[0001] 本发明属于水产品养殖和饲料调制加工技术领域，具体涉及一种低蛋白紫花苜蓿青贮配合颗粒饲料及其在草鱼养殖中的应用。

[0002] 紫花苜蓿，豆科苜蓿属多年生宿根草本植物，富含蛋白质和多种矿物质等营养成分，但尚无将紫花苜蓿青贮饲料作为草鱼日粮成分的报道。青贮是一种重要的饲草调制加工和贮藏方式，对保障草鱼全年稳定的工厂化生产和高产具有重要的研究和实验意义。

[0003] 目前草鱼饲料以豆粕、菜子粕和棉子粕等为主要蛋白源，而此类植物蛋白原料也大量用于人类食品和畜牧饲料行业，导致了人、畜牧和水产养殖竞争植物蛋白原料的局面。因此，开辟新的蛋白原料来源势在必行。另外，新的蛋白原料具有潜在的功效，是健康可持续养殖高品质草鱼的发展方向，如使鱼肉中富含α‑亚麻酸、DHA、赖氨酸和苯丙氨酸等。α‑亚麻酸是有三个双键的多元不饱和脂肪酸，属于一种ω‑3必需脂肪酸，发挥着提高智力、抗血栓、保肝等作用，对人体的健康有重要的意义。DHA，即二十二碳六烯酸，脑黄金，发挥着辅助脑细胞发育、抗衰老作用、改善血液循环和降血脂等作用，是人体所必需的一种多不饱和脂肪酸。赖氨酸和苯丙氨酸等是人体必需和发挥重要功能的氨基酸。赖氨酸促进人体生长、神经智力发育、增强机体免疫力、抗病毒、促进脂肪氧化、缓解焦虑情绪。苯丙氨酸参与肌肉生长和修复，维持人体正常的生长发育，可以转化为酪氨酸，进而合成多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素等神经递质，调节神经系统功能，发挥补肾健脑作用；苯丙氨酸还可以参与血液中酪氨酸的代谢，调节血液中肌酸浓度，有助于提高运动能力和耐力，减轻疲劳感。

[0004] 本发明利用不同收获期紫花苜蓿青贮后替代部分蛋白预混料调制成低蛋白紫花苜蓿青贮配合颗粒饲料饲养草鱼。结果显示，初花期紫花苜蓿青贮配合颗粒饲料提高了草鱼肠道蛋白酶活性，鲜肉总脂肪酸、α‑亚麻酸和脑黄金DHA及补肾健脑的赖氨酸和苯丙氨酸等功能性氨基酸的含量，且降低了饲料养殖成本，在生产上具有较大的应用价值。

[0032] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

[0033] 实施例1：低蛋白紫花苜蓿青贮配合颗粒饲料制作

[0034] 1材料方法

[0035] 1.1青贮饲料材料来源

[0036] 紫花苜蓿种植于南京农业大学白马教学科研实践基地，待紫花苜蓿生长至初花期、盛花期分别进行收割，玉米、麦麸、米糠、蛋白预混料为市售原料。

[0037] 1.2混合颗粒饲料的制备

[0038] 按质量百分含量计，低蛋白紫花苜蓿青贮配合颗粒饲料的配方如下：

[0039] 配方一：蛋白预混料53％、玉米15％、麦麸15％、紫花苜蓿15％和米糠2％。

[0040] 配方二：蛋白预混料50％、玉米15％、麦麸15％、紫花苜蓿18％和米糠2％。

[0041] 配方三：蛋白预混料56％、玉米15％、麦麸15％、紫花苜蓿12％和米糠2％。

[0042] 对照组：蛋白预混料68％、玉米15％、麦麸15％、米糠2％。

[0043] 低蛋白紫花苜蓿青贮配合颗粒饲料制备过程：

[0044] 调制紫花苜蓿和米糠混合青贮饲料(一)：将新鲜紫花苜蓿切短至1～2cm后混匀，6
将18.0kg紫花苜蓿与2.4kg米糠混合均匀后，加入乳酸菌1×10cfu/g，平均分装至3个聚乙烯塑料袋中(60×90cm，19丝)，每袋约6.8kg。抽真空后密封，置于室温(32～39℃)下贮藏
60d后备用，发酵品质和营养成分如表1。

