[0001] 本发明涉及一种化合物，特别涉及一种具有神经保护功能的含脒基新型iNOS抑制剂及其制备方法与应用。

[0002] 脑卒中也被称为中风(Mol.Basis.Dis.,2020,1866(4):165260.)，是由于阻塞或者破裂的脑血管使得脑血流供应不足或中断，从而引发脑组织损伤(J.Clin.Neurosci.,2021,93:174‑182.)。脑卒中的症状可能因患者而异，常见症状包括突发的四肢无力、麻木或乏力，突然出现的话语困难、理解困难、视觉丧失或模糊，以及严重的头痛、眩晕、失去平衡能力等(Neurol.India,2021,69(2):272‑283)。脑卒中是一种严重的病症，通常需要紧急治疗。

[0003] 脑卒中分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中两种(Lancet,2020,396(10258):1223‑1249.)。其中缺血性脑卒中，指多原因的血管损伤、闭塞损伤大脑的血氧供应，脑组织缺血处出现缺血缺氧性坏死，导致发病者神经功能缺损的一种急性脑血管疾病(Circulation,
2018,137(12):e67‑e492.)。随着人口老龄化的迅速增加和心血管疾病的不断增加，急性缺血性中风的发病率持续上升，对健康造成重大负担(J.Stroke Cerebrovasc.,2022,31(4):
106274.)。在西方国家，其发生率大约是出血性中风的10倍。中风是世界上第二大常见的死亡原因和第三大最常见的残疾原因。在全球范围内，中风造成的死亡和残疾绝对数一直在增加，使得低收入和中等收入国家负担不断(Int.J.Mol.Med.,2022,49(2):1‑9)。

[0004] 当前临床上使用的药物，如神经保护剂丁苯酞(NBP)和自由基清除剂依达拉奉(Eda)，在抗脑缺血方面表现出一定的疗效，但各自也存在显著的局限性。NBP虽然具有多靶点抗脑缺血活性，但其治疗效果并不突出(Neurosci.Lett.,2012,516(2):247‑252)；Eda则由于水溶性差，口服生物利用度低，往往需要通过静脉注射给药，增加了治疗成本和不便性。1400W作为一种高效的选择性iNOS抑制剂，虽然在细胞实验中表现出良好的iNOS抑制活性，但其对脑血流的改善能力较弱，未能获得理想的抗脑缺血疗效(Neurochem.Res.,2011,36:476‑486.)。

[0005]

[0077] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明。

[0078] 一、中间体的合成

[0079] 实施例1：中间体1‑1的合成步骤是将6‑NH2‑NBP(205mg,1mmol,1eq)和对应的苯甲酸衍生物(1mmol,1eq)置于25mL圆底烧瓶中，加入5mL DMF作为溶剂，完全溶解反应物。然后加入缩合剂N,N,N',N'‑四甲基氯甲脒六氟磷酸盐(420mg,1.5mmol,1.5eq)，缚酸剂N‑甲基咪唑(288mg,3.5mmol,3.5eq)。加入完毕后，放置25℃搅拌24h。反应过程中反应液逐渐由浑浊变澄清，固体原料全部溶解，反应结束后减压浓缩，加水稀释残余物。用EA萃取，收集上层清液，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩去除溶剂，粗品通过柱层析纯化(PE：EA＝2:1)得白色固体即中间体1‑1。

[0080] 实施例2：中间体1‑2的合成步骤是将中间体1‑1(1mmol)置于50mL圆底烧瓶中，加入8mL三氟乙酸的二氯甲烷溶液(1:3)作为溶剂，置于25℃，搅拌1h，反应结束，加水淬灭，DCM萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩至干，得白色固体，不经过进一步处理，直接用于下一步反应。

[0081] 实施例3：中间体2‑1的合成步骤是将6‑NH2‑NBP(205mg,1mmol,1eq)和对应的苯甲醛衍生物(1mmol,1eq)置于圆底烧瓶中，加入10mL无水乙醇溶解反应物，加热至80℃回流反应12h，随后缓慢降温至0℃，少量多次加入硼氢化钠(76mg,2mmol,2eq)，移至室温反应2h。TLC(展开剂PE：EA＝3：1)检测反应完成后，加水淬灭，DCM萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩去除溶剂，粗品通过柱层析纯化得即中间体2‑1。

[0082] 实施例4：中间体2‑2的合成步骤是将中间体2‑1(1mmol)置于50mL圆底烧瓶中，加入8mL三氟乙酸的二氯甲烷溶液(1:3)作为溶剂，置于25℃，搅拌1h，反应结束，加水淬灭，DCM萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩至干，得白色固体，不经过进一步处理，直接用于下一步反应。

[0083] 实施例5：中间体3‑1的合成步骤是将3‑(溴甲基)苯甲酸(198mg,1mmol,1eq)置于50mL圆底烧瓶中，加入10mL丙酮使其溶解，再加入3‑甲基‑5‑氧代‑1,2,4‑恶二唑‑4‑基钾(138mg,1mmol,1eq)到烧瓶中，25℃搅拌18h。反应结束，减压浓缩至干，用无水乙醚洗涤后得到白色固体，直接用于下一步。

[0084] 实施例6：中间体4‑1的合成步骤是将3‑(溴甲基)苯甲醛(198mg,1mmol,1eq)置于50mL圆底烧瓶中，加入10mL丙酮使其溶解，再加入3‑甲基‑5‑氧代‑1,2,4‑恶二唑‑4‑基钾(138mg,1mmol,1eq)到烧瓶中，25℃搅拌18h。反应结束，减压浓缩至干，用无水乙醚洗涤后得到白色固体，直接用于下一步。

