[0001] 本发明涉及食品检测技术领域，具体而言，涉及一种基于共价定向抗体的啶虫脒的检测方法。

[0002] 啶虫脒作为一种广谱性的新烟碱类杀虫剂，具有杀虫谱广、见效快以及用量少等特点，被广泛应用于防治蚜虫、蓟马及白粉虱等害虫。但是，啶虫脒的误用和滥用常常导致部分农产品、食物链中饮用水等农药残留超标。因此，快速检测农产品中啶虫脒的残留水平，对保障食品安全具有重要意义。

[0003] 目前，已报道的啶虫脒检测方法主要包括高效液相色谱法、气象色谱法、液相色谱‑质谱联用法等大型仪器检测法。这些检测方法存在复杂的前处理工序，还具有依赖大型昂贵的仪器、需要专业技术人员等局限性，无法满足啶虫脒的现场快速检测。

[0004] 酶联免疫吸附法、适配体法、胶体金免疫层析试纸条等具有快速、简单的优点，被广泛应用于食品安全检测领域。其中，酶联免疫吸附法主要基于抗原抗体的特异性结合，具有高特异性、快捷的优点受到高度关注。但是，传统的酶联免疫吸附方法主要通过最简单的物理吸附方法(极性、离子或者疏水相互作用)将抗体非共价吸附到酶标板上。这种物理吸附方式常常导致抗体在酶标板上呈现随机标记的状态，抗体上抗原结合位点(Fab区)可能被部分或者完全遮蔽，导致信号强度和灵敏度降低。此外，传统酶联免疫吸附法依赖于天然酶，天然酶存在制备成本高且环境耐受性差的缺点。

[0005] 因此，目前亟需提高酶联免疫吸附法的灵敏度和稳定性，同时提高环境耐受性。

[0006] 鉴于此，特提出本发明。

[0049] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

[0050] 本发明实施例提供一种基于共价定向抗体的啶虫脒的检测方法，包括以下步骤：

[0051] S1、抗体定向结合

[0052] 活化抗体Fc区域的羧基，暴露的羧基与氨基修饰的酶标板(赛默飞科技世尔科技有限公司，型号为478042)形成酰胺键，得到结合有抗体的酶标板，如图1所示。

[0053] 在一些实施例中，结合有抗体的酶标板的制备过程包括：将抗体与琥珀酰亚胺溶液(如N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液)混合稀释，再与氨基修饰的酶标板和碳二亚胺(EDC)溶液混合反应，之后清洗去除未结合的抗体。EDC与NHS活化原理为：EDC与抗体Fc的羧基反应生成不稳定的胺反应性O‑酰基异脲中间体，NHS存在的情况下，EDC可将羧基转换成胺反应性磺基‑NHS酯，其与酶标板上的氨基快速反应形成酰胺键。

[0054] 在一些实施例中，制备结合有抗体的酶标板的过程中，控制反应温度为25℃‑27℃，如可以为25℃、26℃、27℃等；反应时间为1h‑3h，如可以为1h、2h、3h等。啶虫脒抗体可以由浙江大学提供，也可在北京勤邦生物技术公司购买。

[0055] 在一些实施例中，通过调控琥珀酰亚胺溶液和碳二亚胺溶液的用量，使琥珀酰亚胺和碳二亚胺(EDC)的摩尔比为1：(4.0‑4.5)，如可以为1:4.0、1:4.2、1:4.5等；碳二亚胺与抗体的质量比为1:(3‑4)，如可以为1:3.0、1:3.5、1:4.0等。琥珀酰亚胺和碳二亚胺(EDC)的用量在上述范围内为宜，能够更好地活化抗体Fc区域的羧基。

[0056] 进一步地，琥珀酰亚胺溶液的浓度为0.2mg/mL‑0.3mg/mL，如可以为0.2mg/mL、0.24mg/mL、0.26mg/mL、0.3mg/mL等；碳二亚胺溶液的浓度为1.0mg/mL‑2.0mg/mL如可以为
1.0mg/mL、1.2mg/mL、1.4mg/mL、1.8mg/mL、2.0mg/mL等；琥珀酰亚胺溶液和碳二亚胺溶液的体积比为1：(0.5‑1.5)，如可以为1:0.5、1:1.0、1:1.5等。