[0045] 调制紫花苜蓿和米糠混合青贮饲料(二)：采用18.0kg紫花苜蓿与2.0kg米糠混合均匀，其它操作同(一)。

[0046] 调制紫花苜蓿和米糠混合青贮饲料(三)：采用18.0kg紫花苜蓿与3.0kg米糠混合均匀，其它操作同(一)。

[0047] 制备低蛋白紫花苜蓿青贮配合颗粒饲料：青贮发酵结束后，按配方与其它日粮原料进行混合，使用颗粒机(125型，星佰农机厂，郑州)制成水分含量约为15％的1‑2cm颗粒，放入自封袋中真空封装保存备用，初花组混合颗粒饲料中乳酸菌含量为4.21lg cfu/g FW，盛花组混合颗粒饲料中乳酸菌含量为4.34lg cfu/g FW。

[0048] 其中，低蛋白紫花苜蓿青贮配合颗粒饲料配方一中采用紫花苜蓿和米糠混合青贮饲料(一)；配方二中采用紫花苜蓿和米糠混合青贮饲料(二)；配方三中采用紫花苜蓿和米糠混合青贮饲料(三)。

[0049] 研究过程中，采用两种紫花苜蓿和米糠混合青贮饲料制备低蛋白紫花苜蓿青贮配合颗粒饲料，分别为初花期紫花苜蓿青贮配合颗粒饲料(CH)和盛花期紫花苜蓿青贮配合颗粒饲料(KH)。表2为对照组和按照配方一制备的两种低蛋白紫花苜蓿青贮配合颗粒饲料的营养成分。

[0050] 表1紫花苜蓿和米糠混合青贮饲料营养成分

[0051]

[0052]

[0053] 表2青贮配合饲料原料组成％(w/w)

[0054]

[0055] 实施例2：低蛋白紫花苜蓿青贮配合颗粒饲料饲养草鱼实验

[0056] 1材料方法

[0057] 养殖实验共持续60d，池塘分为三区，每区50条草鱼，每日早9：00‑晚6：00开增氧机增氧。草鱼体色和形态正常、体格健壮、摄食良好、初始体重为1000±50g。每区草鱼套养15条500±50g的鲢鱼和200条5‑8厘米的黄颡鱼，配备增氧机一台，每日早9：00至晚6：00开机。分别于早7：00和晚5：00投喂实施例1中按照配方一制备的低蛋白紫花苜蓿青贮配合颗粒饲料各1000g，折合每天按每组草鱼初始总重的4％喂料。实验期间水环境条件见表3。

[0058] 表3饲养实验水环境

[0059]

[0060] 2草鱼取样步骤及方法

[0061] 取样前准备鱼用抗凝剂和润针剂。抗凝剂：0.2g肝素钠+5mL超纯水；润针剂：0.1g肝素钠+5mL生理盐水，保存于4℃。随后制备抗凝管。取2mL离心管用注射剂滴加2至3滴抗凝剂于离心管中，关上盖子用手指弹离心管，使抗凝剂均匀分布于管壁。打开管盖，放入65℃烘箱中烘干备用。盖上离心管盖，保存于‑20℃。0.86％生理盐水：8.6g氯化钠加双蒸水定容至1000mL。采样当天提前进行润针将配置好的润针剂吸入注射器中打出。盖上针帽。低速离心机提前打开预冷。离心程序设置：3000×g，4℃，10min。

[0062] 取鱼后先进行形态学指标测定，称重、量体长(自吻端到尾鳍根部的长度)，随后进行尾部静脉采血装入2mL抗凝离心管中，采完血后立即离心，吸取上清液置于1.5mL离心管，‑20℃保存。同一条鱼进行解剖，从尾部泄殖腔向上切开至鱼头，取内脏团称重，切下鱼头测头重。分离鱼肠道、肝脏及腹脂，分别称重放入5mL离心管，4℃保存。取鱼背鳍下方的肌肉3×3×1cm放入自封袋中。