[0085] 实施例7：中间体5‑1的合成步骤是将乙酰乙酸乙酯(130mg,1mmol,1eq)和4‑氰基苯肼盐酸盐(170mg,1mmol,1eq)置于50mL圆底烧瓶中，并缓慢滴入5mL冰乙酸。反应加热至80℃回流反应12h，体系逐渐由浑浊变为澄清。反应结束后将其冷却至室温，EA萃取三次，合并有机相，减压浓缩去除溶剂，粗品通过柱层析纯化(PE：EA＝1:1)得即中间体5‑1。

[0086] 实施例8：中间体5‑2的合成步骤是将中间体5‑1(199mg,1mmol,1eq)置于50mL圆底烧瓶中，加入10mL MeOH溶解，再加入20mg的钯碳和1滴冰醋酸，在氢气下反应24h。反应结束后将钯碳抽滤，收集滤液，减压浓缩至干，得到黄色固体，直接用于下一步。

[0087] 二、目标化合物的合成

[0088] 实施例9：目标化合物BN‑1的合成路线是将中间体1‑2(1mmol,1eq)用无水乙醇溶解，降温至0‑5℃，加入乙基乙酰亚胺盐酸盐(128mg,0.9mmol,0.9eq)，无水碳酸钾(276mg,2mmol,2eq)，搅拌反应4h。反应完成后将溶剂减压浓缩至干，加水，EA萃取三次，合并上层有机相，无水硫酸钠干燥，有机相减压浓缩，得黄色粘稠状液体。产品经快速柱层析(DCM：MeOH
1
＝15:1)得BN‑1 251mg，为白色固体，收率66％。mp 220.2～220.8℃；H NMR(500MHz,DMSO‑d6)δ10.77(s,1H),8.40–8.32(m,1H),8.15(d,J＝7.8Hz,1H),8.07(s,1H),7.99(d,J＝
7.4Hz,1H),7.67(d,J＝8.3Hz,1H),7.63–7.56(m,2H),5.63(dd,J＝7.6,4.0Hz,1H),4.58(s,2H),2.24(s,3H),2.05(tt,J＝9.7,5.2Hz,1H),1.76–1.66(m,1H),1.34–1.23(m,4H),
13
0.88(t,J＝6.9Hz,3H)；C NMR(75MHz,DMSO‑d6)δ170.38,166.13,164.74,145.61,140.60,
136.25,135.09,131.69,129.22,128.20,127.67,126.99,126.24,123.29,115.85,81.54,+ +
45.71,34.04,26.85,22.37,19.16,14.31.HRMS‑ESI(m/z):[M+H]calcd for[C22H26N3O3]
380.19687,found 380.19596,ppm error‑1.95.HPLC:MeOH/H2O(含0.1％ Et3N)＝80:20.[0089] 实施例10：目标化合物CN‑1的合成路线是将BN‑1(379mg,1mmol,1eq)置于50mL烧瓶中，加入15mL无水THF溶解BN‑1，随后加入盐酸羟胺(100mg,1.5mmol)，无水碳酸钾(272mg,2mmol,2eq)。加热至70℃回流反应5h。使用TLC法进行监测，PE:EA＝2:1，Rf值为0.5～0.6。原料反应完全，使用少量EA萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩至干，得CN‑1粗品。利用柱层析(PE：EA＝2:1)纯化粗品，得CN‑1 300mg，为白色固体，收率76％。mp + 1
195.2～195.9℃；MS(m/z):418[M+Na]；H NMR(300MHz,DMSO‑d6)δ10.58(s,1H),8.98(s,
1H),8.30(s,1H),8.07(d,J＝8.2Hz,1H),7.85(s,2H),7.65(d,J＝8.4Hz,1H),7.51(d,J＝
5.3Hz,2H),5.62(d,J＝5.9Hz,1H),4.26(dd,J＝40.6,6.1Hz,2H),2.00(d,J＝18.3Hz,1H),
13
1.66(s,1H),1.33–1.22(m,4H),0.85(d,J＝7.1Hz,3H)；C NMR(75MHz,DMSO‑d6)δ170.37,
166.40,145.58,141.40,140.55,135.16,130.66,129.05,126.96,126.82,126.65,126.28,+
123.32,115.87,81.54,45.46,34.05,26.86,22.37,14.87,14.30.HRMS‑ESI(m/z):[M+H]+
calcd for[C22H26N3O4]396.19178,found 396.19170,ppm error 0.39.HPLC.MeOH/H2O＝
80:20.