[0057] S2、制备Au@Pt过氧化物模拟酶标记的抗原

[0058] 先制备Au@Pt过氧化物模拟酶，之后与抗原反应。

[0059] Au@Pt过氧化物模拟酶的具体制备工艺不限，可以采用先制备金纳米粒子，再利用氯铂酸等含铂试剂还原后的铂与金纳米粒子结合。

[0060] 在一些实施例中，Au@Pt过氧化物模拟酶的制备过程包括：将氯金酸溶液加热煮沸后与柠檬酸钠溶液混合，煮沸20min‑40min(如可以为20min、30min、40min等)使溶液呈酒红色，金纳米粒子(AuNPs)形成，冷却至室温后固液分离得到金纳米粒子；将金纳米粒子与氯铂酸溶液加热至70℃‑90℃(如可以为70℃、80℃、90℃等)，再与抗坏血酸溶液混合加热保持沸腾20min‑40min(如可以为20min、30min、40min等)，溶液呈棕红色，表明合成了Au@Pt过氧化物酶，如图2所示。

[0061] 具体地，将氯金酸溶液加热煮沸后可以保持5min‑10min，之后加入柠檬酸钠溶液煮沸。去除大粒径纳米颗粒的方式不限，可以采用0.22μm的硝酸纤维素膜过滤，但不限于此。

[0062] 在一些实施例中，柠檬酸钠和氯金酸的摩尔比为(6‑7)：1，如可以为6.0:1、6.5:1、‑167.0:1等。金纳米颗粒、氯铂酸、抗坏血酸的添加比例为1.077×10 g：0.05mM‑0.30mM：
‑16
1.15mM‑1.35mM，即金纳米颗粒质量为1.077×10 g时，氯铂酸的摩尔量可以为0.05mM、
0.10mM、0.15mM、0.20mM、0.25mM、0.30mM等，抗坏血酸的摩尔量可以为1.15mM、1.20mM、
1.25mM、1.30mM、1.35mM等。

[0063] Au@Pt过氧化物模拟酶标记的抗原的制备过程包括：将Au@Pt过氧化物模拟酶的pH值调节为8‑9后，与啶虫脒抗原混合反应，随后与牛血清蛋白混合封闭Au@Pt过氧化物酶，之后固液分离后，将得到的固体物料洗涤后利用磷酸盐缓冲溶液复溶。固液分离的方式不限，可以为离心的方式，但不限于此。具体地，啶虫脒抗原可以由浙江大学提供，也可以在北京勤邦生物技术公司购买。

[0064] 进一步地，Au@Pt过氧化物模拟酶和啶虫脒抗原的反应温度为2℃‑6℃，如可以为2℃、3℃、4℃、5℃、6℃等；反应时间为10h‑15h，如可以为10h、11h、12h、13h、14h、15h等。

[0065] 进一步地，利用牛血清蛋白进行封闭的温度为35℃‑40℃，如可以为35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等；反应时间为1h‑5h，如可以为1h、2h、3h、4h、5h等。

[0066] S3、绘制标准曲线定量分析

[0067] 向结合有抗体的酶标板上的孔内加入缓冲溶液作为空白对照孔，向结合有抗体的酶标板上的孔内加入啶虫脒标准溶液或待测样品作为抑制孔，之后与Au@Pt过氧化物模拟酶标记的抗原混合孵育；之后加入底物进行孵育变色。根据吸光度的检测结果，建立啶虫脒浓度和抑制率的标准曲线，根据标准曲线获得待测样品中啶虫脒的含量。

[0068] 在一些实施例中，缓冲溶液为甲醇‑磷酸盐缓冲溶液，由甲醇和磷酸盐缓冲溶液混合得到，在甲醇‑磷酸盐缓冲溶液中甲醇的体积占比为5％‑10％，如可以为5％、8％、10％等。

[0069] 在一些实施例中，与Au@Pt过氧化物模拟酶标记的抗原进行孵育的过程中，控制孵育的温度为35℃‑40℃，如可以为35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等；孵育时间为1h‑3h，如可以为1h、2h、3h等。

