技术领域
[0001] 本发明涉及家蚕物质能量代谢与繁殖领域，尤其是涉及了一种用于缩小家蚕蛾翅面积的siRNA、制备方法及应用。
相关背景技术
[0002] 家蚕(Bombyx mori)是当今地球上室内饲养量最大的经济资源昆虫，它从桑叶(饲料)中摄取各种营养物质，并通过代谢生理过程供给蚕体内各个组织器官而进行生长、发育、繁殖等。家蚕通过蚕蛾的交配、产卵进行繁殖，蚕蛾翅的大小对其交配、产卵产生一定的影响。
[0003] 神经肽在昆虫的物质能量代谢等重要生理过程调控中发挥重要作用，其发挥作用的信号通路是由调节因子来介导的。昆虫神经肽信号通路的调节因子研究比较滞后，直到2000年才首次在果蝇中发现并被命名为Kurtz蛋白。在家蚕中发现神经肽信号通路需要家蚕kurtz(Bmkurtz)蛋白参与介导，但有关Bmkurtz介导神经肽作用，来调控家蚕生长与物质能量代谢等，均缺乏研究。
具体实施方式
[0032] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。
[0033] 本发明的实施例如下：
[0034] 实施例1：
[0035] 解剖并收集五龄第2天的家蚕脂肪体，使用Trizol试剂盒提取总RNA，再用逆转录第1链cDNA合成试剂对总RNA进行逆转录，其逆转录条件是：65℃变性4min，42℃反应55min，70℃灭活13min，获得第1链cDNA。
[0036] 以第1链cDNA为模板，分别用如SEQ ID NO.1的正向引物5’‑ATGGAC GACGCGGGCAGTAACAA‑3’和如SEQ ID NO.2的反向引物5’‑TCAGGCGTC TGCGTCGGCGCCC‑3’进行逆转录聚合酶链式反应(RT‑PCR)扩增，克隆获得家蚕Kurtz cDNA(BmKurtz cDNA)。其RT‑PCR扩增条件是：93℃预变性40s，58℃退火40s，71℃延伸2.2min，进行32个循环。
[0037] 以家蚕Kurtz cDNA为模板，分别用如SEQ ID NO.3的正向引物5’‑rCrAr GrCrGrArGrArCrUrUrArUrCrArGrUrArArArArUrCTG‑3’(其中TG是DNA的核苷酸，下面如有同样情况)和如SEQ ID NO.4的反向引物5’‑rCrArGrArUrUr UrUrArCrUrGrArUrArArGrUrCrUrCrGrCrUrGrArC‑3’进行PCR扩增，其PCR扩增条件是：93℃预变性40s，58℃退火40s，71℃延伸2.2min，32个循环，加rTaq酶继续延伸16min，得到BmKurtz DNA片段。琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段，经HindIII/BamHI酶切后，与哺乳动物表达载体pFLAG‑CMV‑3连接，获得pFLAG‑BmKurtz。
[0038] 以pFLAG‑BmKurtz为模板，使用如SEQ ID NO.5和如SEQ ID NO.6的两个特异性引物5′‑rArGrArCrUrUrArUrCrArGrUrArArArArUrCrUrGrCrGrUTT‑3′(其中TT是DNA的核苷酸，下面如有同样情况)和5′‑rArArArCrGrCrArGrA rUrUrUrUrArCrUrGrArUrArArGrUrCrUrCrG‑3′进行PCR扩增，其PCR扩增条件是：93℃预变性40s，58℃退火40s，71℃延伸2.2min，32个循环，得到pF LAG‑BmKurtz DNA片段。琼脂糖凝胶电泳回收纯化的目的DNA片段，作为反应模板。
[0039] 在一试管内依次加入1.5μg反应模板、2μL 10×T7反应缓冲液、2μLATP液、2μL CTP液、2μL GTP液、2μL UTP液和2μL T7酶液混合物(上述原料来源于TaKaRa公司)；接着补充无核酸酶的双蒸馏水至20μL，充分混合，放置于37℃反应18h，冷却至常温；接着在上述混合液中加入1μL TUR BO DNA酶(上述原料来源于TaKaRa公司)，混匀后于37℃下孵育16min；接着再加入30μL无核酸酶的双蒸馏水、30μL 7.5M氯化锂和50mM EDT A，终止反应；接着于4℃下15000rpm离心16min，除去上清液，加入1mL70％质量百分比的乙醇溶液洗涤；接着于4℃下
15000rpm离心16min，除去70％质量百分比的乙醇上清液，将沉淀用无核酸酶的双蒸馏水溶解，得到BmKu rtz siRNA。
