他病原菌在黑暗条件下培养5 d，使用5 mm打孔器进行打孔。使用灭菌昆虫针对健康的烟草叶片进行刺伤，在伤口处接种菌饼。置于28℃的光照培养箱，12 h光照、12 h黑暗，5天后对叶片使用20 mM KOH‑60% PEG 200 裂解液提取植物组织进行检测。

[0030] 20 mM KOH‑60% PEG 200 裂解液配置方法：体系为40 mL，24 mL PEG 200，0.93mL KOH，ddH2O补足至40 mL，pH为13.3‑13.5。提取过程为：将10 mg的植物组织加入100 μL的20 mM KOH‑60% PEG 200裂解液中室温浸泡15min，得到裂解产物。

[0031] 取2 μL的裂解产物作为DNA模版，采取与2特异性“引物+探针”组合的筛选中所取得的体系进行扩增与检测。

[0032] 结果如图6显示，B：RPA‑LFD检测结果；1‑5 ：分别为：空白未接菌对照、喀斯特炭疽菌（C. karstii）、烟草赤星病菌（A. alternata）、棒孢霉（C. cassiicola）、立枯丝核菌（R. solani）。

[0033] RPA‑LFD检测能检测到烟草是否感染了喀斯特炭疽菌（C. karstii）。