技术领域
[0001] 本发明属于生物药物领域，具体涉及一种蛋白聚合物的纯度分析方法。
相关背景技术
[0002] 间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有自我复制和多向分化潜能，广泛存在于骨髓、脂肪、滑膜、牙髓、羊水、胎盘、脐带、胚胎、脐带血、羊膜、外周血、肌肉、尿液等组织，具有来源广泛、无需配型、感染率低、分化潜能强、增殖能力强、采集方便等特点，可产生干细胞生长因子(SCF)、神经生长因子(NGF)、白介素‑6(IL‑6)、白介素‑7(IL‑7)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)等活性因子，参与调节细胞生长、细胞凋亡、细胞分化、抗病毒、免疫成熟等过程，可用于免疫调节、组织修复及治疗急性肺损伤、重症肺炎、急性呼吸窘迫综合征等疾病。
[0003] 发明人研发发现，通过刺激MSCs，之后裂解MSCs，从胞内蛋白中可以分离纯化获得一种具有神经修复活性的蛋白聚合物。该蛋白聚合物在已完成的动物及临床实验中取得了显著的效果，尤其对ALS有明显的治疗效果，具有明确的成药可能，现已进入临床实验阶段。
[0004] 现有阶段，蛋白聚合物是通过在特定应激状态刺激MSCs表达，并对提取的生物活性物质进行分离纯化得到。在实验期间，对细胞的选择性基因表达的干预和控制手段相对有限，导致得到的蛋白聚合物的质量控制也相对困难。因此，开发一种蛋白聚合物的纯度分析方法，对于分析蛋白聚合物的纯度和稳定蛋白聚合物的质量，有着非常重要的意义。
具体实施方式
[0040] 下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。
[0041] 以下实验使用的蛋白聚合物待测样品的生产工艺包括：
[0042] 培养间充质干细胞并使用紫外线照射制造应激环境；
[0043] 将间充质干细胞裂解，使用尺寸排阻层析分离纯化，得到蛋白聚合物；其中，在流速为0.2ml/分钟的尺寸排阻层析条件下，第一组分出峰的洗脱体积为12‑13.2ml、第二组分出峰的洗脱体积为15.2‑17ml、第三组分出峰的洗脱体积为17‑20ml、第四组分出峰的洗脱体积为29‑31ml、第五组分出峰的洗脱体积为31‑34ml。
[0044] 通过毛细管电泳仪对蛋白聚合物待测样品进行纯度分析
[0045] 一种蛋白聚合物的纯度分析方法，包括：
[0046] S1：对蛋白聚合物进行前处理，制备得到预定蛋白浓度的样品；
[0047] S2：量取预定进样量的所述样品，送入毛细管电泳仪进行毛细管电泳检测，得到色谱图；以及
[0048] S3：分析所述色谱图中的信号峰，筛选预定规模以上的信号峰为主峰，其中，面积最大的主峰为蛋白峰，分析得出蛋白聚合物的纯度信息。
[0049] 其中，主要仪器设备
[0050]
[0051] 主要试剂和耗材
[0052]
[0053] 另外，需要说明的是，上述Biophase CE‑SDS Protein Analysis Kit为与毛细管电泳仪配套使用产品，其组分含：Basic Wash、Acid Wash、SDS‑MW Sample Buffer(pH 6.8)、SDS‑MW Gel Buffer、10KD Internal Standard、MW分子量标准品和Uncoated Capillary。
[0054] 上述SDS‑MW Analysis Kit为与毛细管电泳仪配套使用产品，其组分含：Basic Wash、Acid Wash、SDS‑MW Sample Buffer(pH 9.5)、SDS‑MW Gel Buffer、10KD Internal Standard、MW分子量标准品和Uncoated Capillary。