[0090] 实施例11：目标化合物BN‑2的合成路线是将中间体1‑2(1mmol,1eq)溶解在无水乙醇中，降温至5℃左右，加入乙基乙酰亚胺盐酸盐(128mg,0.9mmol,0.9eq)，无水碳酸钾(276mg,2mmol,2eq)，搅拌反应4h。完全反应后处理方式同BN‑1，得黄色粘稠状液体。产品经快速柱层析(DCM：MeOH＝15:1)得BN‑2 151mg，为白色固体，收率41％。mp 189.3～189.8℃1
；H NMR(400MHz,Methanol‑d4)δ8.32(d,J＝1.9Hz,1H),8.03–7.96(m,2H),7.89(t,J＝
2.0Hz,1H),7.65(t,J＝7.9Hz,1H),7.57(d,J＝8.3Hz,1H),7.50(dd,J＝7.9,2.2Hz,1H),
5.56(dd,J＝7.7,4.0Hz,1H),2.39(s,3H),2.09(dd,J＝9.6,4.5Hz,1H),1.77–1.69(m,1H),
13
1.40–1.30(m,4H),0.91(t,J＝7.0Hz,3H). C NMR(126MHz,Methanol‑d4)δ130.56,127.13,
124.69,122.51,116.52,81.98,48.53,48.19,48.02,47.85,47.68,47.51,47.34,47.17,+ +
33.99,26.63,22.12,20.75,18.13,12.87.HRMS‑ESI(m/z):[M+H]calcd for[C21H24N3O3]
366.18122,found 366.18073,ppm error‑0.88.HPLC.MeOH/H2O(含0.1％ Et3N)＝80:20.[0091] 实施例12：目标化合物CN‑2的合成路线是将BN‑2(365mg,1mmol,1eq)置于50mL圆底烧瓶中，加入15mL无水THF，随后加入盐酸羟胺(100mg,1.5mmol,1.5eq)，无水碳酸钾(272mg,2mmol,2eq)。加热至70℃回流反应5h。使用TLC法进行监测，PE:EA＝1:1，Rf值为0.5～0.6。反应结束后，加入EA萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，有机层减压浓缩至干，得CN‑2粗品。利用柱层析纯化粗品(PE：EA＝1:1)得CN‑2 300mg，为淡黄色油状物，收率
1
76％。H NMR(300MHz,Methanol‑d4)δ8.25(d,J＝2.0Hz,1H),8.01(dd,J＝8.3,2.0Hz,1H),
7.71–7.64(m,2H),7.54(d,J＝4.9Hz,1H),7.43(s,1H),7.33(d,J＝6.2Hz,1H),5.56–5.51(m,1H),2.05(d,J＝6.5Hz,1H),1.95(d,J＝3.2Hz,3H),1.77–1.68(m,1H),1.35–1.29(m,
13
4H),0.90(t,J＝3.9Hz,3H)；C NMR(75MHz,Methanol‑d4)δ171.12,150.01,146.05,
135.47,129.09,126.94,126.73,126.26,122.89,122.30,116.34,81.89,47.36,47.08,+ +
46.79,34.00,26.68,22.11,14.56,12.92.HRMS‑ESI(m/z):[M+H]calcd for[C21H24N3O4]
382.17613,found 382.17624,ppm error1.18.HPLC.MeOH/H2O＝80:20.

[0092] 实施例13：目标化合物BN‑3的合成路线是将中间体2‑2(1mmol,1eq)溶解在无水乙醇中，降温至0～5℃，少量多次加入称好的乙基乙酰亚胺盐酸盐(128mg,0.9mmol,0.9eq)，无水碳酸钾(276mg,2mmol,2eq)，此温度下搅拌反应4h。反应结束，将溶剂减压浓缩至干，加水，EA萃取三次，合并有机相，有机层减压浓缩至干，得黄色粘稠状液体。产品经快速柱层析1
(DCM：MeOH＝15:1)得BN‑3 131mg，为淡黄色固体，收率37％。mp 185.2～185.7℃；H NMR(300MHz,Methanol‑d4)δ7.46(d,J＝0.7Hz,2H),7.35(s,1H),7.25(d,J＝8.4Hz,1H),7.21(d,J＝2.0Hz,1H),7.08(d,J＝2.3Hz,1H),6.80(d,J＝2.2Hz,1H),5.39(dd,J＝7.5,4.0Hz,
1H),4.44(s,2H),2.38(s,3H),1.99(s,1H),1.62(s,1H),1.32–1.28(m,4H),0.88(d,J＝
13
3.6Hz,3H)；C NMR(75MHz,Methanol‑d4)δ134.12,130.22,127.38,123.57,123.51,
122.26,120.85,81.97,47.37,47.09,46.80,46.38,34.28,26.61,22.13,17.91,
+ +
12.91.HRMS‑ESI(m/z):[M+H]calcd for[C21H26N3O2] 352.20195,found 352.20126,ppm error‑1.54.HPLC.MeOH/H2O(含0.1％ Et3N)＝80:20.

[0093] 实施例14：目标化合物CN‑3的合成路线是将BN‑3(351mg,1mmol,1eq)置于茄形瓶中，加入15mL无水THF完全溶解，随后加入盐酸羟胺(100mg,1.5mmol,1.5eq)，无水碳酸钾(272mg,2mmol,2eq)。加热至70℃回流反应5h。使用TLC法进行监测，PE:EA＝1:2，Rf值为0.5～0.6。原料反应完全，使用EA萃取三次，合并有机相，溶剂减压浓缩至干，得CN‑3粗品。柱层1
析纯化粗品(PE：EA＝1:2)得CN‑3 280mg，为淡黄色油状物，收率76％。H NMR(300MHz,Methanol‑d4)δ7.25–7.19(m,2H),7.09(d,J＝2.1Hz,2H),6.99(d,J＝2.3Hz,1H),6.96(dd,J＝2.4,1.1Hz,1H),6.83(d,J＝2.2Hz,1H),5.37(dd,J＝7.5,4.0Hz,1H),4.34(s,2H),
1.98–1.94(m,1H),1.77(s,3H),1.60(d,J＝4.6Hz,1H),1.25(s,4H),0.89–0.86(m,3H)；13C NMR(75MHz,Methanol‑d4)δ149.83,122.90,122.24,122.08,120.56,105.20,81.88,47.32,+
47.04,46.75,46.56,34.28,29.37,26.57,22.12,14.42,12.88.HRMS‑ESI(m/z):[M+H]+
calcd for[C21H26N3O3]368.19687,found368.19612,ppm error‑1.61.HPLC.MeOH/H2O＝80:
20.