[0040] 将得到的16μg BmKurtz siRNA液过滤膜除菌后，注射入化蛹第1天家蚕蛹腹部，置于24‑25℃温度、70‑80％湿度、昼明夜暗的环境中保护，化蛾第1天蚕蛾翅面积较对照区蚕蛾翅面积缩小27.4％。
[0041] 实施例2：
[0042] 解剖并收集五龄第3天的家蚕脂肪体，使用Trizol试剂盒提取总RNA，再用逆转录第1链cDNA合成试剂对总RNA进行逆转录，其逆转录条件是：65℃变性4min，42℃反应55min，70℃灭活13min，获得第1链cDNA。
[0043] 以第1链cDNA为模板，分别用如SEQ ID NO.1的正向引物5’‑ATGGAC GACGCGGGCAGTAACAA‑3’和如SEQ ID NO.2的反向引物5’‑TCAGGCGTC TGCGTCGGCGCCC‑3’进行逆转录聚合酶链式反应(RT‑PCR)扩增，克隆获得家蚕Kurtz cDNA(BmKurtz cDNA)。其RT‑PCR扩增条件是：93℃预变性40s，58℃退火40s，71℃延伸2.2min，进行32个循环。
[0044] 以家蚕Kurtz cDNA为模板，分别用如SEQ ID NO.3的正向引物5’‑rCrAr GrCrGrArGrArCrUrUrArUrCrArGrUrArArArArUrCTG‑3’和如SEQ ID NO.4的反向引物5’‑rCrArGrArUrUrUrUrArCrUrGrArUrArArGrUrCrUrCrGrCrUrGrArC‑3’进行PCR扩增，其PCR扩增条件是：93℃预变性40s，58℃退火40s，71℃延伸2.2min，32个循环，加rTaq酶继续延伸16min，得到BmKurtz DNA片段。琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段，经HindIII/BamHI酶切后，与哺乳动物表达载体pFLAG‑CMV‑3连接，获得pFLAG‑BmKurtz。
[0045] 以pFLAG‑BmKurtz为模板，使用如SEQ ID NO.5和如SEQ ID NO.6的两个特异性引物5′‑rArGrArCrUrUrArUrCrArGrUrArArArArUrCrUrGrCrGrUTT‑3′和5′‑rArArArCrGrCrArGrArUrUrUrUrArCrUrGrArUrArArGrUrCrUrCrG‑3′进行PCR扩增，其PCR扩增条件是：93℃预变性40s，58℃退火40s，71℃延伸2.2min，32个循环，得到pFLAG‑BmKurtz DNA片段。琼脂糖凝胶电泳回收纯化的目的DNA片段，作为反应模板。
[0046] 在一试管内依次加入2.0μg反应模板、2μL 10×T7反应缓冲液、2μLATP液、2μL CTP液、2μL GTP液、2μL UTP液和2μL T7酶液混合物(上述原料来源于TaKaRa公司)；接着补充无核酸酶的双蒸馏水至20μL，充分混合，放置于37℃反应18h，冷却至常温；接着在上述混合液中加入1μL TUR BO DNA酶(上述原料来源于TaKaRa公司)，混匀后于37℃下孵育16min；接着再加入30μL无核酸酶的双蒸馏水、30μL 7.5M氯化锂和50mM EDT A，终止反应；接着于4℃下15000rpm离心16min，除去上清液，加入1mL70％质量百分比的乙醇溶液洗涤；接着于4℃下
15000rpm离心16min，除去70％质量百分比的乙醇上清液，将沉淀用无核酸酶的双蒸馏水溶解，得到BmKu rtz siRNA。
[0047] 将得到的22μg BmKurtz siRNA液过滤膜除菌后，注射入化蛹第1天家蚕蛹腹部，置于24‑25℃温度、70‑80％湿度、昼明夜暗的环境中保护，化蛾第1天蚕蛾翅面积较对照区蚕蛾翅面积缩小28.5％。
[0048] 实施例3：
[0049] 解剖并收集五龄第3天的家蚕脂肪体，使用Trizol试剂盒提取总RNA，再用逆转录第1链cDNA合成试剂对总RNA进行逆转录，其逆转录条件是：65℃变性4min，42℃反应55min，70℃灭活13min，获得第1链cDNA。
[0050] 以第1链cDNA为模板，分别用如SEQ ID NO.1的正向引物5’‑ATGGAC GACGCGGGCAGTAACAA‑3’和如SEQ ID NO.2的反向引物5’‑TCAGGCGTC TGCGTCGGCGCCC‑3’进行逆转录聚合酶链式反应(RT‑PCR)扩增，克隆获得家蚕Kurtz cDNA(BmKurtz cDNA)。其RT‑PCR扩增条件是：93℃预变性40s，58℃退火40s，71℃延伸2.2min，进行32个循环。
