[0001] 本发明涉及生物发酵领域，尤其涉及一种双菌发酵红茶滤液的制备工艺及其产物和应用。

[0002] 随着国民经济和生活水平的提升，消费者对于化妆品的要求越来越高，而业内部分核心化妆品原料为国际厂商垄断；新化妆品原料的开发，功效的探究成为化妆品领域的难题。

[0003] 依托于中国特有的植物资源，植物提取物是化妆品领域原料挖掘的热门途径。但是受限于植物的结构特殊性，植物提取仍存在着提取工艺繁琐，但提取到的活性物含量低，有效成分稳定性差等问题。而近些年来，微生物发酵技术的开发为化妆品原料提供了一条全新思路，利用微生物中含有的生物酶等，可以对植物中的有效物质进行深层提取，有效保留活性成分。但是微生物本身的生物活性也决定了微生物发酵技术存在不可避免的不稳定性，在微生物发酵过程中需要控制菌株的稳定性、提取成分的稳定性，这在目前的技术水平下仍很难做到，使得现有的微生物发酵技术仍存在着有效成分含量低，效果不显著，功效不够全面，难以量产等问题。

[0004] 中国专利CN115569096B公开了一种山茶花发酵滤液及发酵工艺，通过乳酸菌对山茶花进行发酵培养，最终得到抗氧化性能显著的山茶花发酵滤液。中国专利CN116211766A公开了一种红茶发酵产物及其应用，通过酵母菌、醋酸菌、乳酸杆菌中的至少一种对红茶进行发酵，制得修护作用强的红茶发酵产物。中国专利CN115105452B公开了一种红茶发酵滤液及其制备方法和应用，制得一种抗衰老、抗炎、抗氧化的红茶发酵滤液，但是该技术涉及传代培养，对工艺要求极高，实用性差。这些现有技术均未有效解决上述技术问题。

[0005] 基于此，开发一种便于实施、功效显著、配方相容性好的发酵原料，成为迫在眉睫的技术问题。

[0057] 注：对于实施例中有氧环境的氧含量不做特别限定。

[0058] 实施例1.一种双菌发酵红茶滤液的制备工艺，所述双菌发酵红茶滤液的具体制备步骤包
括：
S1. 制备红茶茶叶粉；
S2. 制备发酵培养基；
S3. 制备种子液；
S4. 接种发酵培养；
S5. 收集滤液，得发酵产物；
所述S3步骤中种子液包括木醋杆菌种子液和酵母菌种子液。

[0059] 所述S1步骤包括：将晒干的红茶叶用破碎机破碎、碾磨得到红茶粗粉，再用40目的茶罗对红茶粗粉进行过筛，得到红茶茶叶粉。

[0060] 所述红茶叶具体为古树红茶叶（滇红茶的一种）。

[0061] 所述S2步骤中发酵培养基的成分包括：红茶茶叶粉30g/L、葡萄糖30g/L、蛋白胨2g/L、酵母浸膏2g/L，溶剂为水；混合，调节pH为6.5±0.5，杀菌，即得。

[0062] 所述木醋杆菌种子液的制备方法包括：将木醋杆菌冻干粉接种到第一培养基上，活化培养4d，得到活化的木醋杆菌菌株；将活化的木醋杆菌菌株接种到第二培养基中，二次培养得到木醋杆菌种子液。

[0063] 所述制备木醋杆菌种子液时二次培养的条件为：在28℃，130rpm条件下培养1d，培养在有氧条件下进行。

[0064] 按照重量百分比计，所述第一培养基的成分包括：酵母浸膏0.5%，葡萄糖2%，琼脂1.5%，水补充余量；按照配方量将原料混合，pH控制在6.6±0.2，杀菌，即得。

[0065] 所述第二培养基（YGC液体培养基）的成分与第一培养基类似，差异在于第二培养基中未加入琼脂，用水补足余量。

[0066] 所述木醋杆菌菌株的接种量为3wt%；木醋杆菌冻干粉来源于北京科展生物科技有限公司。

[0067] 所述酵母菌种子液的制备方法包括：将酵母菌接种到第三培养基上，进行活化培养2d，得到活化的酵母菌菌株；将活化的酵母菌菌株接种到第四培养基中，二次培养得到酵母菌种子液。