[0094] 实施例15：目标化合物BN‑4的合成路线是将中间体2‑2(1mmol,1eq)溶解在无水乙醇中，5℃下，加入乙基乙酰亚胺盐酸盐(128mg,0.9mmol,0.9eq)，无水碳酸钾(276mg,2mmol,2eq)，此温度下搅拌反应4h。反应结束，溶剂减压浓缩，加水，EA萃取三次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，有机层减压浓缩至干，得淡黄色固体。柱层析纯化(DCM：MeOH＝14:1)
1
得BN‑4 310mg，为淡黄色固体，收率85％。mp210.8～211.5℃；H NMR(300MHz,Methanol‑d4)δ7.35(d,J＝1.3Hz,3H),7.23(d,J＝2.1Hz,2H),7.02(dd,J＝8.4,2.2Hz,1H),6.78(d,J＝
2.2Hz,1H),5.36(dd,J＝7.6,4.0Hz,1H),4.41(s,2H),4.37(s,2H),2.21(s,3H),1.95(s,
13
1H),1.60(s,1H),1.27(d,J＝3.4Hz,4H),0.86(d,J＝2.3Hz,3H). C NMR(75MHz,Methanol‑d4)δ149.86,140.51,138.74,134.67,128.93,126.86,126.35,126.33,122.12,120.76,
104.85,81.91,47.35,47.07,46.78,46.69,45.81,34.30,26.63,22.13,17.51,
+ +
12.91.HRMS‑ESI(m/z):[M+H]calcd for[C22H28N3O2] 366.21760,found 366.21678,ppm error‑1.87.HPLC MeOH/H2O(含0.1％Et3N)＝80:20.

[0095] 实施例16：目标化合物CN‑4的合成路线是将BN‑4(365mg，1mmol,1eq)置于茄形瓶中，加入15mL无水THF使其完全溶解，随后加入盐酸羟胺(100mg，1.5mmol,1.5eq)，无水碳酸钾(272mg,2mmol,2eq)。加热至70℃回流反应5h。使用TLC法进行监测，PE:EA＝1:2，Rf值为0.5～0.6。原料反应完全，使用EA萃取方法同CN‑1，得CN‑4粗品。柱层析纯化粗品(PE：EA＝
1
1:3)得CN‑4 295mg，为白色固体，产率77％。mp 199.5～199.8℃；H NMR(300MHz,Methanol‑d4)δ7.32(s,1H),7.27(t,J＝1.8Hz,2H),7.22(d,J＝8.3Hz,1H),7.17(d,J＝
2.5Hz,1H),7.02(dd,J＝8.3,2.2Hz,1H),6.85(d,J＝2.2Hz,1H),5.35(s,1H),4.34(d,J＝
1.9Hz,4H),1.95(d,J＝1.5Hz,1H),1.77(s,3H),1.63(d,J＝2.2Hz,1H),1.33(d,J＝5.5Hz,
13
4H),0.90(d,J＝4.2Hz,3H). C NMR(75MHz,Methanol‑d4)δ140.12,139.86,138.63,
128.58,125.83,125.19,125.01,122.07,120.53,105.15,81.87,47.36,47.07,46.92,+
46.79,45.27,34.31,26.65,22.14,13.11,12.93.HRMS‑ESI(m/z):[M+H] calcd for+
[C22H28N3O3]382.21252,found 382.21177,ppm error‑1.62.HPLC MeOH/H2O＝80:20.[0096] 实施例17：目标化合物PMN的合成路线是将中间体3‑1(208mg,1mmol,1eq)和6‑NH2‑NBP(205mg,1mmol,1eq)置于25mL圆底烧瓶中，加入5mL DMF作为溶剂，完全溶解反应物。然后加入N,N,N',N'‑四甲基氯甲脒六氟磷酸盐(420mg，1.5mmol,1.5eq)，N‑甲基咪唑(288mg，3.5mmol,3.5eq)。加入完毕后，放置25℃搅拌反应24h。经过TLC(展开剂PE：EA＝3：
1)监测反应结束，加水，EA萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥。有机层减压浓缩至干，柱层析纯化粗品(PE：EA＝1:2)得PMN 288mg，为淡黄色固体，收率68％。mp 154.8～155.2
1
℃；H NMR(300MHz,DMSO‑d6)δ10.80–10.51(m,1H),7.73(d,J＝98.3Hz,6H),5.58(s,1H),
13
4.89(d,J＝16.3Hz,1H),2.25–2.14(m,2H),1.25(s,4H),0.85(s,3H). C NMR(75MHz,Methanol‑d4)δ160.45,156.68,129.26,122.55,122.35,116.37,115.21,81.89,47.34,+ +
47.06,46.77,26.61,22.08,12.85,8.90.HRMS‑ESI(m/z):[M+Na]calcd for[C23H23N3O5Na]
444.15299,found 444.15299,ppm error 0.03.HPLC MeOH/H2O＝80:20.

[0097] 实施例18：目标化合物PMK的合成路线是将中间体4‑1(218mg,1mmol,1eq)和6‑NH2‑NBP(205mg,1mmol,1eq)和置于烧瓶中，加入10mL无水乙醇使其溶解。加热至80℃回流反应0.5h，生成淡黄色固体，反应结束将其放至室温，在红外灯下过滤、干燥，得亚胺中间体。将此化合物溶解在MeOH中，降温至5℃，缓慢加入硼氢化钠(76mg,2mmol,2eq)，TLC(展开剂PE：EA＝3：1)监测反应结束，加水猝灭反应，EA萃取，纯化方法同BN‑1 245mg，得到黄色固1
体，收率60％。mp 134.8～135.2℃；H NMR(500MHz,Methanol‑d4)δ7.42(s,2H),7.34–7.28(m,2H),7.23(d,J＝2.0Hz,1H),7.07(dd,J＝8.3,2.2Hz,1H),6.85(d,J＝2.2Hz,1H),5.45(dd,J＝7.6,4.1Hz,1H),4.45(s,2H),2.10(s,3H),2.05(d,J＝1.7Hz,1H),1.76–1.68(m,
13
1H),1.40(dt,J＝6.0,2.3Hz,4H),0.96(d,J＝5.2Hz,3H). C NMR(75MHz,DMSO‑d6)δ
171.05,159.46,158.07,150.35,143.90,137.88,135.31,129.13,126.65,126.62,126.07,
125.48,123.09,121.25,107.46,81.29,63.01,56.49,45.33,34.53,26.84,22.39,19.02,+ +
14.31,13.97,10.63.HRMS‑ESI(m/z):[M+Na]calcd for[C23H25N3O4Na]430.17373,found 
430.17324,ppm error‑0.83.HPLC MeOH/H2O＝80:20.

