技术领域
[0001] 本发明涉及针对乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的抗体及其抗原结合片段，以及制备和使用所述中和抗体及其抗原结合片段的方法。
相关背景技术
[0002] 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)引起的急性和慢性感染是严重危害人类健康的全球性的公共卫生问题。随着乙肝疫苗的接种，极大的控制了病毒蔓延，但我国仍是世界上乙型肝炎患者最多的国家。目前临床中用于治疗慢乙肝的药物，包括干扰素和核苷/核苷酸类似物，虽然可以有效抑制HBV复制，但无法彻底清除病毒从而治愈乙肝病毒慢性感染，同时还可能出现耐药性。
[0003] HBV是一种有包膜的DNA病毒，属嗜肝病毒科。目前有9个确认的HBV基因型A‑I和一种未定基因型J型，这些基因型进一步细分为许多具有特定地理分布的亚基因型。HBV感染后，患者的病程自然史因其感染的HBV基因型而存在差异，包括传播方式、HBeAg血清转化的时间、肝病进程的速度和严重程度，例如向肝细胞癌的进展及HBsAg清除的可能性。HBsAg颗粒有大、中、小三种形式,其中小HBsAg由226个氨基酸编码，是引起机体产生保护性抗体的主要组成部分。HBsAg蛋白拥有4个跨膜区，其中有一段长约70个氨基酸(氨基酸99‑169)的胞外结构域。这一段胞外结构域暴露于病毒颗粒的表面，对病毒侵染宿主细胞尤为重要，同时也是机体免疫系统(如抗体)识别的重要位点。在这段胞外区域中，有一个免疫优势区称为“a”抗原决定簇，位于124位‑147位氨基酸，跨膜区2、3之间，是乙肝表面抗体anti‑HBs所识别的重要表位。由于HBV慢性感染过程中，经过自然选择、适者生存的时间和空间压力，会出现一系列的突变株，而上述“a”抗原决定簇是HBsAg发生突变频率较高的区域。
[0004] 乙肝表面抗原‑HBsAg可来源于HBV cccDNA和/或整合HBV DNA片段，不仅作为HBV的包膜蛋白参与完整病毒颗粒的行程，还会和宿主脂质组成非感染性亚病毒颗粒，即HBsAg颗粒，其游离存在于感染者的血液中形成表面抗原血症。越来越多的研究显示，慢乙肝患者体内大量存在的HBsAg可能是机体免疫应答产生异常或耗竭的原因，并且可能影响肝脏疾病的病理生物学和癌症的发生。因此，降低或清除乙肝表面抗原不仅可预防乙肝病毒感染，而且可有助于实现“功能性治愈”，从而降低并发症(肝硬化和肝细胞癌)的发生率。而利用针对乙肝表面蛋白的单克隆抗体(anti‑HBs)来降低或清除人体中的乙肝表面抗原(HBsAg)蛋白是一项非常值得探索研发的“功能性治愈乙肝”的临床策略。
[0005] 目前防治乙型肝炎最经济有效的方法是接种乙肝疫苗，乙肝疫苗接种后产生的乙肝表面抗体anti‑HBs为针对乙型肝炎的保护性抗体。自1992年我过施行新生儿接种乙肝疫苗政策以来，人群中乙肝病毒抗原阳性率逐年降低。截至2020年，我国人群乙肝表面抗原阳性率为6％左右，但由于人口基数大，我国依然有HBV感染人群8600万，每年新增约100万。
[0006] 抗体是由B淋巴细胞所分化为的浆细胞而分泌的。每个B淋巴细胞只能产生专有的、针对一种特异性抗体决定簇的抗体，而从单一细胞或单一细胞株得到的抗体就被称为单克隆抗体。随着生物技术的发展，单克隆抗体筛选技术也不断进步，已有多项已有多项研究通过不同技术利用疫苗免疫者外周血B细胞获得anti‑HBs单克隆抗体，如构建噬菌体展示Fab文库技术、EB病毒介导的B细胞永生化技术以及B细胞激活培养技术，得到可以与HBsAg结合且具有一定中和活性的单克隆抗体，并且抗原识别表位都在S‑HBsAg的“a”决定簇。以上研究得到的单克隆抗体都有共同的弊端，就是丢失人源化抗体的天然性。已有的研究数据表明，针对乙肝病毒具有较高血清中和效力的志愿者体内，能够产生具有较高体外中和效力、并能有效抑制体内乙肝病毒扩增的anti‑HBs单克隆抗体(1,2)。重组表达出多个天然人源化anti‑HBs，在体外实验中，大多数抗体具有中和效力；值得一提的是，在人肝嵌合小鼠的体内感染实验中，单一抗体治疗数周后，小鼠体内的病毒就会发生明显的病毒逃逸现象；而利用识别不同表位、具有互补性的单克隆抗体治疗则能更为有效地抑制小鼠的病毒血症并防止病毒逃逸。由此可见，从乙肝疫苗接种者中分离得到的anti‑HBs，在体内外实验模型中均具有阻断HBV感染和抑制病毒复制的作用。
[0007] 乙肝病毒虽然为DNA病毒，但复制过程中涉及通过RNA逆转录酶的中间过程，而且DNA多聚酶不具备自我纠错的功能，相较其他DNA病毒更容易产生基因组核苷酸突变，在此过程中生成HBV突变体。这些发生突变的新序列大多数都无法与野生型病毒有效竞争或不可生存，但当有选择压力是，这些新生序列为突变体的出现提供了一个起点。提到病毒突变体，我们通常会提及新冠病毒或流感病毒等RNA病毒，它们可以产生庞大而快速的突变，不同的是，HBV的环状DNA基因组上具有部分重叠的4个开放阅读框(ORF)，可编码产生7种蛋白质，由于基因重叠限制了病毒的变异性，因此已经为4种基因确定了突变体或者变异形式。HBV的突变有一定的倾向性，其中HBsAg上的“a”决定簇是突变概率较高的区域，而人类对HBsAg的免疫反应也主要针对“a”决定簇的二硫键构象表位，当突变发生引起相应蛋白的氨基酸位点的改变及蛋白空间结构和特性(构象表位)的改变，就会导致抗体无法中和病毒感染，还有可能影响诊断检测。已有文献报道Q129R(3)，M133T(4)，D144A，D144E，G145R(5)和G145K(6)等。其中G145R突变体是文献中提及的最主要的一种HBsAg突变体。该突变体最早是在HBV阳性母亲所生小孩在接种疫苗的情况下，仍发生了突破性感染，尽管孩子对野生型病毒有anti‑HBs的保护性抗体，但这个G145R突变体的DNA和HBsAg持续存在(5,7)。这提示我们，乙肝疫苗产生的抗体对野生型HBV是具有保护作用的，但对HBV的突变株的保护作用是有限的。
[0008] 现有的人源乙肝表面抗体产品主要乙肝免疫球蛋白(HBIg)，是一种浓缩的预防乙肝病毒入侵复制的被动免疫制剂，其生产方式是从健康献血员中筛选血浆中含有较高滴度的anti‑HBs，后经生物浓缩工艺制成高效价的乙肝免疫球蛋白。但血源性的HBIg也存在一些问题，例如HBIg所需的原材料是高滴度anti‑HBs的血浆，产品的产量和使用规模也比较有限，同时鉴于各个批次之间血浆供应个体的差异，不同产品批次之间的品质和有效性也存在差异，特别是有效性方面来说，浓缩获得的HBIg中可能只有部分抗体具有中和HBV的作用；尽管国家对血液制品管控严格，但对“健康献血员”检测的各类指标仍很有限，从生物安全角度来讲，HBIg的安全性较差，临床上使用的HBIg的剂量也被限制200IU；最后，接受HBIg注射的患者可能产生过敏反应，如IgG4过敏，如在肝移植等免疫抑制状态下的患者，还可能发生恶心、风疹、关节痛等不良症状。HBIg用于临床上阻断HBV传播说明anti‑HBs在阻断HBV传染方面具有可行性，但其存在的问题也提示，急需开发可用于工程化批量生产、高效安全，最好同时能够阻断突变株的anti‑HBs。
[0009] 近年来国内外不少实验室采用生物技术分离乙肝疫苗接种者外周血细胞、再从B细胞克隆获得人源抗体，存在来源单一，不能覆盖不同基因型或临床突变体等问题。因此，本领域对于具有改进性能的乙肝表面抗体，一直存在需要。
具体实施方式
[0166] 本文公开了特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合HBsAg胞外结构域中的表位。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段具有优异的抗原结合能力、体外中和效力、以及能识别各类突变株的广谱性。在某些实施方案中，所述抗体为人单克隆抗体。
[0167] 为方便起见，以下章节概述了本文所用术语的各种含义，之后论述了关于抗体或其抗原结合片段的各个方面，接着通过具体实施例证明了抗体或其抗原结合片段的各种实施方案。
[0168] 一、定义
[0169] 应该理解，前述一般说明及以下详述仅为例示性和解释性，并非限制所要求保护的本发明。在本申请中，除非另外明确说明，否则单数的使用包括复数。在本申请中，除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括”以及其它形式例如“包含”的使用并非限制性的，并涵盖术语“由……组成”。
[0170] 本文所用章节标题仅用于组织目的，不能理解为限制所述的主题。为任何目的，本申请中所引用的所有文献或文献的部分(包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍及论文)都在此以其整体引作参考。
[0171] 术语“乙肝表面抗原(HBsAg)”是指乙肝病毒外壳部分所包含的表面抗原，对病毒侵染宿主细胞尤为重要，同时也是机体免疫系统(如抗体)识别的重要位点。HBsAg蛋白包含4个跨膜区，其中S区中有一段长约70个氨基酸的胞外结构域，其结构如图1所示。HBsAg蛋白的氨基酸全长序列如SEQ ID NO:497所示，其中氨基酸残基99‑169的胞外结构域用下划线表示。
[0172] MESTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPTCPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLLPGTSTTSTGPCKTCTIPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFAGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYNILSPFLPLLPIFFCLWVYI(SEQ ID NO:497)。
[0173] 术语“多核苷酸”或“核酸”包括单链和双链核苷酸聚合体二者。包含多核苷酸的核苷酸可为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或经修饰形式的任一种类型核苷酸。所述修饰包括：碱基修饰，例如溴尿苷和肌苷衍生物；核糖修饰，例如2’,3’‑二脱氧核糖；和核苷酸间连接修饰，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯和氨基磷酸酯等。术语“寡核苷酸”意指包含200个或更少核苷酸的多核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸长10‑60个碱基。在其它实施方案中，寡核苷酸长度为12、13、14、15、16、17、18、19或20‑40个核苷酸。寡核苷酸可为单链或双链，例如用于构建突变基因的单链或双链。寡核苷酸可为有义或反义寡核苷酸。寡核苷酸可包括用于检测测定的标记，包括放射性标记、荧光标记、半抗原或抗原标记。寡核苷酸可用作例如PCR引物、克隆引物或杂交探针。
[0174] 术语“载体”意指用于将蛋白编码信息转移到宿主细胞的任何分子或实体(例如核酸、质粒、噬菌体或病毒)。
[0175] 术语“表达载体”或“表达构建体”是指适于转化宿主细胞并含有指导和/或调控一个或多个可操作地与其连接的异源编码区的表达的核酸序列的载体。表达构建体可包括但不限于：影响或调控转录、翻译的序列；和若存在内含子，则影响可操作地与其连接的编码区的RNA剪接的序列。
[0176] 本文所用“可操作地连接”意指使用该术语的组分处于允许所述组分在合适的条件下实行其固有的功能的关系中。例如，让“可操作地连接”到蛋白编码序列的载体中的调控序列与蛋白编码序列连接，以便在与调控序列的转录活性兼容的条件下完成所述蛋白编码序列的表达。
[0177] 术语“宿主细胞”意指业已被或能够被核酸序列转化并藉此表达目的基因的细胞。不管后代在形态上或在遗传构成上与原始母细胞是否相同，只要后代存在目的基因，该术语就包括所述母细胞的后代。
[0178] 术语“转染”意指细胞吸收外来或外源DNA，当将所述外源DNA引入到细胞膜内时所述细胞就被“转染”了。多种转染技术在本领域众所周知并公开于本文中。参见例如Graham等，1973,Virology 52:456；Sambrook等，2001,Molecular Cloning:A LaboratoryManual，见上述；Davis等，1986,Basic Methods in MolecularBiology,Elsevier；Chu等，1981,Gene 13:197。所述技术可用于将一种或多种外源DNA部分引入到合适的宿主细胞中。