[0055] 样品处理及检测条件：
[0056] 采用微量分光光度计测得蛋白聚合物原液的蛋白浓度为：5mg/ml，；
[0057] 按照下表制备经过非还原处理和还原处理的预定蛋白浓度为0.25mg/ml的样品：
[0058]
[0059] 将上述两组处理体系的试剂原料各自混匀后，静置，即得样品。
[0060] 对上述非还原反应处理的蛋白聚合物样品进行送机检测：
[0061] 检测条件设为：进样电压3‑9KV，分离电压10‑20KV，进样量为25‑100μl，毛细管温度为10‑40℃，流动相为CE‑SDS Gel buffer，洗脱压力为10‑40psi，设定出峰峰宽为1‑8秒；分离条件设为：持续时间10‑60分钟，电压上升时间为1‑5分钟，自动调零时间设为0.1‑0.9分钟；
[0062] 对上述还原反应处理的蛋白聚合物样品进行送机检测：
[0063] 检测条件设为：进样电压3‑9KV，分离电压10‑20KV，进样量为25‑100μl，毛细管温度为10‑40℃，流动相为CE‑SDS Gel buffer，洗脱压力为10‑40psi，设定出峰峰宽为1‑8秒；分离条件设为：持续时间10‑60分钟，电压上升时间为0.5‑3分钟，自动调零时间设为2‑8分钟。
[0064] 通过对蛋白聚合物前处理，得到适配于毛细管电泳仪的样品，样品在毛细管内经高压驱动，不同分子量的分子电泳速度不同而相互分离，并在不同时间点产生对应得信号峰，形成色谱图，筛选色谱图中预定规模以上的信号峰为主峰，定义面积最大的主峰为蛋白峰，并计算各个主峰的面积占比，得出蛋白聚合物的纯度信息，筛选出的主峰数量越少且蛋白峰的面积占比越高代表蛋白聚合物的纯度越高，蛋白峰的面积占比的值反映蛋白聚合物中的蛋白纯度。可以理解的是，样品中的内标物会在色谱图中形成一个内标峰，上述信号峰不包含该内标峰。
[0065] 另一方面，还采用了SDS‑PAGE法作为对照方法，对上述样品进行纯度分析，得到电泳谱图(参见图3)。
[0066] 参见图1和图2，可以得知样品中的蛋白纯度已达95％以上，但图3中采用SDS‑PAGE法分析得到蛋白纯度只有90.1％，从图1和图2所反映的仪器检测器灵敏度来看，样品的蛋白浓度过低，以至于检测结果偏高，但总体来说，非还原反应处理的样品测得蛋白峰面积占比为98.78％，还原反应处理的样品测得蛋白峰面积占比为97.44％，反映蛋白聚合物的纯度较高。
[0067] 对样品进行蛋白浓度筛选：
[0068] 在一些实施例中，为了得到峰形更好的蛋白峰，还需要对样品的蛋白浓度进行筛选，旨在得出检测结果准确度最好的最佳进样蛋白浓度。
[0069] 1.样品配制：
[0070] 取蛋白聚合物原液，按照下表进行样品配制：
[0071]
[0072] 将各组样品所包含的试剂和原料充分混合，静置，即得样品。
[0073] 2.上机检测
[0074] 每次量取100μl样品的上清液，注入毛细管电泳仪的进样口，检测条件同上述还原处理样品，得到色谱图。
[0075] 参见图4，样品的蛋白浓度越高，信号峰之间的分离度越差，对样品纯度分析的准确度也越差，因此，样品的蛋白浓度优选为1mg/ml‑3mg/ml。
[0076] 对样品的制备进行基质筛选：
[0077] 在一些实施例中，还会对蛋白聚合物原液进行超滤换液处理，旨在更好峰形的蛋白峰，检测过程中，毛细管电泳仪对蛋白分子的响应更灵敏。
[0078] 1.超滤换液处理：
[0079] 取样品蛋白聚合物原液，经分光光度计测得蛋白浓度为24mg/ml，取100μl原液加入至超滤管内，将超滤管置于离心机内，离心10分钟，随后加入100μl CE Water，混匀，再离心10分钟，重复进行3次CE Water的补加和离心，最后对样品混合物进行浓缩至蛋白浓度为23.853mg/ml，即完成超滤换液。