[0051] 以家蚕Kurtz cDNA为模板，分别用如SEQ ID NO.3的正向引物5’‑rCrAr GrCrGrArGrArCrUrUrArUrCrArGrUrArArArArUrCTG‑3’和如SEQ ID NO.4的反向引物5’‑rCrArGrArUrUrUrUrArCrUrGrArUrArArGrUrCrUrCrGrCrUrGrArC‑3’进行PCR扩增，其PCR扩增条件是：93℃预变性40s，58℃退火40s，71℃延伸2.2min，32个循环，加rTaq酶继续延伸16min，得到BmKurtz DNA片段。琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段，经HindIII/BamHI酶切后，与哺乳动物表达载体pFLAG‑CMV‑3连接，获得pFLAG‑BmKurtz。
[0052] 以pFLAG‑BmKurtz为模板，使用如SEQ ID NO.5和如SEQ ID NO.6的两个特异性引物5′‑rArGrArCrUrUrArUrCrArGrUrArArArArUrCrUrGrCrGrUTT‑3′和5′‑rArArArCrGrCrArGrArUrUrUrUrArCrUrGrArUrArArGrUrCrUrCrG‑3′进行PCR扩增，其PCR扩增条件是：93℃预变性40s，58℃退火40s，71℃延伸2.2min，32个循环，得到pFLAG‑BmKurtz DNA片段。琼脂糖凝胶电泳回收纯化的目的DNA片段，作为反应模板。
[0053] 在一试管内依次加入1.75μg反应模板、2μL 10×T7反应缓冲液、2μLATP液、2μL CTP液、2μL GTP液、2μL UTP液和2μL T7酶液混合物(上述原料来源于TaKaRa公司)；接着补充无核酸酶的双蒸馏水至20μL，充分混合，放置于37℃反应18h，冷却至常温；接着在上述混合液中加入1μL TUR BO DNA酶(上述原料来源于TaKaRa公司)，混匀后于37℃下孵育16min；接着再加入30μL无核酸酶的双蒸馏水、30μL 7.5M氯化锂和50mM EDT A，终止反应；接着于4℃下15000rpm离心16min，除去上清液，加入1mL70％质量百分比的乙醇溶液洗涤；接着于4℃下15000rpm离心16min，除去70％质量百分比的乙醇上清液，将沉淀用无核酸酶的双蒸馏水溶解，得到BmKu rtz siRNA。
[0054] 将得到的19μg BmKurtz siRNA液过滤膜除菌后，注射入化蛹第1天家蚕蛹腹部，置于24‑25℃温度、70‑80％湿度、昼明夜暗的环境中保护，化蛾第1天蚕蛾翅面积较对照区蚕蛾翅面积缩小28.1％。
[0055] 由上述实施例可见，本发明在没有改变家蚕遗传特性的情况下，通过调控家蚕代谢缩小了家蚕蛾翅面积，技术效果显著，这对于研究家蚕的物质与能量代谢机制、进一步提高家蚕生理机能等，具有积极作用。
[0056] 本发明涉及的遗传序列如下：
[0057] SEQ ID NO.1：
[0058] 名称：引物1
[0059] DNA类型：other DNA
[0060] 来源：Synthetic Construct
[0061] ATGGACGACGCGGGCAGTAACAA
[0062] SEQ ID NO.2：
[0063] 名称：引物2
[0064] DNA类型：other DNA
[0065] 来源：Synthetic Construct
[0066] TCAGGCGTCTGCGTCGGCGCCC
[0067] SEQ ID NO.3：
[0068] 名称：引物3
[0069] RNA类型：other RNA
[0070] 来源：Synthetic Construct
[0071] CAGCGAGACUUAUCAGUAAAAUCTG
[0072] SEQ ID NO.4：
[0073] 名称：引物4
[0074] RNA类型：other RNA
[0075] 来源：Synthetic Construct
[0076] CAGAUUUUACUGAUAAGUCUCGCUGAC
[0077] SEQ ID NO.5：
[0078] 名称：引物5
[0079] RNA类型：other RNA
[0080] 来源：Synthetic Construct
[0081] AGACUUAUCAGUAAAAUCUGCGUTT
[0082] SEQ ID NO.6：
[0083] 名称：引物6
[0084] RNA类型：other RNA
[0085] 来源：Synthetic Construct
[0086] AAACGCAGAUUUUACUGAUAAGUCUCG。