[0070] 在一些实施例中，底物选自邻苯二胺、四甲基联苯胺和2,2‑联氮‑二(3‑乙基‑苯并噻唑‑6‑磺酸)二铵盐中的至少一种，底物可以为以上任意一种或几种。

[0071] 进一步地，抑制率I的计算公式如下：

[0072] I(％)＝(T0‑T)/T0×100％；

[0073] 其中，T0为对照孔对应的吸光值，T为啶虫脒标准溶液或待测样品对应的吸光值。利用多个浓度的啶虫脒标准溶液检测后绘制标准曲线，根据待测样品吸光度的检测结果和标准曲线计算待测样品中啶虫脒的含量，进一步通过换算可以得到农产品中啶虫脒的含量。

[0074] 在吸光值检测时，调节检测波长为650‑652nm，能够更准确地检测啶虫脒的含量。

[0075] 在一些实施例中，待测样品的制备过程包括：将农产品均浆后与乙腈混合涡旋，之后与无水硫酸镁和氯化钠混合涡旋，之后离心分离，取上清液；取上清液于分散固相萃取剂中涡旋，之后离心分离并过滤。通过乙腈(提取样品中的啶虫脒)、无水硫酸镁(通过吸收水分促使乙腈和水分层)和氯化钠(通过盐析作用促进乙腈和水分层)可以充分提取农产品中的啶虫脒，提高检测的准确度。

[0076] 其中，分散固相萃取剂包括乙二胺‑N‑丙基硅烷、十八烷基硅烷和石墨化碳黑，乙二胺‑N‑丙基硅烷、十八烷基硅烷和石墨化碳黑的质量比为1：(0.5‑1.5)：(0.3‑0.6)，例如乙二胺‑N‑丙基硅烷(50‑60mg)，十八烷基硅烷(50‑60mg)和石墨化碳黑(20‑30mg)。

[0077] 进一步地，农产品选自大白菜、黄瓜、胡萝卜、西葫芦、苹果、大麦、辣椒、柿子、马铃薯、玫瑰、石榴、莴苣、高粱、核桃、草莓、玉米、棉花、蓝莓、西兰花、无花果、柑橘、樱桃和芹菜中的至少一种，农产品可以为以上任意一种或几种。

[0078] 以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

[0079] 实施例1

[0080] 本实施例提供了啶虫脒抗体(由浙江大学提供)活化的方法，具体步骤如下：

[0081] 取25μL啶虫脒抗体与25μL NHS(0.25mg/mL)水溶液混合稀释，加入氨基修饰的酶标板(赛默飞科技世尔科技有限公司，型号为478042)，随后加入50μL等体积的EDC水溶液(1.5mg/mL)，室温(25℃，下同)轻轻摇晃2±0.5h，洗去未结合的抗体(如图1)。

[0082] 实施例2

[0083] 本实施例提供Au@Pt过氧化物酶标记啶虫脒抗原(由浙江大学提供)(Au@Pt‑Ag)的制备方法，具体步骤如下：

[0084] (1)制备Au@Pt过氧化物酶

[0085] 取99mL超纯水与1mL氯金酸溶液(1％)(Sigma公司提供)混合后加入三颈烧瓶中，于水浴锅上加热煮沸并保持6min，随后加入6mL、质量分数1％的柠檬酸钠溶液(Sigma公司提供)，保持煮沸30min，溶液呈现酒红色，AuNPs形成，冷却至室温后，使用0.22μm的硝酸纤维素膜过滤。随后，10mL、0.1％的氯铂酸(Sigma公司提供)(5mM)和30mL的AuNPs加热至80℃后，加入10mL抗坏血酸(5mM)(Sigma公司提供)后保持沸腾30min，溶液呈棕红色，表明Au@Pt过氧化物酶合成(如图2)。

[0086] (2)制备Au@Pt‑Ag

[0087] 取1mL的Au@Pt过氧化物酶溶液，使用K2CO3(0.2M)溶液调pH至8。随后，加入80μL、100μg/mL啶虫脒抗原，4℃反应12h后，加入108μL牛血清蛋白水溶液(质量分数为2％)对Au@Pt进行封闭，于37℃孵育3h后。最后，离心后使用900μL、0.01M磷酸盐缓冲溶液复溶，4℃保存，备用。