[0080] 2.样品制备：
[0081] 按照下表进行样品配制：
[0082]
[0083] 将各组样品所包含的试剂和原料充分混合，静置，即得样品。
[0084] 3.上机检测
[0085] 每次量取100μl样品的上清液，注入毛细管电泳仪的进样口，检测条件同上述还原处理样品，得到色谱图。
[0086] 参见图5，经过超滤换液的蛋白聚合物原液与蛋白聚合物原液的盐浓度不同对仪器响应灵敏度的影响不大，但考虑到当使用低蛋白浓度的原液制备高蛋白浓度样品时，需要对低蛋白浓度的原液进行浓缩，而浓缩后的样品中的盐浓度会进一步增多，未必避免样品的盐浓度的增高对后续检测结果产生影响，故而，优选经过超滤换液的蛋白聚合物原液进行样品制备。
[0087] 以进行还原反应处理后的蛋白浓度为2mg/ml的样品进行缓冲体系筛选：
[0088] 1.样品配制：
[0089] 取超滤换液处理后的蛋白聚合物原液，按照下表进行样品配制：
[0090]
[0091]
[0092] 将各组样品所包含的试剂和原料充分混合，静置，即得样品。
[0093] 2.上机检测
[0094] 每次量取100μl样品的上清液，注入毛细管电泳仪的进样口，检测条件同上述还原处理样品，得到色谱图。
[0095] 参见图6，不同酸碱度的缓冲体系对仪器响应灵敏度的影响不大，检测结果也相对一致，但考虑到《中国药典(通则0542)毛细管电泳法》中推出相关检测方法采用的是低pH值缓冲液，因此优选采用低pH值缓冲液制备样品。
[0096] 对样品制备进行变性条件筛选：
[0097] 在一些实施例中，为了得到峰形更好的蛋白峰，还需要对样品制备过程中的变性条件进行筛选，旨在得出检测结果准确度最好的最佳变性条件。
[0098] 1.样品配制：
[0099] 取蛋白聚合物原液，按照下表进行样品配制：
[0100]
[0101] 将样品所包含的试剂和原料充分混合，离心1分钟。
[0102] 2.变性反应
[0103] 将样品分为4份，分别在70℃水浴锅中水浴15min，70℃水浴锅中5min，70℃水浴锅中10min和100℃水浴锅中水浴5min的条件下进行变性反应。
[0104] 完成变性反应后，再将各组样品置于室温下，避光静置10分钟，即得样品。
[0105] 3.上机检测
[0106] 每次量取100μl样品的上清液，注入毛细管电泳仪的进样口，检测条件同上述还原处理样品，得到色谱图。
[0107] 参见图7，在70℃水浴锅中水浴5min或10min下变性的样品，在色谱图中展示的峰形不佳，可能意味着变性反应不够完全，综合《中国药典(通则0542)毛细管电泳法》中提到的变性条件，故而变性条件优选为在70℃下水浴15min。
[0108] 对样品检测过程中的毛细管温度进行筛选：
[0109] 在一些实施例中，为了得到峰形更好的蛋白峰，还需要对毛细管电泳仪的毛细管温度进行筛选，旨在得出检测结果准确度最好的最佳毛细管温度。
[0110] 1.样品配制：
[0111] 取超滤换液后的蛋白聚合物原液，按照下表进行样品配制：
[0112]
[0113] 将各组样品所包含的试剂和原料充分混合，静置，即得样品。
[0114] 2.上机检测
[0115] 将上述样品分为3份，分别在20℃、25℃和30℃的毛细管温度下进行检测。
[0116] 每次量取100μl样品的上清液，注入毛细管电泳仪的进样口，检测条件同上述还原处理样品，得到色谱图。
[0117] 参见图8，可以得知：毛细管温度越高，蛋白分子的迁移时间越短，但本申请样品在上述三个实验温度下未发现色谱图的分辨率有所变化，故而优先采纳25℃毛细管温度，以免温度过高造成敏感蛋白再次变性导致结果误差。
