[0001] 本发明属于植物分子生物学与植物遗传工程技术领域，特别涉及CaCRY2基因在调控植物对辣椒疫霉菌抗性中的应用。

[0002] 隐花色素CRYs是一种类似光解酶的黄素蛋白的蓝/UV‑A光受体，普遍存在于原核生物和真核生物中。植物CRYs可分为三个亚家族：CRY1、CRY2和CRY3，主要介导蓝光对于植物生长发育的调控，如光形态形成、开花进程、生物节律及气孔开闭等。其中，CRY2是同时定位于细胞核和细胞质的蛋白质，其含有两个结构域：一个是N端的光解酶同源相关（photolyase homologous region，PHR）结构域，另一个是可变的C端延伸（CRY C‑terminal extension，CCE）结构域。近年来，CRY2被报道在植物应对非生物胁迫和生物胁迫中起作用。比如，CRY2通过CRY2‑COP‑HY5‑BBX7/8模块调控拟南芥蓝光依赖性冷驯化，CRY2通过负调控E3泛素连接酶来调节抗性蛋白介导的病毒防御。

[0003] 辣椒疫病是由辣椒疫霉菌侵染所引起的一种土传性病害，其具有感染快、发病迅猛等特点，在短时间内即可大面积暴发，造成辣椒减产甚至绝收。辣椒疫霉菌的寄主范围很广，除辣椒之外，还可侵染茄科的番茄和烟草、葫芦科的黄瓜、西瓜和南瓜、豆科的普通菜豆、油豆角和黄荚菜豆等多种植物，并造成严重损失。此外，辣椒疫霉菌引起的病害为典型的多循环病害，其通过产生卵孢子、孢子囊和游动孢子、厚垣孢子等多种形态的孢子实现侵染并扩展流行。辣椒疫病一旦暴发，化学药剂控制短期可行，但是容易造成环境污染且长期使用植物会产生抗药性。在辣椒疫霉菌引起的辣椒疫病的防治措施中，其中一种途径就是选用和培育抗病品种，而挖掘抗疫病基因则是抗病育种的关键。

[0013] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施案例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0014] 本发明涉及的CaCRY2基因的gDNA序列如SEQ ID NO:1所示，从茄科基因组数据库SGN（https://solgenomics.net/）上检索其序列，ID号为CA03g05280，其cDNA序列如SEQ ID NO:2所示；本发明发现抑制CaCRY2基因的表达可增强植物对辣椒疫霉菌的抗性；过表达CaCRY2基因可减弱植物对辣椒疫霉菌的抗性。

[0015] 在具体实施中，抑制CaCRY2基因的表达可以由多种途径实现，比如完全或部分限制CaCRY2基因的表达水平、完全或部分限制CaCRY2基因表达的蛋白活性、CaCRY2基因进行基因突变。具体地，主要包括基因敲除、RNA干扰、反义RNA技术、病毒载体、蛋白质水平的调控等方法。在下述实施方式中，以使用病毒载体的基因沉默技术（Virus‑Induced Gene Silencing，VIGS）实现部分限制CaCRY2基因的表达作为举例说明。

[0016] 在具体实施中，本发明的植物是指能被辣椒疫霉菌侵染并引起疫病的任意植物，尤其是茄科植物。在下述实施方式中，以属于茄科植物的辣椒和烟草作为举例说明。

[0017] 实施例1本实施例1为辣椒抗病实验，通过VIGS技术在辣椒幼苗中沉默CaCRY2基因，进而抑制CaCRY2基因表达，研究其如何调控辣椒植株的辣椒疫霉菌抗性。

[0018] 1.1、基因材料以辣椒品种‘杭椒12号’为材料，提取它叶片组织的RNA反转录为cDNA，其序列如SEQ ID NO:2所示，作为后续构建CaCRY2基因沉默载体的模板。