[0088] 实施例3

[0089] 本实施例建立抗体定向的啶虫脒标准曲线，具体步骤如下：

[0090] 1.制备啶虫脒标准品

[0091] 用10％甲醇溶液，配置一系列农药梯度的啶虫脒标准品(浓度梯度包括：0、1、2.5、5、10、25、50、100、200、300μg/L)，用于后续竞争反应。

[0092] 2.建立标准曲线

[0093] (1)活化：取25μL啶虫脒抗体与25μL NHS(0.25mg/mL)水溶液混合稀释，加入氨基修饰的酶标板(赛默飞科技世尔科技有限公司，型号为478042)，随后加入50μL EDC水溶液(1.5mg/mL)，室温(25℃，下同)轻轻摇晃2h，洗去未结合的抗体。

[0094] (2)封闭：使用PBST洗涤后，使用质量分数8％的酪蛋白水溶液封闭1h。

[0095] (3)孵育抗原：将50μL啶虫脒标准溶液(北京曼哈格生物科技有限公司，BePure 20021XM)或待测样品和50μL Au@Pt过氧化物模拟酶标记的抗原加入抗体标记的酶标板中，在25℃下孵育2h。

[0096] 显色：每孔加入100μL底物，室温孵育15min。

[0097] 读数：使用酶标仪读取650nm处的吸光值。

[0098] 建立以啶虫脒浓度为X轴，抑制率为Y的标准曲线(如图3)，其标准曲线为：Y＝2
0.1992X+0.3069，相关系数为：R ＝0.9854，检出限为0.09μg/L，线性范围为：0.29‑266.49μg/L，灵敏度为9.33μg/L。

[0099] 实施例4

[0100] 本实施例提供了蔬菜样品中啶虫脒的检测方法，建立基质标曲，具体步骤如下：

[0101] 1.样品前处理

[0102] 选择大白菜、西葫芦和黄瓜作为检测样品，洗干净后打成匀浆。称取5g样品匀浆于50mL离心管，加入10mL乙腈，涡旋1min后加入4g无水硫酸镁和1g氯化钠，再次涡旋1分钟，并以6000r/min离心5min。随后，取9mL上清液于90mg分散固相萃取剂(52mg乙二胺‑N‑丙基硅烷，52mg十八烷基硅烷、26mg石墨化碳黑)中，涡旋30s，以6000r/min的速度离心2min，最后，经0.22μm膜过滤，备用。

[0103] 2.建立基质标准曲线

[0104] (1)活化：将啶虫脒抗体与0.25mg/mL NHS水溶液混合稀释得到10μg/mL的抗体溶液，取50μL抗体溶液加入氨基修饰的酶标板(赛默飞科技世尔科技有限公司，型号为478042)，随后加入等体积的1.5mg/mL EDC水溶液(与NHS水溶液等体积)，室温(25℃，下同)轻轻摇晃2h，洗去未结合的抗体。

[0105] (2)封闭：使用PBST洗涤后，利用质量分数8％的酪蛋白溶液(300μL)封闭1h。

[0106] (3)孵育抗原：将50μL待测样品和50μL Au@Pt过氧化物模拟酶标记的抗原加入抗体标记的酶标板中，于25℃下孵育2h；

[0107] 显色：每孔加入100μL底物，室温孵育15min；

[0108] 读数：使用酶标仪读取650nm处的吸光值；

[0109] 建立以啶虫脒浓度为X轴，抑制率为Y的标准曲线(如图4)，大白菜标准曲线为：Y＝2
0.3537X‑0.14006，相关系数为：R ＝0.9846，检出限为4.77μg/L，线性范围为：9.15‑288.28
2
μg/L；黄瓜的标准曲线为：Y＝0.3388X‑0.1123，相关系数为：R＝0.9734，检出限为4.23μg/L，线性范围为：4.23‑306.08μg/L；西葫芦的标准曲线为：Y＝0.3498X‑0.1172，相关系数为：
2
R＝0.9773，检出限为4.18μg/L，线性范围为：8.07‑247.49μg/L。