[0098] 实施例19：目标化合物BN‑0的合成路线是将6‑NH2‑NBP(205mg,1mmol,1eq)置于50mL圆底烧瓶中，加入20mL无水乙腈使其完全溶解，随后缓慢滴加1mL浓盐酸。加热至83℃回流反应5h，反应由无色变为浅黄色，使用TLC法进行监测，PE:EA＝1:1，Rf值为0.5～0.6。
原料反应完全，反应结束，使用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，再分别用饱和碳酸氢钠洗，水洗两遍，和食盐水洗涤一遍，无水硫酸钠干燥，有机层减压浓缩至干，得BN‑0粗品。将粗品经快速柱层析(PE：EA＝1:1)得BN‑0 185mg，为淡黄色固体，收率75％。mp 173.2～173.8℃
1
；H NMR(300MHz,DMSO‑d6)δ9.70(s,1H),7.81–7.73(m,2H),7.66(dd,J＝8.1,1.9Hz,1H),
5.67(dd,J＝7.8,3.9Hz,1H),2.35(s,3H),2.06(dq,J＝14.2,4.9Hz,1H),1.72(s,1H),1.31(q,J＝6.3Hz,4H),0.87–0.81(m,3H)；13C NMR(75MHz,DMSO‑d6)δ169.54,165.27,149.98,
135.80,132.02,127.29,124.86,122.37,81.77,45.75,33.87,26.90,22.35,19.41,+ +
14.28.HRMS‑ESI(m/z):[M+H]calcd for[C14H19N2O2] 247.14465,found 247.14227,ppm error 8.61.HPLC MeOH/H2O(含0.1％ Et3N)＝80:20.

[0099] 实施例20：目标化合物CN‑0的合成路线是将BN‑0(246mg,1mmol,1eq)加入50mL圆底烧瓶中，加入15mL无水THF使其完全溶解，随后加入盐酸羟胺(100mg,1.5mmol,1eq)，无水碳酸钾(272mg,2mmol,2eq)。放置在室温下搅拌5h。使用TLC法进行监测，PE:EA＝1:1，Rf值为0.5～0.6。原料反应完全，使用EA萃取，萃取方法同BN‑0，减压浓缩，得CN‑0粗品。将粗品柱层析纯化(PE：EA ＝1:1)得到CN‑0 150mg，为白色固体，收率57％。mp 188.6～189.3℃；+ 1
MS(m/z):285[M+Na]；H NMR(300MHz,Methanol‑d4)δ7.50–7.46(m,2H),5.51(dd,J＝7.7,
4.0Hz,1H),2.04(s,1H),1.93(s,3H),1.68(d,J＝3.6Hz,1H),1.34(dd,J＝4.8,1.8Hz,4H),
13
0.88(d,J＝2.7Hz,3H)；C NMR(75MHz,Methanol‑d4)δ171.00,145.74,140.73,129.54,
126.62,122.70,121.63,118.10,81.91,47.41,47.13,46.84,34.03,26.73,22.12,14.62,+ +
12.97.HRMS‑ESI(m/z):[M+H]calcd for[C14H19N2O3] 263.13902,found 263.13801,ppm error‑3.78.HPLC.MeOH/H2O＝80:20.

[0100] 实施例21：目标化合物CH‑1的合成路线是将中间体5‑2(203mg,1mmol,1eq)溶解在无水乙醇中，5℃，加入乙基乙酰亚胺盐酸盐(128mg,0.9mmol,0.9eq)，无水碳酸钾(276mg，2mmol,2eq)，此温度下搅拌4h。反应结束，将甲醇减压浓缩至干，加水，乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，有机层减压浓缩至干，得淡黄色固体。产品经快速柱层析(DCM：MeOH＝8:1)得CH‑1 110mg，为淡黄色固体，收率45％。mp 167.2～167.8℃；MS(m/z):
+ 1
267[M+Na]；H NMR(300MHz,Methanol‑d4)δ7.77(d,J＝8.5Hz,2H),7.34–7.29(m,2H),4.41(s,2H),3.33(s,2H),2.24(s,3H),2.10(s,3H).13C NMR(75MHz,DMSO‑d6)δ127.19,120.35,+
47.69,47.41,47.13,46.84,46.56,46.27,45.99.HRMS‑ESI(m/z):[M+H] calcd for+
[C13H17N4O]245.13969,found245.13961,ppm error‑0.14.HPLC MeOH/H2O＝80:20.[0101] 实施例22：目标化合物CH‑2的合成路线是将1‑(4‑羧基苯基)‑3‑甲基‑5‑吡唑酮(218mg,1mmol,1eq)和1400W(177mg,1mmol,1eq)置于茄形瓶中，加入5mL DMF作为溶剂，完全溶解反应物。然后加入N,N,N',N'‑四甲基氯甲脒六氟磷酸盐(420mg，1.5mmol,1.5eq)，N‑甲基咪唑(288mg，3.5mmol,3.5eq)。加入完毕后，放置室温搅拌24h。TLC监测反应结束后，加H2O，EA萃取三次，合并有机层，无水硫酸钠干燥。有机层减压浓缩至干，产品经快速柱层析+ 1
(PE：EA＝1:1)得CH‑2 151mg，为淡黄色油状物，收率40％。MS(m/z):400[M+Na] ；H NMR(300MHz,Methanol‑d4)δ8.23(d,J＝1.9Hz,1H),8.20(d,J＝2.1Hz,1H),8.06(d,J＝4.7Hz,
2H),7.63(d,J＝1.5Hz,3H),7.52(dd,J＝6.0,2.3Hz,1H),4.85(d,J＝2.9Hz,2H),4.71(s,
13
2H),3.24(s,2H),2.50(s,3H),2.50(s,3H). C NMR(75MHz,Methanol‑d4)δ168.77,164.63,
139.00,131.09,129.43,129.23,128.49,121.71,121.14,120.26,118.92,20.06,18.25,
17.66,14.09,13.64,8.32.HPLC.MeOH/H2O＝80:20.