[0068] 所述制备酵母菌种子液时二次培养的条件为：在30℃，160rpm条件下培养1d，培养在有氧条件下进行。

[0069] 按照重量百分比计，所述第三培养基的成分包括：胰蛋白胨1%，葡萄糖2%，酵母浸粉0.5%，琼脂1.4%，水补充余量；按照配方量将原料混合，杀菌，即得。

[0070] 所述第四培养基（YPD液体培养基）的成分与第三培养基类似，差异在于第四培养基中未加入琼脂，用水补足余量。

[0071] 所述酵母菌菌株的接种量为1wt%。

[0072] 所述酵母菌具体通过从啤酒渣中进行单一纯化获得；酵母菌来源于广州君研生物科技有限公司，生物保藏号为GDMCC NO：64857。

[0073] S2和S4步骤中的杀菌条件均为：在121℃处理15min，进行高温灭菌。

[0074] 所述S4步骤中的接种发酵培养具体为两步依次发酵，包括步骤（1）：将木醋杆菌种子液接种到发酵培养基中发酵培养；步骤（2）：将酵母菌种子液接种到步骤（1）所得发酵菌液中进行发酵培养。

[0075] 所述步骤（1）的发酵培养条件为：30℃，130rpm条件下发酵培养16h；发酵培养在有氧条件下进行。

[0076] 所述步骤（1）木醋杆菌种子液的接种量为5wt%。

[0077] 所述步骤（2）的发酵培养条件为28℃，160rpm条件下发酵培养5h。

[0078] 所述步骤（2）酵母菌种子液的接种量为1wt%。

[0079] 所述S5步骤包括：将S4步骤所得发酵培养产物进行离心过滤，经过巴氏灭菌（80℃，40min），得到木醋杆菌/酵母菌红茶发酵滤液产物。

[0080] 所述S5步骤中离心条件为12000rpm。

[0081] 一种双菌发酵红茶滤液，由上述制备工艺制备得到。

[0082] 一种双菌发酵红茶滤液的应用，所述双菌发酵红茶滤液应用于精华液；按照重量百分比计，所述精华液的配方见下表1。

[0083] 表1

[0084] 所述精华液的制备方法包括：a.将卡波姆U20，维生素B3，1,3‑丁二醇，对羟基苯乙酮，水混合，边搅拌边升温到
85℃，保温15分钟，使物料完全溶解后，开始降温；
b.降温到45℃，在搅拌状态下依次加入生物多糖胶粉末、双菌发酵红茶滤液、L‑精氨酸、双‑PEG‑18 甲基醚二甲基硅烷、生育酚、1,2‑已二醇，搅拌均匀，即得含有木醋杆菌/酵母菌古树红茶发酵滤液的精华液。

[0085] 对比例1具体实施方式同实施例1，不同点在于，S4步骤中步骤（2）的发酵培养条件为28℃，
160rpm条件下发酵培养7h。

[0086] 对比例2具体实施方式同实施例1，不同点在于，采用木醋杆菌+乳酸菌+酵母菌进行三菌发酵。具体的，所述S3步骤中种子液包括木醋杆菌种子液，乳酸菌种子液和酵母菌种子液。

[0087] 所述S4步骤中的接种发酵培养具体为三步依次发酵，包括步骤（1）：将木醋杆菌种子液接种到发酵培养基中发酵培养；将乳酸菌种子液接种到步骤（1）所得发酵菌液中进行发酵培养；步骤（3）：将酵母菌种子液接种到步骤（2）所得发酵菌液中进行发酵培养。

[0088] 所述步骤（2）中的接种发酵培养具体为将乳酸菌种子液接种到发酵培养基中发酵培养；发酵培养条件为：38℃，170rpm条件下发酵培养16h；发酵培养在兼性厌氧条件下进行。

[0089] 所述乳酸菌种子液的制备方法同木醋杆菌种子液的制备方法，仅将乳酸菌冻干粉替换木醋杆菌。所述乳酸菌菌株的接种量为2wt%。

[0090] 所述乳酸菌具体为副干酪乳酸杆菌（拉丁学名Lactobacillus casei），来源于广州君研生物科技有限公司，生物保藏号为GDMCC NO：64856，生物保藏日期为2024年7月10日，生物保藏地址为广东省微生物菌种保藏中心，保藏单位为广州君研生物科技有限公司。。