[0110] 实施例5

[0111] 为经一步评价基于化学共价定向抗体的啶虫脒检测方法的优越性，本实施例对比了物理吸附与共价定向抗体的检出限、灵敏度以及线性范围。

[0112] 建立物理吸附标曲，具体步骤如下：

[0113] 1、制备啶虫脒标准品：用10％甲醇溶液，配置一系列农药梯度的啶虫脒标准品(浓度梯度包括：0、1、2.5、5、10、25、50、100、200、300μg/L)，用于后续竞争反应。

[0114] 2、建立标准曲线

[0115] (1)包板：将取100μL、5μg/mL的啶虫脒抗体溶液加入酶标板中，37℃轻轻摇晃2h；

[0116] (2)封闭：使用PBST洗涤后，使用2％的牛血清蛋白(300μL)封闭1h；

[0117] (3)孵育抗原：将50μL啶虫脒标准溶液或待测样品和50μL Au@Pt过氧化物模拟酶标记的抗原加入抗体标记的酶标板中，在25℃下孵育2h；

[0118] 显色：每孔加入100μL底物。室温孵育15min；

[0119] 读数：使用酶标仪读取650nm处的吸光值；

[0120] 建立以啶虫脒浓度为X轴，抑制率为Y的标准曲线(如图5)，其标准曲线为：Y＝2
0.3727X‑0.0454，相关系数为：R ＝0.9946，检出限为2.46μg/L，线性范围为：4.56‑120.36μg/L，灵敏度为29.07μg/L。

[0121] 可以看出，相较于物理吸附，抗体共价定向检出限降低了两个数量级、灵敏度提高了1个数量级。

[0122] 实施例6‑亲和力测定

[0123] 采用酶联免疫吸附法对物理吸附和化学共价定向方法进行了亲和力的测定，根据实施例3的步骤：将活化不同浓度的抗体包被的到酶标板中，封闭后，分别加入不同浓度的Au@Pt‑Ag，按实施例3的步骤进行孵育、显色、读数。

[0124] 最后，根据公式Ka＝(n‑1)/2(n[Ab]1‑[Ab]2)计算亲和力常数。化学共价定向方法7 6
的亲和力常数为1.410×10L/moL，如图6；物理吸附方法的亲和力常数为9.92×10L/moL，如图7。可以看出，化学共价定向方法的亲和力明显更高。

[0125] 实施例7‑特异性实验

[0126] 对农产品中可能存在的农药(吡虫啉、倍硫磷、毒死蜱、氯吡脲及噻虫嗪)进行了特异性检测。根据实施例3的步骤：分别将50μL不同浓度的啶虫脒、吡虫啉、倍硫磷、毒死蜱、氯吡脲及噻虫嗪加入抗体包被的酶标板中，按实施例3的步骤进行孵育、显色、读数。最后，计算交叉反应率，其公式为：交叉反应率(CR)＝IC50(啶虫脒)/IC50(其他农药)×100％。

[0127] 表1不同农药的交叉反应率

[0128]农药 IC50(μg/L) CR(％)
啶虫脒 9.33 100
36
吡虫啉 4×10 ＜0.5
9
倍硫磷 7×10 ＜0.5
毒死蜱 5709.08 ＜0.5
氯吡脲 1318.95 0.71
噻虫嗪 665.83 1.40

[0129] 表1显示，对噻虫嗪的交叉反应率为1.4％，对氯吡脲的交叉反应率为0.71％，其余农药交叉反应率均小于0.5％，一般交叉反应率小于5％忽略，认为无交叉，说明该方法具有较好的特异性。

[0130] 实施例8

[0131] 采用酶联免疫吸附法对比了抗体与不活化抗体的区别。根据实施例3的步骤：分别将活化的抗体和不活化的抗体包被到酶标板中，封闭后，分别加入相同浓度的Au@Pt‑Ag，按实施例3的步骤进行孵育、显色、读数。如图8，可以看出，活化抗体后其吸光值明显更高，证明活化后酶标板结合了更多的抗体。

[0132] 以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。