[0102] 三、效果验证

[0103] 实施例22：体外对OGD/R诱导的SH‑SY5Y细胞、Eahy‑926细胞和BV‑2细胞存活率研究

[0104] 1、实验方法

[0105] a.细胞消化、计数、配制成浓度为5×104个/mL的细胞悬液于96孔细胞培养板中，每孔加入100μL细胞悬液；

[0106] b.将96孔细胞培养板置于37℃，5％ CO2培养箱中培养24h；

[0107] c.用条件培养基稀释药物至所需浓度，每孔加入100μL相应的含药培养基，同时设立阴性对照组；

[0108] d.将96孔细胞培养板置于37℃，5％ CO2培养箱中培养24h；

[0109] e.将培养基更换为不含葡萄糖与血清的DMEM培养基，将细胞置于5％ CO2、95％ N2环境中培养2h，随后将培养基更换为完全DMEM培养基，并置于含有5％CO2、95％ O2环境中培养24h；

[0110] f.将96孔板进行CCK‑8染色，λ＝450nm，测定OD值；A.每孔加入10μL CCK‑8，在培养箱继续培养2h；B.摇床10min轻轻混匀；C.λ＝450nm，酶标仪读出每孔的OD值，计算抑制率。

[0111] 2、实验结果

[0112] 如图2所示，在SH‑SY5Y细胞中，OGD/R模型组细胞存活率明显降低，随着NBP，6‑NH2‑NBP和1400W的加入，细胞存活率较OGD/R组显著升高。在1μM浓度下，CN‑2较NBP或6‑NH2‑NBP组相比细胞存活率均有升高；在10μM浓度下，BN‑4、CN‑1、CN‑2、CN‑4、CH‑1和PMK较NBP或6‑NH2‑NBP组相比细胞存活率也有显著升高。在Eahy‑926细胞和BV‑2细胞中，OGD/R模型组细胞存活率明显降低，随着NBP和1400W的加入，细胞存活率较OGD/R组显著升高。受试化合物组均能提高细胞存活率，其中BN‑4效果最佳与NBP有相似的活性，在两种细胞中以1μM和
10μM浓度均能提高细胞存活率。

[0113] 实施例23：细胞和酶水平iNOS抑制活性评价

[0114] 1、实验方法

[0115] A、细胞水平iNOS抑制活性评价

[0116] 将RAW 264.7细胞以每孔2×104个细胞的密度与100μL培养基接种到黑色96孔培养板中，并孵育24小时。然后将细胞用化合物预处理1小时，然后用LPS(1μg/mL)刺激6小时。除去培养物上清液，并将100μL的NOS测定缓冲液添加至每个孔。然后将100μL NOS分析反应溶液(5％0.1mM NADPH，0.2％DAF‑FM DA，39.8％MilliQ水，50％NOS分析缓冲液，5％L‑精氨酸溶液)添加到每个孔中并在37℃下孵育2小时。用荧光板读数器(Bio‑Tek)在495nm的激发和515nm的发射下测量荧光。

[0117] B、酶水平iNOS抑制活性评价(血红蛋白捕获法)

[0118] a.在96孔板中加入20μL待测物缓冲液[化合物(4μM‑50nM)+HEPES缓冲液原液(100mM)]在37℃的孵化器中将平板加热约30分钟

[0119] b.将10μΜ的L‑精氨酸加入到HEPES缓冲液(100mM，10％甘油，pH 7.4)，该缓冲液中还含有100μM的NADPH、10μM的四氢生物蝶呤和人氧合血红蛋白4μM。

[0120] c.在板的每一孔中加入210uL完全混合物，使其保持在37℃。

[0121] d.每孔快速加入20μL的iNOS稀释液，并将平板与孵化轨道振荡器混合15s。

[0122] e.将平板放入读数器(预热至37℃)，然后开始读取数据。

[0123] f.通过在37℃下使用双波长动态版读取器读取401nm吸光度来跟踪反应。进行动态读数3‑5分钟。

[0124] g.用GraphPad Prism软件进行非线性回归计算IC50值(标准误差值由LogIC50计算得出)，并用cheng‑Prusoff方程[Ki＝IC50/(1+[S]/Km)]计算KI值。

[0125] 2、实验结果

[0126] 如图3细胞实验结果显示，化合物BN‑4、化合物CN‑1到CN‑4，以及化合物CH‑2均能够显著抑制Raw 264.7细胞中NO生成，说明其具有一定的iNOS抑制活性。表1酶水平实验结果显示，化合物BN‑4对iNOS的IC50值为0.1707μM在系列化合物中最优，且与阳性对照1400W基本相同。

[0127] 表1化合物BN‑1～PMN对iNOS的IC50

[0128]

[0129]