[0019] 1.2、构建CaCRY2基因沉默载体以茄科基因组数据库SGN（https://solgenomics.net/）上CaCRY2基因的序列（其cDNA序列如SEQ ID NO:2所示）为模板设计引物对，该引物对序列如下：
正向引物：5'‑TGAGTAAGGTTACCGAATTCTCTAGAGGTGGAACTCGGTAT‑3'，如SEQ ID NO:
3所示；
反向引物：5'‑TTTAATGTCTTCGGGACATGCCCGGGCGAACTGCTCGGACAA‑3'，如SEQ ID NO:4所示；
利用上述引物对，以辣椒品种‘杭椒12号’的cDNA为模板进行扩增，得到232bp的特异性片段，切胶回收扩增的片段；用限制性内切酶Xba I和限制性内切酶Sma I双酶切烟草脆裂病毒（TRV）载体pTRV2，切胶回收载体骨架；将回收的扩增片段和载体骨架通过同源重组连接，转入大肠杆菌DH5α中，测序后对比结果正确的质粒载体即为CaCRY2基因的沉默载体pTRV2:CaCRY2。

[0020] 1.3、辣椒幼苗中沉默CaCRY2基因将上述构建好的沉默载体pTRV2:CaCRY2转入农杆菌感受态细胞GV3101中构成pTRV2:CaCRY2农杆菌菌液；表达TRV的载体pTRV1转入农杆菌感受态细胞GV3101中构成pTRV1农杆菌菌液；载体pTRV2转入农杆菌感受态细胞GV3101中构成pTRV2:00空载农杆菌菌液。

[0021] 以长至子叶期的辣椒幼苗作为对象，pTRV1农杆菌菌液与pTRV2:CaCRY2农杆菌菌液按照1:1体积比例混合，注射侵染‘杭椒12号’辣椒幼苗的子叶，获得CaCRY2基因沉默的辣椒幼苗材料，将其命名为TRV:CaCRY2；pTRV1农杆菌菌液与pTRV2:00空载农杆菌菌液按照1:1体积比例混合，侵染‘杭椒12号’辣椒幼苗的子叶，作为对照的辣椒幼苗材料，将其命名为TRV:00。

[0022] 检测TRV:00和TRV:CaCRY2叶片中CaCRY2基因相对表达量，结果如图1所示，由图1可以看出，TRV:CaCRY2中成功实现了CaCRY2基因沉默。图1中*表示P值小于0.5，即达到显著性差异。

[0023] 1.4、辣椒疫霉菌培养将辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）接种于PDA培养基（200g/L马铃薯+20g/L葡萄糖+17g/L琼脂）上暗培养4天～7天活化，将长有辣椒疫霉菌菌丝部分的培养基用灭菌的打孔器打成菌块，放置于含有10% V8培养基（100mL V8蔬菜汁+1gCaCO3+17g琼脂定容至
1000mL）的培养皿中，于28℃暗培养7天诱导产生孢子囊。在长满菌丝的培养皿中加入10mL灭菌水，于40℃冷藏30min，而后转至室温（25℃ 28℃）放置20min刺激孢子囊释放孢子，用~
无菌涂布棒将培养基表面的菌丝轻刮下来，收集过滤后的液体即为孢子悬浮液。利用血球
5 ‑1
计数板统计孢子数量，稀释孢子悬浮液至所需浓度（1×10zoospores·mL）。

[0024] 1.5、灌根法接种辣椒疫霉菌以及结果分析以TRV:CaCRY2和TRV:00的辣椒幼苗作为接种对象，当辣椒幼苗长至五叶一心时期进行疫霉菌接种，将5mL稀释后的辣椒疫霉菌孢子悬浮液，注射至距离辣椒幼苗根茎1cm的土壤内；
‑2
将上述辣椒幼苗在温室中种植培养，具体生长条件设置为：光强200μmol·m ·s‑1
，温度19℃ 25℃，光周期12h。
~