[0118] 第二方面，在一些实施例中，本申请还提供了一种重复性验证方法，用于验证上述纯度分析方法的可重复性：
[0119] 所述重复性验证方法包括：
[0120] S41：预备若干组不同蛋白浓度的所述样品；
[0121] S42：量取预定进样量的若干组所述样品，送入毛细管电泳仪进行毛细管电泳检测，得到若干组色谱图；
[0122] S43：重复上述步骤S2三次，每组所述样品平行进行三次毛细管电泳检测，选取所述色谱图中的三个主峰，统计各个所述色谱图中的各个所述主峰的面积占比并进行数据分析。
[0123] 通过对上述蛋白聚合物的纯度分析方法的重复性进行验证，计算同一蛋白浓度的平行实验的诸峰面积占比的相对标准偏差，以及不同蛋白浓度的同一出峰时间的主峰的相对标准偏差，评估本申请提出的纯度分析方法的准确度，预测本申请提出的纯度分析方法检测结果中各指标的可信度。
[0124] 具体实施方式：
[0125] 1.样品配制：
[0126] 取超滤换液后的蛋白聚合物原液，按照下表进行样品配制：
[0127]
[0128] 将各组样品所包含的试剂和原料充分混合，静置，即得样品。其中，每个目标蛋白浓度均配置三份进行同蛋白浓度的平行实验。
[0129] 2.上机检测
[0130] 每次量取100μl样品的上清液，注入毛细管电泳仪的进样口，检测条件同上述还原处理样品，得到色谱图。
[0131] 参见图9，统计各个色谱图中峰面积最大的三个信号峰的峰面积占比，其中最大的信号峰为蛋白峰，得到下表：
[0132]
[0133]
[0134] 由上表可以看出，同一蛋白浓度的样品在进行平行实验以及不同蛋白浓度的样品所测得的蛋白峰的峰形和峰面积占比基本一致，且相对标准偏差RSD均小于2.0％，充分证明了本申请提出的蛋白纯度分析方法具备可重复性，同时也侧面印证了本申请的样品中蛋白纯度很高，几乎没有杂峰干扰。
[0135] 第三方面，在一些实施例中，本申请还提供了一种线性验证方法，用于验证上述蛋白聚合物的纯度分析方法中的样品的蛋白浓度与色谱图中的出峰的峰面积的线性关系：
[0136] 所述线性关系验证方法包括：
[0137] S51：预备若干组不同蛋白浓度的所述样品；
[0138] S52：量取预定进样量的若干组所述样品，送入毛细管电泳仪进行毛细管电泳检测，得到若干组色谱图；
[0139] S53：选取所述色谱图中的三个主峰，统计各个所述色谱图中的各个所述主峰的面积并进行数据分析。
[0140] 通过对上述蛋白聚合物的纯度分析方法中的样品的蛋白浓度与色谱图中的主峰的峰面积进行线性关系验证，获得以蛋白浓度为‑峰面积的回归曲线，确定本申请提出的蛋白聚合物的纯度分析方法的最佳检测蛋白浓度，调整样品的蛋白浓度来提高检测结果的准确性。
[0141] 具体实施方式：
[0142] 1.样品配制：
[0143] 取超滤换液后的蛋白聚合物原液，按照下表进行样品配制：
[0144]
[0145]
[0146] 将各组样品所包含的试剂和原料充分混合，静置，即得样品。其中，蛋白聚合物原液蛋白浓度是通过蛋白聚合物原料进行超滤换液时调整CE Water的添加比例来获得目标蛋白浓度的原液。
[0147] 2.上机检测
[0148] 每次量取100μl样品的上清液，注入毛细管电泳仪的进样口，检测条件同上述还原处理样品，得到色谱图。
[0149] 统计各个色谱图中峰面积最大的三个信号峰的峰面积，其中最大的信号峰为蛋白峰，得到下表：
[0150]
[0151] 3.线性回归
[0152] 分别对三个信号峰在不同蛋白浓度下检测得到的色谱图中的峰面积进行线性拟2