[0130] 实施例24：单次给药对tMCAO脑缺血模型大鼠的脑梗死面积和神经功能恢复评价[0131] 1、实验方法

[0132] A.大鼠tMACO模型制备：为了制造栓塞模型需要选择直径为0.234mm的尼龙线，并且要将尼龙线的顶端弄得粗一些，烧烫成直径为0.35mm左右的光滑圆球，用马克笔在距离顶端20mm左右的位置做标记，75％酒精清洁，放置到2500U/mL的肝素生理盐水准备使用。使用气体麻醉机麻醉大鼠(麻药剂量不宜使用过大，防止大鼠过度麻醉死亡)，将大鼠头朝上固定在实验台上，在颈部正中间切口，手术剪切开皮肤，小心撕开皮肤组织，找到大鼠颈部的血管。首先要找到右颈总动脉(CCA)，使用手术线备用向上分离右颈外动(ECA)和颈内动脉，两头结扎，剪断甲状腺上动脉及枕动脉两条颈外动脉分支，在近CCA分叉约六毫米附近双重结扎ECA，在右侧颈总动脉的近心端用微动脉夹夹住血管，在右颈外动脉近分叉处留置一个活口(未收紧的活结)，在ECA近端结扎处与颈总动脉分叉处之间做一直径约0.2mm的V型微切口，将尼龙线头自切口处轻轻插入，轻轻收紧线结，将颈内动脉于两结扎线间剪断，使之与颈内动脉方向一致松开动脉夹，将尼龙线顺ECA经ICA送入颅内，插入深度约18mm～20mm微遇阻力时停止，使尼龙线头端位于MCA起始处，阻断MCA 的血流收紧丝线，缝合切口，留置尼龙线尾端于体外。缺血2h后，将造模大鼠使用气麻机麻醉，为了进行缺血后的再灌注，需要使尼龙线顶部重新回到微切口处。用手术钳轻轻拉动尼龙线使头端归位，可以感受到轻微阻力感。此时大鼠大脑中动脉血流供应恢复，MCAO大鼠造模完成。此时将提前配好的药物立即进行尾静脉注射给药。

[0133] B.检测指标：

[0134] a.脑梗死体积的测定(TTC染色法)：大鼠tMCAO造模后，24h或72h后，将大鼠通过麻醉处死，解剖头部取出脑组织快速放在冰箱保鲜层中制冷15min后取出，目的是使大脑变硬利于切片。将大脑均匀厚度切成5片后，迅速将脑片放在提前配好的5mL 含有2％ TTC的PBS缓冲溶液中，用锡纸包住放入烘箱中37℃温孵15min，在这个过程中每隔2分钟左右翻动一次，目的是使脑片染色均匀。温孵15min后取出脑片，选择黑色或蓝色背景对脑片进行拍照，之后用眼科镊分离苍白区(梗塞区)和非苍白区(正常区)，通过Image pro‑plus 6.0计算梗塞百分比如下：

[0135] 梗塞百分比(％)＝苍白区面积/(苍白区面积+非苍白区面积)×100％

[0136] 梗死面积抑制率(％)＝模型组梗塞百分比(％)‑给药组梗塞百分比(％)/模型组梗塞百分比(％)×100

[0137] b.Longa神经功能评级：造模前，再灌注给药后2h、24h，根据Longa’s法对动物的神经功能缺陷进行分级评分，标准如下：

[0138] 0分：神经功能正常；

[0139] 1分：轻度神经功能缺损：提尾时，动物的左前肢屈曲；

[0140] 2分：中度神经功能缺损：将动物置于光滑平面上行走，行走时向左侧转圈；

[0141] 3分：中度神经缺损：静止状态下，向左侧倾斜；

[0142] 4分；意识减退，肢体无自发活动；

[0143] 5分：对刺激无应答或死亡。

[0144] C.tMCAO模型的入选及排除标准

[0145] 入选标准：Longa评分在1‑3分者入组；

[0146] 排除标准：Longa评分低于1分及评分高于3分者；取脑时发现并发蛛网膜下腔出血者；TTC染色未见缺血灶者；缺血再灌注72h内死亡者。

[0147] 统计方法：神经功能缺陷分级评分数据采用中位数表示，其余数据均以Mean±SD表示；神经功能缺陷分级评分数据组间统计学差异采用Kruskal‑Wallis检验和MannWhitney U检验，其余数据组间统计学差异采用One‑way ANOVA 和Tukey’s检验，P值小于0.05认为有显著性差异。

[0148] 2、实验结果

[0149] 我们挑选了在细胞水平和酶水平表现较好的部分化合物进行了单次给药体内实验，各组化合物按照NBP 5mg/kg等摩尔剂量给药。如图4所示，与模型组相比，各组化合物均可显著降低tMCAO模型诱导的脑梗死体积。模型组平均脑梗死面积为44.29％，BN‑1(9.98mg/kg)，CN‑1(10.41mg/kg)，BN‑4(9.61mg/kg)，CN‑4(10.03mg/kg)，CH‑1(6.42mg/kg)，NBP(5mg/kg)，1400W(6.58mg/kg)和NBP+1400W(5mg/kg+6.58mg/kg)组分别为24.34％，25.97％，20.96％，25.62％，29.14％，28.54％，30.98％，25.51％，如图所示。其中BN‑4活性最优，脑梗死体积抑制率为51.19％，高于BN‑1组(45.04％)、CN‑1组(41.36％)、CN‑4组(42.15％)和CH‑1组(34.20％)。并且BN‑4组也优于NBP(35.58％)、1400W(30.05％)的单独和联合给药组(42.40％)。在缺血后2h，26h，对各组进行神经行为学评分，在缺血后24h，BN‑
1、CN‑1、BN‑4、CN‑4、CH‑1和NBP组、NBP+1400W联合给药组均可显著改善大鼠神经功能学评分。其中BN‑4组效果最为显著(P<0.0001vs MCAO group)，优于等摩尔BN‑1、CN‑1、CN‑4、CH‑
1组以及NBP和1400W单独或联合给药组。

[0150] 实施例25：多次给药对tMCAO脑缺血模型大鼠的脑梗死面积和神经功能恢复评价[0151] 1、实验方法

[0152] 基本同实施例24，缺血后2h，24h和48h分别给药三次。

[0153] 神经功能评分：A.mNSS B.角落试验

[0154] A.mNSS：用mNSS评定tMCAO模型缺血后24，72h的神经功能状况。评分为0～14分，包括运动、感觉、反射和平衡测试，正常状态评分为0分，最大缺陷评分为14分。累计评分10～14分，5～9分，1～4分，分别为重度、中度和轻度损伤。