[0179] 术语“转化”是指细胞中遗传特性的改变，当细胞被修饰成含有新DNA或RNA时，所述细胞就被转化了。例如，当通过经由转染、转导或其它技术引入新遗传物质来对细胞天然状态进行遗传修饰时，细胞被转化了。转染或转导后，转化的DNA可通过在物理上整合到细胞染色体而与细胞DNA重组，或可作为染色体外元件不被复制而短暂保留，或可作为质粒独立复制。当转化的DNA随着细胞分裂复制时，认为细胞已经被“稳定地转化”了。
[0180] 术语“氨基酸”包括其在本领域中的一般含义。本文使用常规的单字母氨基酸代码和三字母氨基酸代码，如表1中所示。
[0181] 表1
[0182]
[0183] 20种常规氨基酸的立体异构体(例如D‑氨基酸)、非天然氨基酸例如α‑,α‑二取代的氨基酸、N‑烷基氨基酸、乳酸和其它非常规氨基酸也可为本发明的抗体的合适组分。非常规氨基酸实例包括：4‑羟基脯氨酸、γ‑羧基谷氨酸、ε‑N,N,N‑三甲基赖氨酸、ε‑N‑乙酰基赖氨酸、O‑磷酸丝氨酸、N‑乙酰基丝氨酸、N‑甲酰基甲硫氨酸、3‑甲基组氨酸、5‑羟基赖氨酸、σ‑N‑甲基精氨酸和其它相似的氨基酸和亚氨基酸(例如4‑羟基脯氨酸)。在本文所用的多肽记号中，左手方向为氨基末端方向，右手方向为羧基末端方向，与标准用法和习惯一致。
[0184] 蛋白(例如抗体)的“变体”包含相对于另一蛋白序列在氨基酸序列中插入、缺失和/或取代一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。变体包括融合蛋白。
[0185] 术语“同一性”是指通过比对和比较序列而确定的两个或多个多肽分子或两个或多个核酸分子序列之间的关系。“同一性百分率”意指被比较的分子内的氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，其基于被比较的大小最小的分子计算。对于这些计算，优选通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)来解决比对中的空位(如果存在的话)。可用于计算比对的核酸或多肽同一性的方法包括如下文献中所述的方法：ComputationalMolecularBiology，(Lesk,A.M.编辑),1988,New York:Oxford University Press；Biocomputing Informatics and Genome Projects,(Smith,D.W.编辑),1993,New York:Academic Press；Computer Analysis ofSequence Data,Part I,(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑),1994,New Jersey:Humana Press；von Heinje,G.,1987,Sequence Analysis in Molecular Biology,New York:Academic Press；Sequence Analysis Primer,(Gribskov,M.和Devereux,J.编辑),1991,New York:M.StocktonPress；和Carillo等，1988,SIAMJ.AppliedMath.48:1073。
[0186] 在计算同一性百分率时，通常以得到序列之间的最大匹配的方式来比对待比较的序列。可用于测定同一性百分率的计算机程序的一个实例为GCG程序包，其包括GAP(Devereux等，1984,Nucl.Acid Res.12:387；Genetics Computer Group,University ofWisconsin,Madison,WI)。将计算机算法GAP用于比对待测定序列同一性百分比的两个多肽或多核苷酸。根据其各自的氨基酸或核苷酸的最佳匹配对序列进行比对(由算法来确定“匹配跨度”)。结合所述方法使用空位开放罚分(计算为3x平均对角线，其中所述“平均对角线”为所用比较矩阵的对角线的平均值；所述“对角线”为通过特定比较矩阵分配给每一完美的氨基酸匹配的分值或数值)和空位延伸罚分(其通常为空位开放罚分的1/10倍)以及比较矩阵例如PAM 250或BLOSUM 62。在某些实施方案中，所述算法也使用标准比较矩阵(对于PAM 250比较矩阵，参见Dayhoff等，1978,Atlas ofProtein Sequence and Structure，5:345‑35 2；对于BLOSU M 62比较矩阵 ，参见Henikof f等，199 2 ,
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:10915‑10919)。
[0187] 在用GAP程序测定多肽或核苷酸序列的同一性百分率中可采用的参数实例如下：算法：Needleman等，1970,J.Mol.Biol.48:443‑453；比较矩阵：来自Henikoff等，1992，上述的BLOSUM 62；空位罚分：12(但对末端空位不罚分)；空位长度罚分：4；相似性阀值：0。
[0188] 用于比对两个氨基酸序列的某些比对设计可导致仅两个序列的短区域匹配，即使在两个全长序列间没有显著的关系，这种小比对区也可具有极高的序列同一性。因此，如果需要产生跨越靶标多肽的至少50个或其它数目的邻接氨基酸的比对，则可调整所选择的比对方法(GAP程序)。
[0189] 术语“衍生物”是指包括除氨基酸(或核酸)的插入、缺失或取代外的化学修饰的分子。在某些实施方案中，衍生物包括共价修饰，其包括但不限于与聚合物、脂类或其它有机或无机部分化学键合。在某些实施方案中，化学修饰的抗原结合蛋白可比未进行化学修饰的抗原结合蛋白具有更长的循环半衰期。在某些实施方案中，化学修饰的抗原结合蛋白可改进靶向所期需细胞、组织和/或器官的能力。在某些实施方案中，对衍生的抗原结合蛋白进行共价修饰以使其包含一种或多种水溶性聚合连接物，其包括但不限于聚乙二醇、聚氧乙二醇或聚丙二醇。在某些实施方案中，衍生的抗原结合蛋白包含一种或多种聚合物，其包括但不限于单甲氧基‑聚乙二醇、葡聚糖、纤维素或基于其它基于糖类的聚合物、聚‑(N‑乙烯吡咯烷酮)‑聚乙二醇、丙二醇同聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化的多元醇(例如乙二醇)和聚乙烯醇以及所述聚合物的混合物。
[0190] 在某些实施方案中，用聚乙二醇(PEG)亚单位共价修饰衍生物。在某些实施方案中，在一个或多个特定位置(例如在衍生物的氨基末端)键合一种或多种水溶性聚合物体。在某些实施方案中，将一种或多种水溶性聚合物随机连接到衍生物的一个或多个侧链上。
在某些实施方案中，将PEG用于改进抗体或其抗原结合片段的治疗能力。在某些实施方案中，将PEG用于改进人源化抗体的治疗能力。某些所述方法于例如美国专利第6,133,426号中论述，其为任何目的在此引作参考。
[0191] 术语“抗体”是指任何同种型的完整免疫球蛋白或其可与完整抗体竞争特异性结合靶抗原的片段，并且包括例如嵌合抗体、人源化抗体、人全抗体和双特异性抗体。“抗体”是一类抗原结合蛋白。完整抗体通常将包含至少两条全长重链和两条全长轻链，但在某些情况下可包括较少的链，例如骆驼中天然存在的抗体可仅包含重链。抗体可仅来源于单一来源，或可为“嵌合”的，也即抗体的不同部分可来源于两种不同的抗体。可在杂交瘤中；通过重组DNA技术或通过酶学或化学裂解完整抗体，来产生抗原结合蛋白、抗体或结合片段。除非另外指出，否则术语“抗体”除包括包含两条全长重链和两条全长轻链的抗体外，还包括其衍生物、变体和片段。此外，除非明确将其排除在外，否则抗体分别包括单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、双特异性抗体、结构域抗体、合成抗体(本文有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合体(本文有时称为“抗体缀合物”)及其片段。
[0192] 天然存在的抗体结构单元通常包含四聚体。每一四聚体通常由两个同样的多肽链对组成，每一对具有一条全长“轻链”(在某些实施方案中，约25kDa)和一条全长“重链”(在某些实施方案中，约50‑70kDa)。每条链的氨基末端部分通常包含约100‑110个或更多个氨基酸的可变区，所述可变区通常负责抗原识别。每条链的羧基末端部分通常定义为可负责效应功能的恒定区。人轻链通常分为κ和λ轻链。重链通常分为μ、δ、γ、α或ε链，并且抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG有若干亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亚类，包括但不限于IgM1和IgM2。IgA同样被再分为亚类，包括但不限于IgA1和IgA2。在全长轻链和重链内，通常可变区和恒定区由约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，且重链还包括约10个以上氨基酸的“D”区。参见例如Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.编辑，第二版，Raven Press,N.Y.(1989))(其为所有目的以其整体在此引作参考)。每一轻链/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。
[0193] 在某些实施方案中，即使是在同一物种的抗体之间，不同的抗体可变区在氨基酸序列上广泛变化。抗体可变区通常决定特定抗体针对其靶标的特异性。
[0194] 可变区通常表现出由三个高变区连接的相对保守的构架区(FR)的相同一般结构，所述高变区也被称为互补决定区或CDR。通常通过构架区定位来自每对两条链的CDR，所述CDR使得可结合特异性表位。两条轻链和重链可变区从N‑末端到C‑末端通常包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。向每一结构域的氨基酸分配通常与如下定义一致：Kabat Sequences ofProteins ofImmunological Interest(National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1987和1991))或Chothia&Lesk,J.Mol.Biol.,196:901‑917(1987)；Chothia等，Nature,342:878‑883(1989)。国际免疫遗传学(IMGT)数据库(http://www.imgt.org)提供了抗原结合位点的标准化编号和定义。CDR与IMGT划分之间的对应性在Lefranc et al.,Dev Comparat Immunol 27:55‑77,2003中有所描述。除非另外指明，本公开内容中所涉及的CDR序列按照IMGT编号和定义。
[0195] 按惯例，重链中的CDR区通常被称为H1、H2和H3，并且从氨基末端到羧基末端的方向按顺序编号。轻链中的CDR区通常被称为L1、L2和L3，并且从氨基末端到羧基末端的方向按顺序编号。
[0196] 术语“轻链”包括全长轻链及其具有足以赋予结合特异性的可变区序列的片段。全长轻链包含可变区结构域VL和恒定区结构域CL。轻链的可变区结构域位于多肽的氨基末端。轻链包括κ链和λ链。
[0197] 术语“重链”包括全长重链及其具有足以赋予结合特异性的可变区序列的片段。全长重链包含可变区结构域VH和三个恒定区结构域CH1、CH2和CH3。VH结构域位于多肽的氨基末端，而CH结构域位于羧基末端，且CH3最接近多肽的羧基末端。重链可为任何同种型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型)、IgA(包括IgA1和IgA2亚型)、IgM和IgE。
[0198] 术语“抗原结合片段”包括但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体以及单链抗体分子。
[0199] “Fc”区包含两个含抗体CH1和CH2结构域的重链片段。所述两个重链片段通过两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。
[0200] “Fab片段”包含一条轻链和一条重链的CH1及可变区。Fab分子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。
[0201] “Fab’片段”包含一条轻链和含有VH结构域及CH1结构域还有CH1和CH2结构域之间的区域的一条重链的部分，因此在两个Fab’片段的两条重链间可形成链间二硫键以形成F(ab’)2分子。
[0202] “F(ab’)2片段”含有两条轻链和含有CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的两条重链，由此在两条重链之间形成链间二硫键。因此F(ab’)2片段由通过两条重链之间的二硫键保持在一起的两个Fab’片段组成。