[0091] 对比例3具体实施方式同实施例1，不同点在于，所述S2步骤中发酵培养基的成分包括：红茶茶叶粉30g/L、葡萄糖30g/L、蛋白胨2g/L、酵母浸膏2g/L，溶剂为水；混合，调节pH为5.5，杀菌，即得。

[0092] 对比例4具体实施方式同实施例1，不同点在于，所述红茶叶具体为凤庆红茶叶。

[0093] 性能测试理化测试气味：实施例1双菌发酵红茶滤液的气味经过24h的静置，气味类似于茶香香水。而对比例1红茶发酵滤液的发酵时间太长，气味发酸不好闻；对比例2采用木醋杆菌+乳酸菌+酵母菌三菌发酵，发酵后气味非常酸；对比例3选择凤庆红茶叶发酵，发酵后和实施例1相比茶香很淡。

[0094] 外观：实施例1双菌发酵红茶滤液的颜色为深棕色；而对比例3双菌发酵红茶滤液的颜色为浅棕色。

[0095] 成分含量检测：参照GB/T 8313‑2008和GB/T 8314‑2013，对实施例1和对比例2的红茶发酵滤液的成分含量进行检测，结果见下表2、表3。

[0096] 表2. 实施例1的红茶发酵滤液成分含量

[0097] 表3. 对比例2的红茶发酵滤液成分含量

[0098] 功效测试2.1 抗皱、紧致功效检测试验方法见图1，选择弹性蛋白酶抑制率作为衡量抗皱、紧致效果的试验指标；具体由广东立创检测技术服务有限公司进行检测。

[0099] 检测结果见下表3；其中，空白对照组为不含抑制成分的缓冲液，试验样品组为实施例1制备的双菌发酵红茶滤液。从表3数据能够看出，本发明制备的双菌发酵红茶滤液的弹性蛋白酶抑制率（18.84%）明显高于空白对照组的抑制率，且统计学差异P值＜0.05，说明差异显著，试验样品具有优异的紧致、抗皱功效。

[0100] 表3

[0101] 2.2 保湿功效检测试验方法见图2，选择水分变化率作为衡量保湿效果的试验指标；具体由广东立创检测技术服务有限公司进行检测。

[0102] 检测结果见下表4；其中，阳性对照样品为甘油，试验样品为实施例1制备的双菌发酵红茶滤液；水分变化率Δm通过测定样品在图2中温度湿度条件下，水分前后变化的差值计算得出。

[0103] 从表4数据能够看出，本发明制备的双菌发酵红茶滤液的水分变化率Δm始终低于阳性对照样品的Δm；水分变化率Δm越低代表着样品的保湿性越好，可见双菌发酵红茶滤液的保湿效果优异。经核对4h时样品Δm比2h时低的原因主要为放置情况下，正常水分会挥发变化所致；此时滤液的保湿作用还在提升，而在8h时滤液的保湿作用强，Δm明显提高。

[0104] 表4

[0105] 2.3 舒缓功效测试试验方法见图3，选择透明质酸酶抑制率作为衡量舒缓效果的试验指标；具体由广东立创检测技术服务有限公司进行检测。

[0106] 检测结果见下表5；其中，空白对照组为不含抑制成分的缓冲液，试验样品为实施例1制备的双菌发酵红茶滤液。

[0107] 从表5数据能够看出，本发明制备的双菌发酵红茶滤液的透明质酸酶抑制率（44.89%）明显高于空白对照组的抑制率，且统计学差异P值＜0.05，说明差异显著，试验样品具有优异的舒缓功效。

[0108] 表5

[0109] 3. 精华液VISIA皮肤检测结果试验方法：随机选择3名女性使用者对实施例1的精华液进行试用，早晚各使用1次，连续试用一段时间，记录初始和使用后的面部皮肤变化，其中使用者1使用时间为
2023.10.6 2023.10.25，使用者2使用时间为2023.10.6 2023.10.24，使用者3使用时间为~ ~
2023.10.6 2023.10.19；VISIA结果分别见图4‑6。从图4‑6均能够看出，使用本发明提供的~
含双菌发酵红茶滤液的精华液后，仅使用两到三周就可以取得皮肤皱纹面积明显减少的效果，精华液的紧致、抗皱效果明显。