[0025] 按照发病情况将辣椒幼苗的病情指数分为6个等级，其分级标准如表1所示。

[0026] 表1

[0027] 接种辣椒疫霉菌7天后，在两组中各自选取3株辣椒幼苗进行拍照，其表型如图2所示；由图2可知，接种辣椒疫霉菌前，TRV:00和TRV:CaCRY2的辣椒幼苗均没有萎蔫；接种辣椒疫霉菌后，两组辣椒幼苗均发生萎蔫；而且未沉默CaCRY2基因的辣椒幼苗比沉默CaCRY2基因的辣椒幼苗的萎蔫程度更加严重。

[0028] 接种辣椒疫霉菌7天后，按照表1的分级标准统计TRV:00和TRV:CaCRY2的辣椒幼苗病级并计算病情指数，结果如表2所示，二者病情指数对比如图3所示，图3中*表示P值小于0.5，即达到显著性差异。

[0029] 表2

[0030] 病情指数=∑（病级*该病级株数）/总调查株数，TRV:00和TRV:CaCRY2的总调查株数均为10株，接种辣椒疫霉菌前病级均为0级。由表2和图3可知，接种辣椒疫霉菌的辣椒幼苗中，未沉默CaCRY2基因的辣椒幼苗比沉默CaCRY2基因的辣椒幼苗的病情指数更高。

[0031] 1.6、离体叶片接种辣椒疫霉菌以及结果分析在灌根法接种试验的基础上，通过离体叶片接种辣椒疫霉菌进行进一步的抗性鉴定。

[0032] 离体叶片接种：将TRV:00和TRV:CaCRY2的辣椒幼苗叶片放置在0.8%琼脂培养基5 ‑1
（8g琼脂粉定容至1000mL）上保湿，在最宽处的叶脉旁滴20μL浓度1×10zoospores·mL 的孢子悬浮液。

[0033] 3天后测量病斑面积，测量方法为：将台盼蓝染色液（按照体积比，95%酒精：乳酚=2:1）预热1min，浸入叶片，煮沸2min，将叶片取出放在含台盼蓝染色液的培养皿中继续浸泡约12h，倒出染色液，加入脱色剂（900g水合氯醛溶于600mL去离子水中），每12h更换一次脱色剂直至叶片透明，最后置于95%的酒精中洗净脱色剂，测量并记录叶片中死细胞的面积。
其中，乳酚为乳酸10mL、苯酚9.3mL、甘油10mL、台盼蓝10mL、ddH2O 10mL混匀而成。

[0034] 3天后离体叶片的明场和台盼蓝染色后拍照情况如图4所示，病斑面积如图5所示。图4和图5结果表明，未沉默CaCRY2基因的辣椒幼苗比沉默CaCRY2基因的辣椒幼苗的叶片病斑明显更大。图5中*表示P值小于0.5，即达到显著性差异。

[0035] 本实施例1通过统计辣椒幼苗的病情指数和离体叶片病斑面积鉴定沉默CaCRY2基因的辣椒幼苗对于疫病的抗感，明确了沉默CaCRY2基因可增强辣椒幼苗对辣椒疫霉菌引起的疫病抗性。

[0036] 实施例2本实施例2为烟草抗病实验，通过转基因技术在烟草植株中过表达CaCRY2基因，再对过表达CaCRY2基因的烟草植株接种辣椒疫霉菌，研究其如何调控烟草植株的辣椒疫霉菌抗性。

[0037] 2.1、基因材料以辣椒品种‘杭椒12号’为材料，提取它叶片组织的RNA反转录为cDNA，其序列如SEQ ID NO:2所示，作为后续构建CaCRY2基因过表达载体的模板。

[0038] 2.2、构建CaCRY2基因过表达载体以茄科基因组数据库SGN（https://solgenomics.net/）上CaCRY2基因的序列（其cDNA序列如SEQ ID NO:2所示）为模板设计引物对，该引物对序列如下：
正向引物：5'‑TTACAATTACCATGGGGCGCGCCATGGAGAGTAATTCCAAGACAA‑3'，如SEQ ID NO:5所示；
反向引物：5'‑AACATCGTATGGGTAGGTACCTAGCTCTGTCTTACCAGTTTTGCAC‑3'，如SEQ ID NO:6所示；
利用引物对，以辣椒品种‘杭椒12号’的cDNA为模板进行扩增，到1929bp的CaCRY2基因全长片段，切胶回收扩增的片段，用限制性内切酶Asc I和限制性内切酶Kpn I双酶切含有CaMV 35S启动子的载体PAC，切胶回收载体骨架，将回收的扩增片段和载体骨架通过同源重组连接，转入大肠杆菌DH5α中，测序后对比结果正确的质粒载体为CaCRY2‑PAC载体，即为CaCRY2基因过表达载体。