[0203] “Fv片段”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺乏恒定区。
[0204] “单链抗体”为Fv分子，其中重链和轻链可变区由弹性接头连接在一起以形成单多肽链，从而形成抗原结合区。单链抗体详述于国际专利申请公开号WO 88/01649和美国专利第4,946,778号及第5,260,203号中，它们的内容在此引作参考。
[0205] “单克隆抗体”是指具有单一分子组成的同质抗体群。单克隆抗体可以是非特异性的，也可以是多特异性的。
[0206] “结构域抗体”为只含有重链可变区或轻链可变区的具免疫学功能的免疫球蛋白片段。在某些情况下，两个或多个VH区与肽接头共价连接以形成二价结构域抗体。二价结构域抗体的这两个VH区可靶向相同或不同的抗原。
[0207] “多特异性抗体”为靶向不止一种抗原或表位的抗体。“双特异性”、“双重特异性”或“双功能”抗体分别为具有两个不同的抗原结合位点的杂合抗体。双特异性抗体的两个结合位点将结合两种不同的表位，所述表位可位于相同或不同的蛋白靶标上。
[0208] 当抗体结合一个靶标比其结合第二个靶标更紧密时，其为“选择性”抗体。
[0209] “重组抗体”为用重组技术制备的抗体。用于制备重组抗体的方法和技术在本领域众所周知。
[0210] 双特异性或双功能抗体通常为人工杂合抗体，其具有两个不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点。可通过多种方法(包括但不限于融合杂交瘤或连接Fab’片段)来制备双特异性抗体。参见例如Songsivilai等，Clin.Exp.Immunol.,79:315‑321(1990)；Kostelny等，J.Immunol.,148:1547‑1553(1992)。
[0211] 每个单独的免疫球蛋白链通常由若干个“免疫球蛋白结构域”组成，每个免疫球蛋白结构域由大约90‑110个氨基酸组成并具有特有的折叠方式。这些结构域为组成抗体多肽的基本单元。在人中，IgA和IgD同种型含有四条重链和四条轻链；IgG和IgE同种型含有两条重链和两条轻链；而IgM同种型含有五条重链和五条轻链。重链C区通常包含一个或多个可负责效应功能的结构域。重链恒定区结构域的数目将视同种型而定。例如，IgG重链含有三个称为CH1、CH2和CH3的C区结构域。提供的抗体可具有任何这些同种型和亚型。
[0212] 术语“中和”指结合配体并防止或降低配体的生物学作用。这可例如通过直接封阻配体上的结合位点或通过结合配体并通过间接方式(例如配体的结构或能量改变)改变配体的结合能力来实现。在评估抗体或其抗原结合片段的结合情况和/或特异性中，当过量的抗体降低结合到配体的结合配偶体的量至少约1‑20、20‑30％、30‑40％、40‑50％、50‑60％、60‑70％、70‑80％、80‑85％、85‑90％、90‑95％、95‑97％、97‑98％、98‑99％或更多(根据体外竞争性结合测定所测量)时，抗体或片段可基本上抑制配体与其结合配偶体的结合。在某些实施方案中，经由竞争测定来表征和/或描述中和能力。在某些实施方案中，中和能力以
50％抑制浓度(IC50)值来描述。
[0213] 术语“靶标”是指能够被抗体或其抗原结合片段结合的分子或分子部分。在某些实施方案中，靶标可具有一个或多个表位。在某些实施方案中，靶标为抗原。在短语“抗原结合片段”中“抗原”的使用仅表示包含可被抗体结合的抗原的蛋白序列。在该情况下，所述蛋白不一定是外源的或不一定能够诱导免疫反应。
[0214] 当术语“竞争”用于竞争相同表位的中和抗体的情况中时，意指在抗体之间竞争，其通过以下测定法来测定：在所述测定法中，待检测的抗体或其抗原结合片段防止或抑制(例如降低)参考抗体与共同抗原(例如S蛋白或其结构域)的特异性结合。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗体是否与另一种竞争，这些测定例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如Stahli等，1983,Methods in Enzymology 9:242‑253)；固相直接生物素‑亲和素EIA(参见例如Kirkland等，1986,J.Immunol.137:3614‑3619)、固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见例如Harlow和Lane,1988,Antibodies,A Laboratory Manual(抗体，实验室手册),Cold Spring HarborPress)；用I‑125标记物的固相直接标记RIA(参见例如Morel等，1988,Molec.Immunol.25:7‑15)；固相直接生物素‑亲和素EIA(参见例如Cheung,等，1990,Virology176:546‑552)；和直接标记的RIA(Moldenhauer等，1990,Scand.J.Immunol.32:
77‑82)。通常所述测定法涉及使用结合荷有未标记的检测抗体及标记的参考抗体任一种的固态表面或细胞的纯化抗原。通过测量在所测抗体存在下结合固态表面或细胞的标记量来测量竞争性抑制。通常所测抗体过量存在。通常当竞争的抗体过量存在时，其将抑制(例如降低)至少40‑45％、45‑50％、50‑55％、55‑60％、60‑65％、65‑70％、70‑75％或75％或更多参考抗体与共同抗原的特异性结合。在某些情况下，结合被抑制至少80‑85％、85‑90％、90‑
95％、95‑97％或97％或更多。
[0215] 术语“抗原”是指能够被选择性结合剂例如抗体或其免疫学功能片段结合的分子或分子部分。在某些实施方案中，能够将抗原用于动物以产生能够结合该抗原的抗体。抗原可拥有能够与不同的抗体作用的一个或多个表位。
[0216] 术语“表位”包括能够被抗体结合的任何决定簇。表位为抗原区域，其被靶向该抗原的抗体结合。当抗原为蛋白时，其包含直接与抗体接触的特定氨基酸。大部分情况下，表位位于蛋白上，但在某些情况下，可位于其它种类的分子上，例如核酸。表位决定簇可包括分子的化学活性表面簇，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并可具有特定的三维结构特点和/或特定的电荷特点。
[0217] 术语“治疗有效量”是指确定在哺乳动物中产生治疗反应的本发明的抗体或其抗原结合片段的量。所述治疗有效量易于由本领域一般技术人员确定。
[0218] 术语“患者”和“受试者”可互换使用，包括人和非人动物受试者以及患有正式确诊的疾病的对象、患未被正式确定的疾病的对象、接受医学治疗的对象、有发展疾病风险的对象等。
[0219] 术语“治疗”包括治疗性治疗、预防性治疗及在降低受试者发展疾病的风险或其它风险因素中的应用。治疗不需要完全治愈疾病，而是包括在其中减轻症状或减轻潜在风险因素的实施方案。
[0220] 术语“预防”不需要100％消除事件的可能性。更准确地说，它表示在所述抗体或方法存在下事件发生的可能性得到降低。
[0221] 可将标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养及转化(例如电穿孔、脂质转染)。可按照厂商说明书来实施酶学反应及纯化技术，或根据本领域通用的方法来完成或如本文所述进行。通常可按照本领域众所周知的常规方法，以及阐述于在本说明书中各处引用并讨论的各种一般性及更特定的参考文献，来实施前述技术和方法。参见例如Sambrook等，Molecular Cloning:A LaboratoryManual(第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))，其为任何目的在此引作参考。除非提供明确定义，否则所使用的与本文所述的分析化学、合成有机化学及医药和制药化学相关的术语及实验方法和技术为本领域众所周知并在本领域常常使用。可将标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制及递送和治疗患者。
[0222] 二、本发明的抗体及其制备方法
[0223] 本公开内容提供了能够结合HBV并中和其活性的有效抗体或其抗原结合片段(以下统称为“抗体”)。本发明人还发现与乙肝疫苗接种者供体相比，从乙肝感染康复者供体中克隆的抗体在识别不同的乙肝病毒表面抗原方面，显示出更好的作用效果，在中和乙肝病毒突变体和降低乙肝突变抗原方面更具优势。
[0224] 在一些实施方案中，本文所述的抗体以小于0.5μg/ml的50％抑制浓度(IC50)值体外中和HBV以及其突变株。在一些实施方案中，本文所述的抗体以小于0.25μg/ml的50％抑制浓度(IC50)值体外中和HBV以及其突变株。在一些实施方案中，本文所述的抗体以小于0.1μg/ml的50％抑制浓度(IC50)值体外中和HBV以及其突变株。如实施例中基于细胞的体外中和测定所述来测量本文所述的抗体的IC50值。
[0225] 本发明涉及针对HBV以及其突变株的分离的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明涉及结合HBsAg蛋白的分离的抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，本发明涉及结合HBsAg胞外结构域中的表位的分离的抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，本发明涉及结合HBsAg的氨基酸残基99‑169中的表位的分离的抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，本发明涉及结合HBsAg的氨基酸残基124‑147中的表位的分离的抗体或其抗原结合片段。
[0226] 在一个实施方案中，所述HBsAg蛋白包含单或双位点突变。在一个实施方案中，所述突变选自Q101R、Q101K、M103I、P105L、L109I、L109R、I110L、S113N、T114R、T115N、T116N、T118K、P120S、P120T、P120K‑T123D、K122I、K122R‑G145R、T123N、T123N‑T143S、C124R、T125M、T126S、A128V、Q129H、G130N、G130R、M133T、F134L、F134V‑D144G、C137Y、C137Y‑D144V、C138Y、K141E、P142S、P142L‑G145R、T143I、T143L、D144E、D144E‑G145R、G145E、G145R、N146S、C149Y和Y161F，以及它们任何两种或更多种的组合。在一个实施方案中，所述突变是G145R。在一个实施方案中，所述突变是K122R‑G145R。在一个实施方案中，所述突变是F134L。
[0227] 在一个方面，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段特异性地结合HBsAg，其特征在于所述分离的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述重链可变区VH包含互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区VL包含互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3选自以下氨基酸序列：
[0228] a)SEQ ID NO:2的CDRH1、SEQ ID NO:3的CDRH2、SEQ ID NO:4的CDRH3、SEQ ID NO:6的CDRL1、SEQ ID NO:7的CDRL2和SEQ ID NO:8的CDRL3；
[0229] b)SEQ ID NO:10的CDRH1、SEQ ID NO:11的CDRH2、SEQ ID NO:12的CDRH3、SEQ ID NO:14的CDRL1、SEQ ID NO:15的CDRL2和SEQ ID NO:16的CDRL3；
[0230] c)SEQ ID NO:18的CDRH1、SEQ ID NO:19的CDRH2、SEQ ID NO:20的CDRH3、SEQ ID NO:22的CDRL1、SEQ ID NO:23的CDRL2和SEQ ID NO:24的CDRL3；
[0231] d)SEQ ID NO:26的CDRH1、SEQ ID NO:27的CDRH2、SEQ ID NO:28的CDRH3、SEQ ID NO:30的CDRL1、SEQ ID NO:31的CDRL2和SEQ ID NO:32的CDRL3；