[0155] B.角落试验：目的是评价大鼠感觉运动功能。在大鼠缺血24，72小时后进行这个测试。该测试提前准备两块木板(35cm×25cm×1.2cm)，将木板的一边连接到一起，是它们夹角为锐角不超过35°。在木板连接处留一个小口，用于透光吸引大鼠往角落爬行。将大鼠放置于木板开口前，头部面向木板。让大鼠进入角落，身旁两侧的木板会刺激大鼠转身面对开口侧。每次试验重复10次，记录大鼠左转的次数。如果是健康非急性脑缺血大鼠，其左转和右转的几率基本会相等，但如果是缺血大鼠则转向健康一侧的几率增高。计算CT分数R/10％。

[0156] 2、实验结果

[0157] 基于BN‑4在单次给药tMCAO模型中优异的表现，我们通过多次给药来进一步评价BN‑4在体内水平的药效。如图5所示，模型组平均脑梗死面积为35.64％，BN‑4(9.61mg/kg)和NBP(5mg/kg)组分别为16.62％和23.30％。与模型组相比，BN‑4和NBP均可显著降低tMCAO模型诱导的脑梗死，其中BN‑4活性最优，脑梗死体积抑制率为53.68％，高于NBP组(38.21％)具有显著性差异，说明与NBP相比化合物BN‑4具有较好的脑梗死抑制作用。在缺血再灌注后24h，72h，对各组进行mNSS和角落试验评分。在缺血后24h，BN‑4给药组可显著改善大鼠mNSS行为学和角落试验评分，优于化合物NBP组。在缺血后72h，BN‑4组和NBP组均可显著改善大鼠mNSS行为学和角落试验评分，仍优于化合物NBP。

[0158] 实施例26：体外稳定性实验和水溶性

[0159] 1、实验方法

[0160] A.大鼠血浆和肝微粒体稳定性实验

[0161] 将受试化合物配置成终浓度200μM，含1％ DMSO/大鼠血浆溶液，置于37℃摇床下孵育，分别于0，0.5，1，1.5，2，3，4，6，8，12和24h下取样并进HPLC分析，观察原化合物降解情况，实验重复进行三次。将受试化合物配置成终浓度200μM，含1％DMSO/PBS溶液，加入相应比例的大鼠肝微粒体，有机相比例不得超过1％，置于37℃摇床下孵育，分别于0,10,30,60和120min下取样并进HPLC分析，观察原化合物降解情况，实验重复进行三次。

[0162] B.水溶性实验

[0163] 为确定化合物的水溶性，将其溶解在不同浓度的蒸馏水中，并使用高效液相色谱法建立标准曲线。当无法完全溶解时，就可确定化合物在水中的最大溶解度。

[0164] 2、实验结果

[0165] 鉴于BN‑4在大鼠体内展现出最佳的抗脑梗死、和改善神经功能学评分效果，故将其选做优选化合物进行深入研究。首先测试BN‑4在大鼠血浆和肝微粒体中稳定性情况，结果如图6所示，BN‑4在大鼠血浆或肝微粒体中缓慢降解，在大鼠血浆中半衰期约为23h，在肝微粒体中半衰期大于120min，提示BN‑4在体外相对稳定。此外，如图7所示与NBP相比，BN‑4表现出优异的水溶性。通过HPLC进行的溶解度测试结果显示，NBP在水中的溶解度为0.25mg/mL，而BN‑4在水中的溶解度为30mg/mL，具有超过100倍的提升。

[0166] 实施例27：化合物BN‑4大鼠体内药代动力学

[0167] 1、实验方法

[0168] 所选化合物在SD大鼠体内进行药代动力学研究。通过静脉方式给药大鼠(230‑250g，每个时间点3只动物)BN‑4(10mg/kg)和1400W(6.8mg/kg)。分别于静脉注射剂量后
0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、24h收集血液样本(1.0mL)，放入含肝素钠的离心管中，4℃离心分离血浆。血浆样品通过加入含有通用内标(卡马西平)的乙腈提取。样品在4℃下以12,
000转/分离心20分钟，收集上清液并进行分析。采用高效液相色谱法测定血浆中化合物的浓度，采用WinNonlin软件进行非房室法分析。

[0169] 2、实验结果

[0170] 为了进一步研究BN‑4在体内的药代动力学情况，我们研究了经静脉注射后BN‑4在全血中的药代动力学参数，并将其与1400W进行了比较。实验结果表明，BN‑4的Cmax、AUC0‑∞分‑1 ‑1别为11.21±2.85nmol·mL 和16.47±1.27h·nmol·mL ，均高于1400W(9.81±
‑1 ‑1
2.85nmol·mL 和5.07±0.38h·nmol·mL )。这表明，与静脉注射1400W相比，BN‑4具有更高的体内分布量，可能带来更好的治疗效果。此外，BN‑4的T1/2、MRT0‑t和MRT0‑∞分别为5.21±‑1 ‑1 ‑1 ‑1
0.46h、1.62±0.36mL·h ·kg 和1.91±0.49mL·h ·kg ，均高于1400W的T1/2(2.79±
‑1 ‑1 ‑1 ‑1
0.13h、0.96±0.19mL·h ·kg 、1.11±0.22mL·h ·kg )，表明BN‑4与1400W相比具有更长的血液滞留时间。最后，我们研究了BN‑4和1400W的血脑分布。在相同摩尔浓度下，BN‑4和
1400W的血脑比分别为27.36％和10.96％，表明BN‑4具有更好的透过血脑屏障的能力(表
2)。

[0171] 表2 1400W和BN‑4在SD大鼠静脉给药后全血中的药代动力学参数(n＝3)

[0172]