[0063] 3草鱼指标测定方法

[0064] 有关生长及形态学指标的计算公式如下：

[0065] wWGR＝(mt‑m0)/m0×100％

[0066] SGR＝(lnmt‑lnm0)/t×100％

[0067] CF＝100m/L3

[0068] wVSI＝mv/m×100％

[0069] wHSI＝mh/m×100％

[0070] wRGW＝mG/m×100％

[0071] I＝LG/L

[0072] RS＝nt/n0×100％

[0073] 式中，wWGR为质量增加率(％)，SGR为特定生长率(％/d)，CF为肥满度，wVSI为脏体指数(％)，wHIS为肝体指数(％)，wRGW为肠体指数(％)，I为比肠长，RS为存活率(％)，t为饲养天数(d)，m0为初始质量(g)，mt为最终质量(g)，mv内脏质量(g)，mh肝脏质量(g)，mG为肠质量(g)，LG为肠长(cm)，m为体质量(g)，L为体长(cm)，n0和nt分别为各组试验初、末试验鱼数(尾)。

[0074] 取1cm×1cm×0.5cm背部肌肉，使用质构分析仪(TMS‑Pro，美国FTC公司)进行肌肉质构分析，测定指标包括硬度(hardness)、粘合度(Adhesiveness)、凝聚力(Cohesiveness)、弹性(Springiness)、黏性(Gumminess)、咀嚼度(Chewiness)、恢复力(Resilience)。采用25mm×25mm的柱形探头，接触感应力为5gf，测试速度1mm/s，目标模式为形变，形变量50％，时间2.5s，每个样品测定两次取平均值。

[0075] 肠道及肝脏消化酶活性测定：在冷冻条件下，取0.10‑0.20g样品，按样品量：生理盐水(0.69％)1:9混合，在冰水浴中充分匀浆，匀浆液4℃、3000r/min离心15min，取上清液用于测定蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶活性。蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶测定试剂盒均购买于南京晚晴生物科技有限公司，使用紫外分光光度计按说明书操作测定吸光度，通过标准曲线测定消化酶活性。

[0076] 血清生化指标测定：实验用鱼麻醉后，使用2mL无菌注射器(事先进行肝素钠抗凝剂润针)取尾部静脉血液，立即进行离心，3500r/min，10min，取上清液‑20℃冷冻保存。用于测定谷草转氨酶(AST)，谷丙转氨酶(ALT)，血蛋白(ALB)，葡萄糖(GLU)，甘油三酯(TG)，总胆固醇(TC)，乳酸(LA)的测定，测定试剂盒均购买于南京晚晴生物科技有限公司。

[0077] 鱼肉脂肪酸检测方法：采用气相色谱仪检测脂肪酸。色谱条件：TRACE GC气相色谱仪；色谱柱为安捷伦HP‑88(100×0.25mm)，载气为氦气，进样40μL，100∶1分流比，进样口温度为270℃，检测器温度为280℃，检测器辅助气氢气流速：30mL/min，空气流速：30mL/min。‑1 ‑1
升温程序：100℃持续4min，以15℃·min 升温至180℃后持续6min，再以1℃·min 速度升‑1
温至200℃后持续15min，以8℃·min 升温至230℃后持续10min。

[0078] 使用Excel整理数据，并用SPSS22版统计分析软件分析试验数据，在单因子方差分析的基础上采用t检验法检验组间是否存在显著差异，P<0.05认为存在显著性差异。

[0079] 4结果分析

[0080] 2.1低蛋白紫花苜蓿青贮配合颗粒饲料对草鱼生长性能指标的影响

[0081] 由表4可知，CH与KH在最终体质量、质量增加率和特定生长率数值上未与CON组产生显著性差异，说明采用低蛋白紫花苜蓿青贮配合颗粒饲料在生长性能上对鱼的影响与传统饲料相同。

[0082] 表4紫花苜蓿青贮对草鱼生长性能指标的影响

[0083]

[0084] 注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

[0085] 2.2低蛋白紫花苜蓿青贮配合颗粒饲料对草鱼形态学指标的影响

[0086] 由表5可知，饲喂盛花期紫花苜蓿青贮混合颗粒饲料显著增加了脏体比指数(P<0.05)，其中CON组与CH组之间无显著性影响(P>0.05)。肥满度、肝体比、比肠长及肠体比未见显著性影响(P>0.05)，说明草鱼对三种饲料的消化程度一致。

[0087] 表5低蛋白紫花苜蓿青贮配合颗粒饲料对草鱼形态学指标的影响

[0088]