合，得到图10‑图12所示的五点拟合统计图，图10‑图12的五点拟合统计图中的拟合度R 均小于0.980，线性关系不佳，因此，去掉偏离度较大的最高点，制作如图13‑图15所示的四点
2
拟合图，四点拟合图中的线性拟合度R均大于0.980，线性良好，足以证明样品的蛋白浓度与蛋白峰的峰面积成正比，因此，后续可以通过蛋白峰的线性回归方程求得样品的蛋白浓度，具体地，对蛋白浓度未知的样品进行毛细管电泳检测，得到蛋白峰的峰面积值，再将峰面积值代入线性回归方程即可得到样品的蛋白浓度值。
[0153] 同时对不同浓度的同一信号峰进行偏差运算，得到下表：
[0154]
[0155] 不同蛋白浓度的样品的同一信号峰的峰面积占比的相对标准偏差RSD(n＝5)均小于5.0％，上述五点拟合统计图中拟合度不好原因可能是样品的蛋白浓度过载，故而，蛋白浓度在1mg/ml～4mg/ml之间的样品才会存在蛋白浓度与信号峰的峰面积的线性关系。因此，后续通过蛋白峰的线性回归方程求得样品的蛋白浓度大于4mg/ml，准确度可能不高。
[0156] 第四方面，在一些实施例中，本申请还提供了一种分子量计算方法，用于通过参照本申请提供的蛋白聚合物的纯度分析方法中色谱图中出峰时间计算出各个信号峰所表征的蛋白分子的分子量：
[0157] 所述分子量计算方法包括：
[0158] S61：制备的标准样品，所述标准品样品由预定量的分子量标准品、样品缓冲液和内标物混匀而得，所述分子量标准品中包含不同分子量的标定分子；
[0159] S62：量取预定进样量的所述标准样品，送入毛细管电泳仪进行毛细管电泳检测，得到标定色谱图，所述分子量标准品按照分子量从小到大在所述标定色谱图上形成相应的标定峰；
[0160] S63：统计所述标定色谱图中的各个所述标定峰的校正出峰时间和校正分子量大小，并进行线性回归。
[0161] 通过采用分子量标准品制备标准样品，得到按照分子量大小依次形成相应的标定峰的标定色谱图，关联各个所述标定峰的校正出峰时间和校正分子量大小进行线性回归，得到校正出峰时间与矫正分子量大小的回归曲线，便于后续依据蛋白聚合物的纯度分析方法的色谱图中蛋白峰的出峰时间求得蛋白聚合物中的蛋白分子的分子量。
[0162] 具体实施方式：
[0163] 1.标准样品配制：
[0164] 取分子量标准品，按照下表进行样品配制：
[0165]
[0166] 将样品所包含的试剂和原料充分混合，静置，即得样品。其中，分子量标准品中包含分子量分别为10KD、20KD、35KD、50KD、100KD、150KD、225KD的标定分子。
[0167] 2.上机检测
[0168] 每次量取100μl样品的上清液，注入毛细管电泳仪的进样口，检测条件同上述还原处理样品，得到色谱图(参见图16)。
[0169] 统计对应于各个分子量的标定分子的信号峰的出峰时间和分子量，进行线性拟2
合，得到如图17所示的分子量线性图，其中拟合度R为0.9998，线性良好，因此，后续可以通过分子量的线性回归方程求得样品中的蛋白分子的分子量，具体地，对蛋白分子的分子量未知的样品进行毛细管电泳检测，得到蛋白峰的出峰时间，再将出峰时间值代入线性回归方程即可得到样品的蛋白分子的分子量。
[0170] 进一步地，针对上述线性回归方程，采用分子量为60KD的标准品配制出不同浓度的样品，进行上机检测，得到出峰时间，代入线性回归方程求得分子量，具体比对见下表：
[0171]
[0172] 由上表可知，通过回归方程求得的分子量范围在57KDa～60KDa，与标准品的分子量有一定出入，预测精度不高，且相同浓度不同检测时间也会存在偏差，但在实际应用过程中具备一定参考价值。
[0173] 以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。