[0232] e)SEQ ID NO:34的CDRH1、SEQ ID NO:35的CDRH2、SEQ ID NO:36的CDRH3、SEQ ID NO:38的CDRL1、SEQ ID NO:39的CDRL2和SEQ ID NO:40的CDRL3；
[0233] f)SEQ ID NO:42的CDRH1、SEQ ID NO:43的CDRH2、SEQ ID NO:44的CDRH3、SEQ ID NO:46的CDRL1、SEQ ID NO:47的CDRL2和SEQ ID NO:48的CDRL3；
[0234] g)SEQ ID NO:50的CDRH1、SEQ ID NO:51的CDRH2、SEQ ID NO:52的CDRH3、SEQ ID NO:54的CDRL1、SEQ ID NO:55的CDRL2和SEQ ID NO:56的CDRL3；
[0235] h)SEQ ID NO:58的CDRH1、SEQ ID NO:59的CDRH2、SEQ ID NO:60的CDRH3、SEQ ID NO:62的CDRL1、SEQ ID NO:63的CDRL2和SEQ ID NO:64的CDRL3；
[0236] i)SEQ ID NO:66的CDRH1、SEQ ID NO:67的CDRH2、SEQ ID NO:68的CDRH3、SEQ ID NO:70的CDRL1、SEQ ID NO:71的CDRL2和SEQ ID NO:72的CDRL3；
[0237] j)SEQ ID NO:74的CDRH1、SEQ ID NO:75的CDRH2、SEQ ID NO:76的CDRH3、SEQ ID NO:78的CDRL1、SEQ ID NO:79的CDRL2和SEQ ID NO:80的CDRL3；
[0238] k)SEQ ID NO:82的CDRH1、SEQ ID NO:83的CDRH2、SEQ ID NO:84的CDRH3、SEQ ID NO:86的CDRL1、SEQ ID NO:87的CDRL2和SEQ ID NO:88的CDRL3；
[0239] l)SEQ ID NO:90的CDRH1、SEQ ID NO:91的CDRH2、SEQ ID NO:92的CDRH3、SEQ ID NO:94的CDRL1、SEQ ID NO:95的CDRL2和SEQ ID NO:96的CDRL3；
[0240] m)SEQ ID NO:98的CDRH1、SEQ ID NO:99的CDRH2、SEQ ID NO:100的CDRH3、SEQ ID NO:102的CDRL1、SEQ ID NO:103的CDRL2和SEQ ID NO:104的CDRL3；
[0241] n)SEQ ID NO:106的CDRH1、SEQ ID NO:107的CDRH2、SEQ ID NO:108的CDRH3、SEQ ID NO:110的CDRL1、SEQ ID NO:111的CDRL2和SEQ ID NO:112的CDRL3；
[0242] o)SEQ ID NO:114的CDRH1、SEQ ID NO:115的CDRH2、SEQ ID NO:116的CDRH3、SEQ ID NO:118的CDRL1、SEQ ID NO:119的CDRL2和SEQ ID NO:120的CDRL3；
[0243] p)SEQ ID NO:122的CDRH1、SEQ ID NO:123的CDRH2、SEQ ID NO:124的CDRH3、SEQ ID NO:126的CDRL1、SEQ ID NO:127的CDRL2和SEQ ID NO:128的CDRL3；
[0244] q)SEQ ID NO:130的CDRH1、SEQ ID NO:131的CDRH2、SEQ ID NO:132的CDRH3、SEQ ID NO:134的CDRL1、SEQ ID NO:135的CDRL2和SEQ ID NO:136的CDRL3；
[0245] r)SEQ ID NO:138的CDRH1、SEQ ID NO:139的CDRH2、SEQ ID NO:140的CDRH3、SEQ ID NO:142的CDRL1、SEQ ID NO:143的CDRL2和SEQ ID NO:144的CDRL3；
[0246] s)SEQ ID NO:146的CDRH1、SEQ ID NO:147的CDRH2、SEQ ID NO:148的CDRH3、SEQ ID NO:150的CDRL1、SEQ ID NO:151的CDRL2和SEQ ID NO:152的CDRL3；
[0247] t)SEQ ID NO:154的CDRH1、SEQ ID NO:155的CDRH2、SEQ ID NO:156的CDRH3、SEQ ID NO:158的CDRL1、SEQ ID NO:159的CDRL2和SEQ ID NO:160的CDRL3；
[0248] u)SEQ ID NO:162的CDRH1、SEQ ID NO:163的CDRH2、SEQ ID NO:164的CDRH3、SEQ ID NO:166的CDRL1、SEQ ID NO:167的CDRL2和SEQ ID NO:168的CDRL3；
[0249] v)SEQ ID NO:170的CDRH1、SEQ ID NO:171的CDRH2、SEQ ID NO:172的CDRH3、SEQ ID NO:174的CDRL1、SEQ ID NO:175的CDRL2和SEQ ID NO:176的CDRL3；
[0250] w)SEQ ID NO:178的CDRH1、SEQ ID NO:179的CDRH2、SEQ ID NO:180的CDRH3、SEQ ID NO:182的CDRL1、SEQ ID NO:183的CDRL2和SEQ ID NO:184的CDRL3；
[0251] x)SEQ ID NO:186的CDRH1、SEQ ID NO:187的CDRH2、SEQ ID NO:188的CDRH3、SEQ ID NO:190的CDRL1、SEQ ID NO:191的CDRL2和SEQ ID NO:192的CDRL3；
[0252] y)SEQ ID NO:194的CDRH1、SEQ ID NO:195的CDRH2、SEQ ID NO:196的CDRH3、SEQ ID NO:198的CDRL1、SEQ ID NO:199的CDRL2和SEQ ID NO:200的CDRL3；
[0253] z)SEQ ID NO:202的CDRH1、SEQ ID NO:203的CDRH2、SEQ ID NO:204的CDRH3、SEQ ID NO:206的CDRL1、SEQ ID NO:207的CDRL2和SEQ ID NO:208的CDRL3；
[0254] aa)SEQ ID NO:210的CDRH1、SEQ ID NO:211的CDRH2、SEQ ID NO:212的CDRH3、SEQ ID NO:214的CDRL1、SEQ ID NO:215的CDRL2和SEQ ID NO:216的CDRL3；
[0255] bb)SEQ ID NO:218的CDRH1、SEQ ID NO:219的CDRH2、SEQ ID NO:220的CDRH3、SEQ ID NO:222的CDRL1、SEQ ID NO:223的CDRL2和SEQ ID NO:224的CDRL3；
[0256] cc)SEQ ID NO:226的CDRH1、SEQ ID NO:227的CDRH2、SEQ ID NO:228的CDRH3、SEQ ID NO:230的CDRL1、SEQ ID NO:231的CDRL2和SEQ ID NO:232的CDRL3；
[0257] dd)SEQ ID NO:234的CDRH1、SEQ ID NO:235的CDRH2、SEQ ID NO:236的CDRH3、SEQ ID NO:238的CDRL1、SEQ ID NO:239的CDRL2和SEQ ID NO:240的CDRL3；
[0258] ee)SEQ ID NO:242的CDRH1、SEQ ID NO:243的CDRH2、SEQ ID NO:244的CDRH3、SEQ ID NO:246的CDRL1、SEQ ID NO:247的CDRL2和SEQ ID NO:248的CDRL3；
[0259] ff)SEQ ID NO:250的CDRH1、SEQ ID NO:251的CDRH2、SEQ ID NO:252的CDRH3、SEQ ID NO:254的CDRL1、SEQ ID NO:255的CDRL2和SEQ ID NO:256的CDRL3；
[0260] gg)SEQ ID NO:258的CDRH1、SEQ ID NO:259的CDRH2、SEQ ID NO:260的CDRH3、SEQ ID NO:262的CDRL1、SEQ ID NO:263的CDRL2和SEQ ID NO:264的CDRL3；
[0261] hh)SEQ ID NO:266的CDRH1、SEQ ID NO:267的CDRH2、SEQ ID NO:268的CDRH3、SEQ ID NO:270的CDRL1、SEQ ID NO:271的CDRL2和SEQ ID NO:272的CDRL3；
[0262] ii)SEQ ID NO:274的CDRH1、SEQ ID NO:275的CDRH2、SEQ ID NO:276的CDRH3、SEQ ID NO:278的CDRL1、SEQ ID NO:279的CDRL2和SEQ ID NO:280的CDRL3；
[0263] jj)SEQ ID NO:282的CDRH1、SEQ ID NO:283的CDRH2、SEQ ID NO:284的CDRH3、SEQ ID NO:286的CDRL1、SEQ ID NO:287的CDRL2和SEQ ID NO:288的CDRL3；
[0264] kk)SEQ ID NO:290的CDRH1、SEQ ID NO:291的CDRH2、SEQ ID NO:292的CDRH3、SEQ ID NO:294的CDRL1、SEQ ID NO:295的CDRL2和SEQ ID NO:296的CDRL3；
[0265] ll)SEQ ID NO:298的CDRH1、SEQ ID NO:299的CDRH2、SEQ ID NO:300的CDRH3、SEQ ID NO:302的CDRL1、SEQ ID NO:303的CDRL2和SEQ ID NO:304的CDRL3；
[0266] mm)SEQ ID NO:306的CDRH1、SEQ ID NO:307的CDRH2、SEQ ID NO:308的CDRH3、SEQ ID NO:310的CDRL1、SEQ ID NO:311的CDRL2和SEQ ID NO:312的CDRL3；
[0267] nn)SEQ ID NO:314的CDRH1、SEQ ID NO:315的CDRH2、SEQ ID NO:316的CDRH3、SEQ ID NO:318的CDRL1、SEQ ID NO:319的CDRL2和SEQ ID NO:320的CDRL3；
[0268] oo)SEQ ID NO:322的CDRH1、SEQ ID NO:323的CDRH2、SEQ ID NO:324的CDRH3、SEQ ID NO:326的CDRL1、SEQ ID NO:327的CDRL2和SEQ ID NO:328的CDRL3；
[0269] pp)SEQ ID NO:330的CDRH1、SEQ ID NO:331的CDRH2、SEQ ID NO:332的CDRH3、SEQ ID NO:334的CDRL1、SEQ ID NO:335的CDRL2和SEQ ID NO:336的CDRL3；
[0270] qq)SEQ ID NO:338的CDRH1、SEQ ID NO:339的CDRH2、SEQ ID NO:340的CDRH3、SEQ ID NO:342的CDRL1、SEQ ID NO:343的CDRL2和SEQ ID NO:344的CDRL3；
[0271] rr)SEQ ID NO:346的CDRH1、SEQ ID NO:347的CDRH2、SEQ ID NO:348的CDRH3、SEQ ID NO:350的CDRL1、SEQ ID NO:351的CDRL2和SEQ ID NO:352的CDRL3；
[0272] ss)SEQ ID NO:354的CDRH1、SEQ ID NO:355的CDRH2、SEQ ID NO:356的CDRH3、SEQ ID NO:358的CDRL1、SEQ ID NO:359的CDRL2和SEQ ID NO:360的CDRL3；
[0273] tt)SEQ ID NO:362的CDRH1、SEQ ID NO:363的CDRH2、SEQ ID NO:364的CDRH3、SEQ ID NO:366的CDRL1、SEQ ID NO:367的CDRL2和SEQ ID NO:368的CDRL3；