[0089] 注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

[0090] 2.3低蛋白紫花苜蓿青贮配合颗粒饲料对草鱼肠道的影响

[0091] 由表6可知，饲喂紫花苜蓿青贮饲料对草鱼肠道蛋白酶和淀粉酶活性产生了显著影响(P<0.05)。CH组肠道蛋白酶活性显著高于CON和KH组(P<0.05)，KH组蛋白酶活性显著低于CON组(P<0.05)。CH组和KH组草鱼的肠道淀粉酶显著低于CON组(P<0.05)，且KH组的蛋白酶活性显著低于CH组(P<0.05)。

[0092] 表6紫花苜蓿青贮对草鱼肠道消化酶的影响

[0093]

[0094] 注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

[0095] 2.4低蛋白紫花苜蓿青贮配合颗粒饲料对草鱼肌肉质构的影响

[0096] 由表7可知，饲喂紫花苜蓿青贮饲料对草鱼鱼肉的硬度、粘合度、弹性、凝聚力、黏性、咀嚼度和恢复力无显著影响。与CON组相比，CH和KH组的硬度、弹性、黏性和咀嚼度呈现降低趋势(0.05

[0097] 表7低蛋白紫花苜蓿青贮配合颗粒饲料对草鱼草鱼肌肉质构的影响

[0098]

[0099] 注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

[0100] 2.5低蛋白紫花苜蓿青贮配合颗粒饲料对草鱼血清生化指标的影响

[0101] 由表8可知，KH组对草鱼血浆谷草转氨酶、谷丙转氨酶和总胆固醇产生了显著影响(P<0.05)。KH组的谷草转氨酶和谷丙转氨酶显著高于CH和CON组(P<0.05)，总胆固醇浓度显著低于CH和CON组(P<0.05)。

[0102] 表8低蛋白紫花苜蓿青贮配合颗粒饲料对草鱼血清生化指标的影响

[0103]

[0104] 注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

[0105] 2.6低蛋白紫花苜蓿青贮配合颗粒饲料对鱼肉氨基酸的影响

[0106] 由表9可知，对照组鱼肉中天冬氨酸含量在所有氨基酸中最高，其次为脯氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸。初花期组中天冬氨酸含量在所有氨基酸中最高，其次为脯氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸。盛花期组中脯氨酸含量在所有氨基酸中最高，其次为甲硫氨酸、谷氨酸、天冬氨酸。三组饲料之间天冬氨酸、脯氨酸、丝氨酸、谷氨酸含量呈现显著性差异(P<0.05)，其中初花期组谷氨酸、亮氨酸、赖氨酸含量最高(P<0.05)，盛花期组丙氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸含量最高(P<0.05)，对照组甘氨酸含量最高(P<0.05)。丝氨酸对照组含量最高(P<0.05)。氨基酸总量初花期组含量最高(P<0.05)。

[0107] 表9鱼肉氨基酸分析

[0108]

[0109] 注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

[0110] 2.7低蛋白紫花苜蓿青贮配合颗粒饲料对鱼肉脂肪酸的影响

[0111] 由表10可知，本研究共检测出了14种脂肪酸，其中饱和脂肪酸4种，不饱和脂肪酸10种。除亚油酸以外(P>0.05)，三组饲料喂养草鱼对鱼肉脂肪酸含量呈现显著性影响(P<
0.05)，其中对照组棕榈油酸、十七烷酸、反油酸、反式亚油酸、花生酸含量显著低于两个处理组(P<0.05)，α‑亚麻酸、二十一烷酸、二十二烷酸盛花期组含量最高(P<0.05)，初花期组神经酸、二十二碳六烯酸含量最高(P<0.05)，对照组芥酸含量最高(P<0.05)。初花期组总脂肪酸，总不饱和脂肪酸，总饱和脂肪酸均最高(P<0.05)。

[0112] 表10饲喂低蛋白紫花苜蓿青贮配合颗粒饲料对鱼肉脂肪酸的影响

[0113]

[0114] 注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

[0115] 2.8紫花苜蓿青贮替换草鱼蛋白粉的经济效益

[0116] 由表11可见，在不降低草鱼增重的前体下，使用CH和KH组紫花苜蓿青贮饲料替代蛋白预混料降低了饲料成本17.51％和17.60％。

[0117] 表11养殖成本核算

[0118]