[0039] 2.3、烟草遗传转化将CaCRY2‑PAC转入感受态农杆菌GV3101，利用农杆菌介导法将CaCRY2‑PAC载体转入本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中，获得的CaCRY2基因过表达的烟草材料，选取2个株系分别命名为OE‑1、OE‑2；并以1组野生型的本氏烟草作为对照，该烟草材料命名为WT（wild type，野生型）。

[0040] 检测WT、OE‑1和OE‑2对应烟草的叶片中CaCRY2基因相对表达量，结果如图6所示，由图6可以看出，OE‑1和OE‑2中成功实现了CaCRY2基因的过表达。

[0041] 2.4、辣椒疫霉菌培养5 ‑1
与实施例1中1.4内容相同，获得浓度为1×10zoospores·mL 的辣椒疫霉菌孢子悬浮液。

[0042] 2.5、灌根法接种辣椒疫霉菌以及结果分析以OE‑1、OE‑2和WT烟草幼苗作为接种对象，当烟草幼苗长至4片～6片真叶时进行辣椒疫霉菌接种，将5mL稀释后的辣椒疫霉菌孢子悬浮液，注射至距离烟草幼苗根茎1cm的土壤内；
‑2
将上述烟草幼苗在温室中种植培养，具体生长条件设置为：光强200μmol·m ·s‑1
，温度19℃ 25℃，光周期12h。
~

[0043] 在WT、OE‑1和OE‑2中各自选取3株烟草幼苗，对接种辣椒疫霉菌前和接种5天后分别进行拍照，如图7所示；接种辣椒疫霉菌5天后，按照表1的分级标准统计WT、OE‑1和OE‑2的烟草幼苗病级并计算病情指数，结果如表3所示，病情指数对比情况如图8所示，病级的分级标准与实施例
1中表1相同；图8中*表示P值小于0.5，即达到显著性差异。

[0044] 表3

[0045] 病情指数=∑（病级*该病级株数）/总调查株数，WT、OE‑1和OE‑2的总调查株数均为20株，接种辣椒疫霉菌前病级均为0级。

[0046] 由图7可知，接种辣椒疫霉菌前的OE‑1、OE‑2、WT组烟草幼苗均没有萎蔫；接种辣椒疫霉菌后，烟草幼苗均发生萎蔫和不同程度的落叶；CaCRY2基因过表达的烟草幼苗（OE‑1、OE‑2）比WT组烟草幼苗的萎蔫程度更加严重，落叶更加明显。

[0047] 由图8可知，接种辣椒疫霉菌后，CaCRY2基因过表达的烟草幼苗（OE‑1、OE‑2）比WT组烟草幼苗的病情指数更高。

[0048] 本实施例2通过统计病情指数鉴定了过表达CaCRY2基因的烟草植株对于疫病的抗性下降，进一步明确过表达CaCRY2减弱烟草植株对疫病抗性。

[0049] 通过实施例1和实施例2证明，CaCRY2基因作为一个负向调控因子，可以赋予不同植物对辣椒疫霉菌及其引起的疫病的抗病性。CaCRY2基因作为目标基因，可应用于：（1）对CaCRY2基因进行表达量检测或制备分子标记应用于辣椒抗疫病育种；（2）制备抗辣椒疫病的产品；比如抑制CaCRY2基因表达或蛋白活性的试剂、药物等；（3）培育抗辣椒疫病的转基因植物；比如向目标植物中导入抑制CaCRY2基因表达的核酸分子等。

[0050] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。