[0274] uu)SEQ ID NO:370的CDRH1、SEQ ID NO:371的CDRH2、SEQ ID NO:372的CDRH3、SEQ ID NO:374的CDRL1、SEQ ID NO:375的CDRL2和SEQ ID NO:376的CDRL3；
[0275] vv)SEQ ID NO:378的CDRH1、SEQ ID NO:379的CDRH2、SEQ ID NO:380的CDRH3、SEQ ID NO:382的CDRL1、SEQ ID NO:383的CDRL2和SEQ ID NO:384的CDRL3；
[0276] ww)SEQ ID NO:386的CDRH1、SEQ ID NO:387的CDRH2、SEQ ID NO:388的CDRH3、SEQ ID NO:390的CDRL1、SEQ ID NO:391的CDRL2和SEQ ID NO:392的CDRL3；
[0277] xx)SEQ ID NO:394的CDRH1、SEQ ID NO:395的CDRH2、SEQ ID NO:396的CDRH3、SEQ ID NO:398的CDRL1、SEQ ID NO:399的CDRL2和SEQ ID NO:400的CDRL3；
[0278] yy)SEQ ID NO:402的CDRH1、SEQ ID NO:403的CDRH2、SEQ ID NO:404的CDRH3、SEQ ID NO:406的CDRL1、SEQ ID NO:407的CDRL2和SEQ ID NO:408的CDRL3；
[0279] zz)SEQ ID NO:410的CDRH1、SEQ ID NO:411的CDRH2、SEQ ID NO:412的CDRH3、SEQ ID NO:414的CDRL1、SEQ ID NO:415的CDRL2和SEQ ID NO:416的CDRL3；
[0280] aaa)SEQ ID NO:418的CDRH1、SEQ ID NO:419的CDRH2、SEQ ID NO:420的CDRH3、SEQ ID NO:422的CDRL1、SEQ ID NO:423的CDRL2和SEQ ID NO:424的CDRL3；
[0281] bbb)SEQ ID NO:426的CDRH1、SEQ ID NO:427的CDRH2、SEQ ID NO:428的CDRH3、SEQ ID NO:430的CDRL1、SEQ ID NO:431的CDRL2和SEQ ID NO:432的CDRL3；
[0282] ccc)SEQ ID NO:434的CDRH1、SEQ ID NO:435的CDRH2、SEQ ID NO:436的CDRH3、SEQ ID NO:438的CDRL1、SEQ ID NO:439的CDRL2和SEQ ID NO:440的CDRL3；
[0283] ddd)SEQ ID NO:442的CDRH1、SEQ ID NO:443的CDRH2、SEQ ID NO:444的CDRH3、SEQ ID NO:446的CDRL1、SEQ ID NO:447的CDRL2和SEQ ID NO:448的CDRL3；
[0284] eee)SEQ ID NO:450的CDRH1、SEQ ID NO:451的CDRH2、SEQ ID NO:452的CDRH3、SEQ ID NO:454的CDRL1、SEQ ID NO:455的CDRL2和SEQ ID NO:456的CDRL3；
[0285] fff)SEQ ID NO:458的CDRH1、SEQ ID NO:459的CDRH2、SEQ ID NO:460的CDRH3、SEQ ID NO:462的CDRL1、SEQ ID NO:463的CDRL2和SEQ ID NO:464的CDRL3；
[0286] ggg)SEQ ID NO:466的CDRH1、SEQ ID NO:467的CDRH2、SEQ ID NO:468的CDRH3、SEQ ID NO:470的CDRL1、SEQ ID NO:471的CDRL2和SEQ ID NO:472的CDRL3；
[0287] hhh)SEQ ID NO:474的CDRH1、SEQ ID NO:475的CDRH2、SEQ ID NO:476的CDRH3、SEQ ID NO:478的CDRL1、SEQ ID NO:479的CDRL2和SEQ ID NO:480的CDRL3；
[0288] iii)SEQ ID NO:482的CDRH1、SEQ ID NO:483的CDRH2、SEQ ID NO:484的CDRH3、SEQ ID NO:486的CDRL1、SEQ ID NO:487的CDRL2和SEQ ID NO:488的CDRL3；和
[0289] jjj)SEQ ID NO:490的CDRH1、SEQ ID NO:491的CDRH2、SEQ ID NO:492的CDRH3、SEQ ID NO:494的CDRL1、SEQ ID NO:495的CDRL2和SEQ ID NO:496的CDRL3。
[0290] 在某些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述重链可变区VH包含互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区VL包含互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3包含在一处或多处含有不超过2个氨基酸的取代、缺失或插入的如上所述的氨基酸序列。
[0291] 在一个方面，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段特异性地结合HBsAg，其特征在于所述分离的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述重链可变区VH和轻链可变区VL选自以下氨基酸序列：
[0292] a)SEQ ID NO:1的VH和SEQ ID NO:5的VL；
[0293] b)SEQ ID NO:9的VH和SEQ ID NO:13的VL；
[0294] c)SEQ ID NO:17的VH和SEQ ID NO:21的VL；
[0295] d)SEQ ID NO:25的VH和SEQ ID NO:29的VL；
[0296] e)SEQ ID NO:33的VH和SEQ ID NO:37的VL；
[0297] f)SEQ ID NO:41的VH和SEQ ID NO:45的VL；
[0298] g)SEQ ID NO:49的VH和SEQ ID NO:53的VL；
[0299] h)SEQ ID NO:57的VH和SEQ ID NO:61的VL；
[0300] i)SEQ ID NO:65的VH和SEQ ID NO:69的VL；
[0301] j)SEQ ID NO:73的VH和SEQ ID NO:77的VL；
[0302] k)SEQ ID NO:81的VH和SEQ ID NO:85的VL；
[0303] l)SEQ ID NO:89的VH和SEQ ID NO:93的VL；
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[0347] ddd)SEQ ID NO:441的VH和SEQ ID NO:445的VL；
[0348] eee)SEQ ID NO:449的VH和SEQ ID NO:453的VL；
[0349] fff)SEQ ID NO:457的VH和SEQ ID NO:461的VL；
[0350] ggg)SEQ ID NO:465的VH和SEQ ID NO:469的VL；
[0351] hhh)SEQ ID NO:473的VH和SEQ ID NO:477的VL；
[0352] iii)SEQ ID NO:481的VH和SEQ ID NO:485的VL；和
[0353] jjj)SEQ ID NO:489的VH和SEQ ID NO:493的VL。
[0354] 在某些实施方案中，所述重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的氨基酸序列各自独立地与以上任一序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
[0355] 在某些实施方案中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段特异性地结合HBsAg，其特征在于所述分离的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述重链可变区VH包含SEQ ID NO:50的CDRH1、SEQ ID NO:51的CDRH2和SEQ ID NO:52的CDRH3，所述轻链可变区VL包含SEQ ID NO:54的CDRL1、SEQ ID NO:55的CDRL2和SEQ ID NO:56的CDRL3。
[0356] 在某些实施方案中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段特异性地结合HBsAg，其特征在于所述分离的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:49的重链可变区VH和SEQ ID NO:53的轻链可变区VL。
[0357] 在某些实施方案中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段特异性地结合HBsAg，其特征在于所述分离的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述重链可变区VH包含SEQ ID NO:234的CDRH1、SEQ ID NO:235的CDRH2和SEQ ID NO:236的CDRH3，所述轻链可变区VL包含SEQ ID NO:238的CDRL1、SEQ ID NO:239的CDRL2和SEQ ID NO:240的CDRL3。
[0358] 在某些实施方案中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段特异性地结合HBsAg，其特征在于所述分离的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:233的重链可变区VH和SEQ ID NO:237的轻链可变区VL。
[0359] 在某些实施方案中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段特异性地结合HBsAg，其特征在于所述分离的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述重链可变区VH包含SEQ ID NO:282的CDRH1、SEQ ID NO:283的CDRH2和SEQ ID NO:284的CDRH3，所述轻链可变区VL包含SEQ ID NO:286的CDRL1、SEQ ID NO:287的CDRL2和SEQ ID NO:288的CDRL3。
[0360] 在某些实施方案中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段特异性地结合HBsAg，其特征在于所述分离的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:281的重链可变区VH和SEQ ID NO:285的轻链可变区VL。
[0361] 本发明的抗体的序列信息如下：
[0362]
[0363]
[0364]
[0365]
[0366]
[0367]
[0368]
[0369]
[0370]
[0371]
[0372]
[0373]
[0374]
[0375]
[0376] 包含上文所述的VH或VL氨基酸序列的本发明抗体的变体在本发明的范围之内。例如，变体可在VH和/或VL中包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个不会对抗体特性产生不利影响的氨基酸置换。在一些实施方案中，相对于本发明的VH或VL氨基酸序列的序列同一性可为约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。示例性修饰为例如在抗原结合位点中或在框架中的保守氨基酸置换，这些置换不会不利地改变抗体的特性。还可作出保守置换以改善抗体特性，例如稳定性或亲和力。保守置换是在其侧链中相关的氨基酸家族内发生的那些置换。基因编码的氨基酸可分为四类：(1)酸性(天冬氨酸、谷氨酸)；(2)碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；(3)非极性(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；以及(4)非荷电极性(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被共同分类为芳族氨基酸。另选地，氨基酸所有组成成分可以分组为：(1)酸性(天冬氨酸、谷氨酸)；(2)碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、(3)脂族的(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸)，其中丝氨酸和苏氨酸任选地分别分组为含羟基脂族的；(4)芳族(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)；(5)酰胺(天冬酰胺、谷氨酰胺)；和(6)含硫(半胱氨酸和甲硫氨酸)(Stryer(编辑)，Biochemistry，第2版，WH Freeman and Co.，1981)。此外，多肽中的任何天然残基还可以用丙氨酸来置换，如此前针对丙氨酸扫描诱变所述(MacLennan et al(1998)Acta
Physiol.Scand.Suppl.643:55‑67；Sasaki et al(1998)Adv.Biophys.35:1‑24)。所需的氨基酸置换可以由本领域技术人员在需要此类置换时确定。可使用本文所述的测定法来测试所得抗体变体的特征。
[0377] 氨基酸置换可以例如通过PCR诱变来进行(美国专利号4,683,195)。另选地，可使用已知的方法生成变体文库，例如使用随机(NNK)密码子或非随机密码子(例如DVK密码子，其编码11个氨基酸(Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、Lys、Asn、Arg、Ser、Tyr、Trp))，然后在文库内筛选具有所需特性的变体。
[0378] 尽管本发明的抗体包括成对的可变区，一个来自重链并且一个来自轻链，但本领域技术人员将认识到另选实施方案可包括单一重链可变区或单一轻链可变区。单一可变区可用于筛选能够形成二结构域特异性抗原结合片段的可变结构域。所述筛选可通过噬菌体展示筛选方法来完成，这些方法使用例如国际专利公布号WO92/01047所公开的分级双重组合法。在该组合法中，使用包含H链克隆或L链克隆的单个菌落来感染编码另一条链(L或H)的克隆的完全文库，然后根据所描述的噬菌体展示技术来选择所得的双链特异性抗原结合结构域。因此，单独的VH多肽链和VL多肽链可用于鉴定特异性地结合至S蛋白结构域的另外的抗体，该鉴定过程采用国际专利公布号WO92/01047中所公开的方法。
[0379] 可使用多种用于产生抗体的技术来制备本发明的抗体。例如，可使用Kohler和Milstein在Nature 256:495,1975中提出的杂交瘤方法来产生单克隆抗体。在杂交瘤方法中，用S蛋白或其片段来免疫小鼠或其他宿主动物(诸如仓鼠、大鼠或猴)，之后使用标准方法将来自免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59‑103(Academic Press,1986))。筛选出由单个永生化杂交瘤细胞产生的菌落，用以制备具有所需特性(诸如结合特异性、交叉反应性或缺乏结合特异性、缺乏交叉反应性，以及抗原的亲和力)的抗体。
[0380] 可使用各种宿主动物制备本发明的抗体。例如，可使用Balb/c小鼠来制备抗体。可使用各种技术来人源化在Balb/c小鼠和其他非人动物体内制备的抗体，以产生更类似人的序列。包括选择人受体框架的示例性人源化技术是本领域技术人员已知的，包括CDR接枝(美国专利号5,225,539)、SDR接枝(美国专利号6,818,749)、表面重塑(Padlan,Mol Immunol 28:489‑499,1991)、特异性决定残基表面重塑(美国专利公布号20100261620)、人改型(或人框架改型)(美国专利公布号US2009/0118127)、超人源化(美国专利号7,709,226)和定向选择(Osbourn et al(2005)Methods 36:61‑68,2005；美国专利号5,565,332)。
[0381] 可采用诸如国际专利公布号WO90/007861和国际专利公布号WO92/22653中所述的那些公开的技术，通过引入修改的框架支持残基来保持结合亲和力(回复突变)，来进一步优化人源化抗体以改善其对所需抗原的选择性或亲和力。
[0382] 可使用基因组中携带人免疫球蛋白(Ig)基因座的转基因小鼠来产生抗目标蛋白质的人抗体，这描述于例如国际专利公布号WO90/04036、美国专利号6150584、国际专利公布号WO99/45962、国际专利公布号WO02/066630、国际专利公布号WO02/43478；Lonberg etal(1994)Nature 368:856‑9；Green et al(1994)Nature Genet.7:13‑21；Green&Jakobovits(1998)Exp.Med.188:483‑95；Lonberg and Huszar(1995)Int.Rev.Immunol.13:65‑93；Bruggemann et al(1991)Eur.J.Immunol.21:1323‑1326；
Fishwild et al(1996)Nat.Biotechnol.14:845‑851；Mendez et al(1997)Nat.Genet.15:
146‑156；Green(1999)J.Immunol.Methods 231:11‑23；Yang et al(1999)Cancer Res.59:
1236‑1243；Brüggemann and Taussig(1997)Curr.Opin.Biotechnol.8:455‑458；国际专利公布号WO02/043478)。可破坏此类鼠中的内源性免疫球蛋白基因座或使该基因座缺失，并且可使用转染色体或微小基因，通过同源或非同源重组将至少一种完整或部分的人免疫球蛋白基因座插入小鼠基因组中。
[0383] 人抗体可选自噬菌体展示文库，其中噬菌体经工程改造以表达人免疫球蛋白或其部分，诸如Fab、单链抗体(scFv)或者未配对或配对抗体可变区(Knappiket al(2000)J.Mol.Biol.296:57‑86；Krebset al(2001)J.Immunol.Meth.254:67‑84；Vaughanet al(1996)Nature Biotechnology14:309‑314；Sheets etal(1998)PITAS(USA)95:6157‑6162；Hoogenboom and Winter,(1991)J.Mol.Biol.227:381；Marks et al(1991)
J.Mol.Biol.222:581)。本发明的抗体可分离自例如噬菌体展示文库，所述噬菌体展示文库将抗体的重链可变区和轻链可变区表达为具有噬菌体pIX外壳蛋白的融合蛋白，如Shi et al(2010)J.Mol.Biol.397:385‑96和国际专利公布No.WO09/085462中所述。可筛选文库中结合至S蛋白的噬菌体，并可进一步表征获得的阳性克隆，从克隆裂解物分离Fab，将其表达为全长IgG。此类用于分离人抗体的噬菌体展示方法描述于例如：授予Ladner等人的美国专利号5,223,409、5,403,484和5,571,698；授予Dower等人的美国专利号5,427,908和5,580,
717；授予McCafferty等人的美国专利号5,969,108和6,172,197；以及授予Griffiths等人的美国专利号5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915和6,593,081。
[0384] 免疫原性抗原的制备以及单克隆抗体的产生可用任何合适的技术诸如重组蛋白产生来执行。免疫原性抗原可按纯化蛋白质或蛋白质混合物(包括全细胞、细胞提取物或组织提取物)的形式施用于动物，或者抗原可在动物体内由编码所述抗原或其部分的核酸从头形成。
[0385] 本发明的另一个实施方案是一种分离的多核苷酸，其编码本发明的任一个抗体重链可变区和/或抗体轻链可变区。鉴于在给定表达系统中的遗传密码简并性或密码子优先性而编码本发明的同一抗体的多种多核苷酸也在本发明的范围内。编码本发明抗体的VH或VL或它们的片段的多核苷酸序列可有效连接至一个或多个调控元件，诸如启动子或增强子，所述调控元件允许核苷酸序列在预期宿主细胞中表达。多核苷酸可为cDNA。
[0386] 本发明的另一个实施方案是一种包含本发明的多核苷酸的载体。此类载体可以是质粒载体、病毒载体、用于杆状病毒表达的载体、基于转座子的载体或任何其他适于通过任何手段将本发明的合成多核苷酸引入给定生物体或遗传背景的载体。例如，将任选地连接至恒定区并且编码本发明抗体的轻链可变区和/或重链可变区的多核苷酸插入表达载体中。可将轻链和/或重链克隆到相同或不同的表达载体中。可将编码免疫球蛋白链的DNA片段有效连接至一个或多个表达载体中确保免疫球蛋白多肽表达的对照序列。此类对照序列包括信号序列、启动子(例如，天然相关联的或异源的启动子)、增强子元件和转录终止子序列，对此类对照序列进行选择，以使其与选择用于表达抗体的宿主细胞相容。一旦载体被结合到适当的宿主中，该载体将宿主保持在适于高水平表达蛋白质的条件下，所述蛋白质由结合的多核苷酸编码。
[0387] 合适的表达载体通常可以在宿主生物体中作为游离基因或宿主染色体DNA的一部分进行复制。通常，表达载体包含选择标记，诸如氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性、卡那霉素抗性或新霉素抗性，以便对那些转化了所需DNA序列的细胞进行检测。
[0388] 合适的启动子和增强子元件是本领域已知的。对于在细菌细胞中的表达，示例性启动子包括lacl、lacZ、T3、T7、gpt、λP和trc。对于真核细胞中的表达，示例性启动子包括轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子和增强子元件；细胞巨化病毒极早期启动子；单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；早期和晚期SV40启动子；存在于逆转录酶病毒长末端重复序列中的启动子；小鼠金属硫蛋白‑I启动子；以及各种本领域已知的组织特异性启动子。对于酵母细胞中的表达，示例性启动子是组成型启动子，诸如ADH1启动子、PGK1启动子、ENO启动子、PYK1启动子等等；或调控型启动子，诸如GAL1启动子、GAL10启动子、ADH2启动子、PH05启动子、CUP1启动子、GAL7启动子、MET25启动子、MET3启动子、CYC1启动子、HIS3启动子、ADH1启动子、PGK启动子、GAPDH启动子、ADC1启动子、TRP1启动子、URA3启动子、LEU2启动子、ENO启动子、TP1启动子和AOX1(例如，用于毕赤酵母(Pichia))。对合适的载体和启动子的选择在本领域普通技术人员的能力范围内。
[0389] 大量合适的载体和启动子都是本领域的技术人员已知的；许多可商购获得用于生成受试者重组构建体。以下载体以举例的方式提供。细菌载体：pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene,La Jolla,Calif.,USA)；pTrc99A、pKK223‑3、pKK233‑3、pDR540和pRIT5(Pharmacia,Uppsala,Sweden)。真核载体：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG(Stratagene)，pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)。
[0390] 本发明的另一个实施方案是一种包含一个或多个本发明的载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”是指其中已引入载体的细胞。应当理解，术语“宿主细胞”不仅旨在指特定的受试细胞，还指这种细胞的子代，而且也指由特定受试细胞产生的稳定细胞系。由于突变或者由于环境影响，在后代中可能出现某些修饰，因此这种子代可能与亲本细胞不同，但仍包含在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。此类宿主细胞可以是真核细胞、原核细胞、植物细胞或古菌细胞。
[0391] 大肠杆菌(Escherichia coli)、杆菌属(bacilli)(诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))和其他肠杆菌科(enterobacteriaceae)(诸如沙门氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia))以及各种假单胞菌属(Pseudomonas)物种是原核宿主细胞的示例。其他微生物诸如酵母也可用于表达。酵母属(Saccharomyces)(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae))和毕赤酵母属(Pichia)是合适的酵母宿主细胞的示例。示例性的真核细胞可以来自哺乳动物、昆虫、鸟类或其他动物来源。哺乳动物真核细胞包括无限增殖化细胞系，诸如杂交瘤或骨髓瘤细胞系，诸如SP2/0(美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas,VA,CRL‑1581)、NS0(欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)，Salisbury,Wiltshire,UK，ECACC No.85110503)、FO(ATCC CRL‑1646)和Ag653(ATCC CRL‑1580)鼠细胞系。一种示例性人骨髓瘤细胞系是U266(ATTC CRL‑TIB‑196)。其他可用的细胞系包括来源于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的那些细胞系，诸如CHO‑K1SV(Lonza Biologics,Walkersville,MD)、CHO‑K1(ATCC CRL‑61)或DG44。
[0392] 本发明的另一个实施方案是一种制备本发明的抗体的方法，该方法包括在使该抗体表达的条件下培养本发明的宿主细胞，然后回收由该宿主细胞产生的抗体。制备抗体并将其纯化的方法是本领域所熟知的。全部抗体、其二聚体、各条轻链和/或重链、或者其他抗体片段(诸如VH和/或VL)一旦被合成(以化学方式或重组方式)，就可根据标准程序进行纯化，所述标准程序包括硫酸铵沉淀、亲和色谱柱、柱层析法、高效液相色谱(HPLC)纯化、凝胶电泳等等(参见generally Scopes,Protein Purification(Springer‑Verlag,N.Y.,(1982))。抗体可以基本上是纯净的，例如，至少约80％至85％纯净、至少约85％至90％纯净、至少约90％至95％纯净、或至少约98％至99％纯净，或者更加纯净，例如不含污染物(诸如细胞碎片、除受试抗体之外的大分子等)。
[0393] 本发明的另一个实施方案是一种用于制备本发明的抗体的方法，该方法包括：
[0394] 将编码抗体VH的第一多核苷酸和编码抗体VL的第二多核苷酸结合到表达载体中；
[0395] 用该表达载体转化宿主细胞；
[0396] 在使VL和VH表达以及形成所述抗体的条件下，在培养基中培养宿主细胞；然后[0397] 从宿主细胞或培养基回收抗体。
[0398] 使用标准分子生物方法将编码本发明的特定VH或VI序列的多核苷酸结合到载体中。使用熟知的方法完成宿主细胞转化、培养、抗体表达和纯化。
[0399] 三、组合物和给药方法
[0400] 本发明提供了药物组合物，这些药物组合物包含本文所述的抗体，以及药学上可接受的载剂。出于治疗用途，本发明的抗体可被制备成药物组合物，这些药物组合物包含有效量的抗体，作为药学上可接受的载体中的活性成分。术语“载剂”是指据以施用所述活性化合物的稀释剂、辅助剂、赋形剂或媒介物。此类媒介物可以是液体，诸如水和油，包括那些来源于石油、动物、植物的油或合成的油，诸如花生油、大豆油、矿物油和芝麻油等。例如，可使用0.4％的盐水和0.3％的甘氨酸。这些溶液是无菌的，并且通常不含颗粒物。它们可通过熟知的常规灭菌技术(例如，过滤)进行灭菌。所述组合物可根据需要含有药学上可接受的辅助物质，以接近生理条件，所述辅助物质诸如pH调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。此类药物制剂中的本发明抗体的浓度可在很大范围内变化，即，从小于约0.5重量％，通常到至少约1重量％至多达15重量％、20重量％、25重量％、30重量％、35重量％、40重量％、45重量％或50重量％，并且将根据所选择的具体施用方式，主要基于所需的剂量、流体体积、粘度等进行选择。合适的媒介物及制剂(包含其他人蛋白例如人血清白蛋白在内)描述于例如Remington:The Science and Practice ofPharmacy，第21版，Troy，D.B.编辑，LipincottWilliams andWilkins,Philadelphia,PA 2006，第5部分，Pharmaceutical Manufacturing，第691‑1092页，特别参见第958‑989页。
[0401] 本文所述的本发明方法中的施用本发明的抗体的方式可为任何合适的途径，诸如胃肠外施用，例如真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下、肺、粘膜(口腔、鼻内、阴道内、直肠)或技术人员了解的其他方式，这是本领域众所周知的。
[0402] 本文所述的本发明方法中的抗体可通过任何合适的途径施用至患者，例如通过静脉内(i.v.)输注或推注进行肠胃外施用，肌肉内施用、皮下施用或腹膜内施用。可在例如15、30、60、90、120、180或240分钟内，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时内给予静脉内输注。
[0403] 在一个实施方案中，本文所述的本发明方法中将治疗有效量的本发明的抗体施用于受试者。抗体的“治疗有效量”可通过标准研究技术确定。例如，可采用体外测定法来帮助鉴定最佳剂量范围。任选地，本发明抗体的治疗有效量可通过将抗体施用至本领域熟知的相关动物模型来确定。对具体的有效剂量的选择可由本领域的技术人员基于对若干种因素的考量(例如，经由临床试验)来确定。此类因素包括待治疗或预防的疾病、所涉及的症状、患者体重、患者免疫状态以及技术人员已知的其他因素。在制剂中待使用的精确剂量也将取决于给药途径以及疾病的严重程度，并且应该根据医生的判断和每位患者的情况来决定。有效剂量可通过来自体外或动物模型测试体系的剂量响应曲线来推导。可以使用本文所述模型中的任何一个来测试本发明抗体的功效和有效剂量。
[0404] 本发明的方法中的抗体可在一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、一个月、五周、六周、七周、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或更长时间之后重复施用。也可以重复治疗疗程，按照慢性施用一样。重复施用可为相同剂量或不同剂量。
[0405] 本发明的方法中的抗体也可被预防性地施用，以降低受试者感染HBV的风险，延迟HBV感染的发作，和/或降低处于缓解状态的HBV感染复发的风险。
[0406] 本文所述的本发明方法中的抗体可冻干储存，并在使用之前在合适的载体中复原。此项技术已被证实对常规的蛋白制剂有效，并且可采用熟知的冻干和复原技术。
[0407] 在一个实施方案中，本公开内容的药物组合物包含一种或多种本文所述的抗体。本领域技术人员容易理解，当机体感染的HBV是有多种突变时，或机体在药物或免疫压力下产生多种突变时，一种或多种结合不同突变位点的抗体的组合在治疗和预防方面将具有更大的临床意义和价值。
[0408] 在一个实施方案中，本公开内容的药物组合物还包含一种或多种第二药剂或抗体。多种药剂或抗体的联合使用是本领域众所周知的，并且由本领域技术人员根据常规实践而易于实施。
[0409] 现结合以下具体的非限制性实施例描述本发明，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。
[0410] 材料与方法
[0411] 发明人从乙肝感染康复者供体外周血PBMC，以流式细胞术的方法分选出乙肝表面抗体特异性的B细胞。随后通过PCR的方法，对细胞内的抗体序列进行克隆，通过测序获得抗体序列，并构建在表达载体上。通过瞬时转染的方法，将质粒导入细胞内，进行蛋白表达，进而收集细胞上清，纯化浓缩抗体。
[0412] 本发明所涉及的人受试者均根据复旦大学伦理委员会审批通过(项目伦理号：2020‑C013)，在复旦大学基础医学院进行涉及所有供体样品的实验。参与研究者，325名为乙肝感染康复者供体，16例为乙肝疫苗免疫后anti‑HBs高滴度供体。用于筛选志愿者的血清标本均在标本采集后，在56℃热灭活60分钟，并分装储存与‑80℃冰箱。从乙肝感染康复者供体AA14、BH2、CC7和EB4，乙肝疫苗接种者供体C10、C12和C14抽取200ml血液后，分离人外周血单核细胞(PBMC)，随后将分离的PBMC重悬于10％DMSO，90％胎牛血清(已灭活)的冻存液中，并在液氮中冷冻保存。
[0413] B细胞的纯化、诱饵蛋白‑结合B细胞的双荧光染料标记和单细胞分选如前所述(Y.Zhou etal(2020)STAR Protoc 1,100129)。将PBMCs放在37℃水浴锅中速融，并用RPMI培养基进行洗涤，将PBMC与CD19微珠孵育，对B淋巴细胞进行阳性选择。用人Fc block在4℃对细胞表面分子进行封闭，诱饵蛋白‑PE/APC(10ug/ml)和抗‑CD20‑PE‑Cy7(BD Bioscience)连续孵育。在FACSAria II(BD Bioscience)流式细胞仪进行单细胞分选，将单细胞分选至96孔板中，存储在‑80℃。
[0414] 如前所述(Y.Zhou etal(2020)STAR Protoc 1,100129)，对分选的单细胞进行逆转录和抗体序列PCR，经过第一轮PCR和第二轮巢式PCR，在2％琼脂糖凝胶中进行电泳和纯化，随后进行Sanger测序。重链和轻链的序列通过IMGT/V‑QUEST(Brochet,X.etal(2008)Nucl.AcidsRes.36,W503‑508)和IgBlast(J.Ye etal(2013)Nucl.AcidsRes.41,W34‑40)分析，并确定各抗体的V(D)J基因区段和CDR3序列。将所选抗体进行载体构建和抗体表达。
[0415] 本发明获得的抗体进行ELISA检测。将HBsAg抗原用PBS稀释至10ug/ml，4℃包被过夜，然后用溶解在PBS中的2％牛血清白蛋白(BSA)封闭2小时，抗体以10ug/ml为最大浓度，以1:3的稀释比例稀释8个稀释度，加入后在室温孵育1小时。用连接HRP的山羊抗‑人IgG(Thermo Fisher Scientific)进行孵育，最后用ABTS显色液进行显色，BioRad读板机分别在10分钟、20分钟和30分钟进行读值。通过PRISM软件进行分析，并对各抗体计算曲线下面积(AUC)以评估抗原‑结合能力。
[0416] 通过竞争ELISA对抗体之间的相互竞争进行检测，之前已经报道(Q.Wang etal(2020)CellHost&Microbe 28,335‑349)。简要来说，将HBsAg抗原用PBS稀释至3ug/ml包被过夜，第一阻断抗体浓度为15ug/ml，室温孵育2小时。随后在室温下直接加入生物素化第二抗体(0.25ug/ml或0.75ug/ml)，持续作用30分钟。用链霉亲和素‑HRP(BD Bioscience)进行检测。PBS缓冲液代替第一阻断抗体作为标准化参考。
[0417] 通过体外感染HBV病毒的细胞模型进行中和实验(Q.Wang etal(2020)CellHost&Microbe 28,335‑349)。HBV病毒的制备分为两种，一种为细胞系HepDE19来源的HBV病毒，病毒基因型为D型；通过转染不同基因型HBV质粒至HepG2细胞系内，转染试剂为X‑tremeGENE HP(Roche)从而表达A/B/C基因型的HBV病毒。不论稳定细胞系来源的病毒还是转染获得的病毒，均通过超滤管浓缩的方式获得。超滤结束后，对获得的病毒进行分装，并取出少量病毒，10倍梯度稀释后通过qPCR的方法进行HBV拷贝数定量(Sansure Biotech)(F.Shen etal(2018)Hepatology 67,1237‑1252)。将HepG2‑NTCP细胞接种于96孔板中，感染前用含有2％DMSO，3％FBS，1％NEAA和1％青链霉素混合液的DMEM培养基(感染培养基)处理分化24小时。为了血清或抗体的检测中和能力，将人血清(最大浓度10％)或单克隆抗体(最大浓度10ug/ml)按照1:3的比例在感染培养基中连续稀释，共9个稀释度。随后，将稀释的血清或单克隆抗体与HBV病毒在37℃孵育30分钟，然后在加入HepG2‑NTCP细胞中。感染16小时后，每孔
200ul PBS洗5遍，加入感染培养基。培养7天后，CLIA试剂盒检测细胞上清中HBsAg和HBeAg水平(Autobio)，以及免疫荧光检测细胞中HBcAg水平。
[0418] 本发明中用于检测抗体对不同乙肝突变体病毒的中和作用，所使用的病毒为转染质粒(pHBV1.3‑G145R、pHBV1.3‑K122R G145R和pHBV1.3‑F134L)至HepG2细胞，收集上清并浓缩后获得HBV突变体病毒。中和实验操作步骤与上述体外感染HBV病毒的细胞模型进行中和实验的步骤相同。
[0419] 抗体氨基酸表位筛选(氨基酸扫描)、抗体结合不同病毒基因型ELISA以及抗体结合不同病毒突变体实验方法如前所述(Q.Wang etal(2020)Cell Host&Microbe 28,335‑349)。在此简言之，将Huh7.5细胞种与6孔板中，使用lipofectamine 3000(thermo fisher Scientific)将不同突变位点的HBV1.3质粒进行转染。转染后16小时，将细胞培养基更换为含有1％NEAA，1％青链霉素混合液的DMEM培养基，培养3天后收集细胞培养上清，离心去除细胞碎片后，将细胞培养基以100ul每孔孵育ELISA 96孔板，4℃过夜。然后用溶解在PBS中的2％牛血清白蛋白(BSA)封闭2小时，抗体以1ug/ml的浓度孵育，用连接HRP的山羊抗‑人IgG(Thermo Fisher Scientific)进行孵育，最后用ABTS显色液进行显色，BioRad读板机分别在10分钟、20分钟和30分钟进行读值。以抗体结合野生型HBV的读值作为标准化参考，通过PRISM软件进行分析。
[0420] 对于免疫荧光，将细胞在4％多聚甲醛/PBS中室温条件下固定20分钟，用含有0.1M甘氨酸的PBS中和15分钟，然后用0.1％TritonX‑100/PBS。用5％山羊血清/PBS室温封闭1小时。用5％山羊血清/PBS稀释anti‑HBc(Austral BIologicals)，4℃孵育过夜。用山羊抗兔AlexaFluor594(thermo Fisher Scientific)可视化，细胞核用DAPI染色。细胞使用高内涵细胞成像分析仪(Perkin Elmer，Operetta)进行荧光拍摄。
[0421] 统计学分析的详细结果显示与结果和图例部分。ELISA曲线下面积(AUC)、对于抗体中和能力计算的50％抑制浓度(IC50)值在PRISM软件中计算。
[0422] 实施例1.乙肝康复志者个体血清的抗体应答
[0423] 从上海市多家医院收集到感染HBV但已经康复的325个供体血清样本。通过入组供体血清两对半结果抗核心抗体均为阳性，抗乙肝表面抗原抗体滴度不一，并检测乙肝感染康复者血清的中和活性，在过表达乙肝感染受体蛋白钠离子‑牛磺胆酸共转运蛋白(NTCP)的HepG2细胞中，测量了供体血清样本阻断HBV感染HepG2‑NTCP细胞的能力，即中和活性。我们选取了乙肝感染康复者中anti‑HBs滴度高且中和活性高的供体AA14、BH2、CC7和EB4，乙肝疫苗接种者中C10、C12和C14，并将anti‑HBs滴度<2.0IU/ml的供体作为阴性对照。供体的人口统计学信息如表2所示。我们通过稀释血清标本确认不同血清浓度下供体中和活性，如图2。
[0424] 表2.供体的人口统计学信息
[0425]
[0426] 实施例2.获得特异性结合HBsAg的全人源单克隆抗体
[0427] HBV表面蛋白是一种四次跨膜蛋白，可分为preS1、preS2和S三个区域。本发明克隆的抗体主要针对S区域，以CHO纯化的HBsAg蛋白为诱饵蛋白。为了选择个体中表达HBsAg特异性IgG抗体的B细胞，使用双荧光染料标记策略，鉴定HBsAg特异性结合的B细胞(图3)。供体招募时招募到乙肝疫苗接种，但anti‑HBs ELISA滴度小于2mIU/ml的样品供体，以其为实验的阴性对照，其B细胞染色为背景水平的诱饵蛋白特异性B细胞，而具有高血清中和活性的供体AA14、BH2、CC7、EB4以及疫苗免疫供体C10、C12、C14显示诱饵蛋白特异性的B细胞(图4)。
[0428] 流式细胞术圈门双阳性细胞(诱饵蛋白‑PE+和诱饵蛋白‑APC+)经过单细胞分选，并且通过对单个B细胞进行细胞裂解、RNA的逆转录，利用免疫球蛋白重链和轻链基因特异性引物通过巢式PCR反应对特异性B细胞的重链和轻链进行扩增。
[0429] 实施例3.ELISA检测抗体与HBsAg蛋白结合情况
[0430] 在获得抗体序列后，通过将抗体序列克隆至载体上，继而进行蛋白表达和纯化，获得的抗体进行ELISA，以检测抗体结合HBsAg的情况。在此将ELISA检测后的数据在PRISM中计算AUC值。在编号S001‑S108的抗体中，有62个抗体可以与HBsAg结合，在此以AUC值从高到低的顺序展示，见图5。
[0431] 实施例4.HBV细胞感染模型评估抗体中和活性
[0432] 为了确定可以结合HBsAg的抗体能否在体外阻断HBV感染，使用细胞来源浓缩纯化的HBV病毒感染HepG2‑NTCP进行中和作用测定。实验时对抗体进行浓度梯度稀释，然后与相同的病毒进行混合，进而感染HepG2‑NTCP细胞，最后检测细胞上清中HBsAg和HBeAg水平，通过抗体处理组与无抗体处理组进行感染率的比较，计算抗体的50％抑制浓度，即IC50值。这些抗体的中和活性差异显著，范围从有效的中和抗体到几乎不具备中和活性(图6)，具体IC50值见表3。
[0433] 表3.细胞感染模型检测抗体的IC50值
[0434]
[0435] 实施例5.抗体表位分析
[0436] 对上述中和活性较好的S05、S12、S16、S17、S19、S20、S29、S33、S39、S41、S43、S64、S66、S81、S82、S89、S92、S95、S96、S101、S103、S105和S106这23个抗体，其结合表位进行表征。首先确定HBsAg结合抗体结合重叠还是不重叠的表位，进行竞争ELISA。由于S105抗体结合较弱，在此不展示其竞争ELISA的结果。通过竞争ELISA鉴定了3个相互排斥的抗体组(组I、组II和组III)，详见图7，其中组I包括S33、S39、S64、S103和S106，组II包括S29、S43、S41、S66和S81，组III包括S5、S12、S16、S17、S19、S20、S82、S89、S92、S95、S96和S101。
[0437] 抗体识别S蛋白主要是识别HBsAg上胞外段上约72个氨基酸的区域，进一步进行丙氨酸扫描的方法，利用已构建的HBsAg点突变质粒(原始氨基酸突变为丙氨酸)，转染细胞后得到不同氨基酸突变的HBsAg，随后ELISA检测抗体与HBsAg氨基酸突变体能否结合，从而明确所得抗体具体识别的抗原氨基酸位点(图8)。结合竞争ELISA的结果，提示不同分组抗体在识别抗原关键氨基酸位点上有明显聚类。乙肝疫苗免疫供体来源的抗体和乙肝感染后康复供体来源的抗体在识别位点差别显著。影响乙肝疫苗来源抗体的平均氨基酸个数为12.6个，影响乙肝感染康复者来源抗体的平均氨基酸个数为22.1个。乙肝疫苗供体来源的抗体识别的氨基酸位点是不连续，乙肝感染后康复供体识别的氨基酸位点可以是连续3个‑5个氨基酸，例如S43识别143T‑145G，S20识别133M‑136S，S17识别142P‑146N。随后结合竞争ELISA的结果，对抗体丙氨酸扫描结果进行分析，四个组的抗体都是通过识别S蛋白的空间表位，101Q、102G、103M、105P、106V对各个抗体的结合均有影响。四个组的抗体显示出各自特异的氨基酸突变体结合模式，其中I组集中的氨基酸位点为110I、122K、125T、134F、141K和165W；II组识别相关的氨基酸位点为122K、123T、145G、161Y和165W；III组别相关的氨基酸位点主要为109L‑111P、120P‑130G、133M‑136S、144D、146N、153P、161Y、164E‑167S。I组抗体中S64与S33、S39分别来源于两位乙肝疫苗免疫供体，II组抗体中S66与S29、S41分别来源于两位乙肝疫苗免疫供体，提示在不同个体进行乙肝疫苗免疫，获得的抗体具有一定的相似性，但产生的抗体在识别表位上具有多样性，可识别不少于两种非重叠的表位。
[0438] 实施例6.针对不同HBV基因型的结合能力和中和活性
[0439] 乙肝病毒是一种古老的DNA病毒，目前已经确认的基因型有9种，还有一种和一种未定基因型。大量研究表明，不同地区的HBV基因型分布不同。在我国感染HBV的人群中，约60％为B基因型，约30％为C基因型。
[0440] 发明人所在实验室，已经成功建立了不同基因型HBV感染HepG2‑NTCP细胞的体外感染系统，利用该系统检测广谱结合不同基因型HBV的抗体能否在体外阻断不同基因型HBV的感染(图9)。抗体与病毒在体外混合后，37℃孵育1小时，然后感染HepG2‑NTCP细胞，感染后第7天检测细胞上清中HBsAg和HBeAg水平，抗体处理组与无抗体处理组相比，计算抗体的50％抑制浓度，即IC50值。
[0441] 结果显示，S12、S29、S33、S39、S41、S43、S66、S81和S106对A/B/C/D四种基因型均具有中和活性。乙肝感染后康复供体来源的抗体普遍不能很好的中和A基因型的病毒，而大多数乙肝疫苗免疫供体来源的抗体对四种基因型的HBV病毒具有中和活性。
[0442] 实施例7.针对天然存在的HBV突变株的结合能力
[0443] 已有研究报道在乙肝慢性感染的患者中存在很多免疫逃逸。为了检测从乙肝感染康复供体或乙肝疫苗免疫供体得到的抗体能否结合这些突变株，构建了常见乙肝表面抗原氨基酸突变质粒。本发明选择的逃逸突变包括：Q101R、Q101K、M103I、P105L、L109I、L109R、I110L、S113N、T114R、T115N、T116N、T118K、P120S、P120T、P120K‑T123D、K122I、K122R‑G145R、T123N、T123N‑T143S、C124R、T125M、T126S、A128V、Q129H、G130N、G130R、M133T、F134L、F134V‑D144G、C137Y、C137Y‑D144V、C138Y、K141E、P142S、P142L‑G145R、T143I、T143L、D144E、D144E‑G145R、G145E、G145R、N146S、C149Y和Y161F。将上述质粒转染细胞，细胞上清中即为含有HBsAg突变体的抗原，随后通过ELISA实验检测抗体是否与抗原结合(图10)。乙肝疫苗免疫供体来源的抗体可平均识别31个突变位点，乙肝感染后康复供体来源的抗体平均识别37.4个突变位点，两种免疫背景来源的抗体具体识别的HBsAg突变体位点也具有显著差异。以乙肝疫苗免疫供体来源的I组抗体不识别Q101R、P105L、C124R、C137Y、C137Y D144V、C138Y、K141E、C149Y，I组中的S64可识别K122R G145R、P142S、S142LG145R、D144E G 145R、G145E及G145R位点；乙肝疫苗免疫供体来源为主的II组抗体不识别Q101R、P105L、P120K T123D、K122R G145R、T123N、T123N T143S、C124R、C137Y、C137Y D144V、C138Y、S142L G145R、D144E G145R、G145E、G145R，II组中来自乙肝感染后康复供体的S43不能识别上述突变位点，同时也无法识别T143I、T143L和D144E。乙肝感染后康复者供体来源的III组抗体，不能识别Q101R、P105L、P120K T123D、T123N、T123N T143S、G130N、G130R、M133T、C138Y以及C149Y，而能识别对于I组和II组都无法识别的C137Y、C137Y D144Y位点。
临床上最常出现的突变位点是G145R，ELISA结果显示，乙肝疫苗免疫供体来源的抗体只有S64可以识别G145R。
[0444] 实施例8.针对天然存在的HBV突变株的中和活性
[0445] 如实施例6结果所示ELISA检测，本发明涉及具有中和活性的抗体与不同的HBV突变株结合，在此我们挑选了临床上最为常见的HBsAg G145R单一位点突变株，以及HBsAg K122R‑G145R双突变株进行中和实验。在实施例6中，提示乙肝疫苗免疫供体来源的抗体可更好的结合HBsAg F134L突变体，在此也纯化了HBsAg F134L的突变体病毒。
[0446] 实验结果提示，抗体S12、S64、S82和S92四个抗体可以有效中和G145R突变体的HBV病毒，乙肝感染后康复供体来源的S12、S19、S20、S43和乙肝疫苗免疫供体来源的S39、S82、S92可有效中和K122R‑G145R双突变的HBV病毒，乙肝感染后康复供体来源的S12、S43、S103和S106和乙肝疫苗免疫供体来源的S29、S33、S39、S41、S64、S66、S81和S82可有效中和F134L突变的HBV病毒(图11)。
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