[0001] 本发明涉及植物提取技术领域，更具体地说，涉及一种缓解抑郁的沉香复方中药组合物及其制备方法。

[0002] 沉香是中医常用药之一，来源于瑞香科植物沉香Aquilaria agallocha Roxb.和白木香A.sinensis(Lour.)Gilg含树脂的木材。沉香味辛、苦，性微温，具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘的功效。

[0003] 气郁质是由于长期情志不畅、气机郁滞而形成的以性格内向不稳定、忧郁脆弱、敏感多疑为主要表现的体质状态。气郁质的发病倾向为易患郁证、脏躁、百合病等，并且容易受精神刺激。此类患者长期处于气郁偏颇状态，虽也属于正常状态，但当处于疾病状态时，体质的倾向性会使患者在病理上多肝气郁结、痰郁化热、气滞血瘀、气滞痰蕴、肝郁脾虚等。

[0004] 皮质醇是由肾上腺分泌的一种激素，通常被称为“压力激素”。它在应对压力和调节多种生理功能中起着重要作用，高水平的皮质醇可能干扰神经递质的平衡(如血清素和去甲肾上腺素)，这些神经递质与情绪调节密切相关，进而导致抑郁症。皮质醇对免疫系统的调节作用也可能影响抑郁的发展，因为慢性炎症与抑郁症状常常相伴。

[0005] 长期过量的皮质醇分泌会对健康造成不良影响，目前没有一种中药组合物，能够抑制皮质醇的生成。

[0036] 下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0037] 为了进一步说明本发明，下面通过以下实施例进行详细说明。本发明以下实施例和对比例所用的原料均为市售商品。

[0038] 本发明实施例和对比例的沉香提取物的制备方法，包括以下步骤：

[0039] (1)提取：将沉香(Aquilaria spp.)置于50℃烘箱干燥20min后，使用中药粉碎机粉碎并过80目筛，将乙醇加入一定质量的粉末中，固液比为1：25；然后置于80℃的油浴锅中提取80min后，利用圆形滤纸抽滤，滤液备用；滤渣再次加入乙醇，按照上述条件进行重复提取1次后，再经圆形滤纸抽滤，合并两次提取滤液，放入恒温干燥箱中，在50℃下干燥6h，得到沉香粉末。

[0040] (2)在超临界萃取设备中，使用二氧化碳超临界流体对沉香粉末进行萃取，萃取温度为40℃，压力为30MPa，超临界二氧化碳流体的流量设置为300L/h，经过3h的萃取，随后，在80℃下干燥，得到沉香提取物。

[0041] 本发明实施例和对比例的山萝卜花提取物的制备方法，包括以下步骤：

[0042] 使用干燥的山萝卜花(Scabiosa comosa Fisch.ex Roem.et Schult.)，用清水轻轻冲洗花朵，去除杂质和灰尘，再粗粉碎，将粉碎后的花朵放入提取器中，加入山萝卜花10倍质量的水，加热至沸腾后，保持1小时，然后过滤出液体，将提取液通过减压蒸馏、在80℃干燥，得到山萝卜花提取物。

[0043] 本发明实施例和对比例的柴胡提取物的制备方法，包括以下步骤：

[0044] 取柴胡(Bupleurum chinensie DC.)5g，用超纯水清洗杂质，加入200g超纯水，浸泡60min。用电炉煮沸，再用煎煮60min。8层纱布过滤，滤液至50mL离心管内，3000rpm离心滤液35min后，取上清，0.22μm微孔过滤器过滤至无菌离心管内，在80℃干燥，得到柴胡提取物。

[0045] 本发明实施例和对比例的黄芩提取物的制备方法，包括以下步骤：

[0046] 取黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)2g，用超纯水清洗杂质，加入100g超纯水，浸泡60min。用电炉煮沸，再用煎煮60min。8层纱布过滤，滤液至50mL离心管内，3000rpm离心滤液35min后，取上清，0.22μm微孔过滤器过滤至无菌离心管内，在80℃干燥，得到黄芩提取物。

[0047] 实施例1

[0048] 本实施例的沉香复方中药组合物，由以下组分组成：沉香提取物20g，山萝卜花提取物8g，柴胡提取物10g和黄芩提取物10g。

[0049] 上述沉香复方中药组合物的制备方法包括：将各个原料按照比例混合，搅拌均匀，得到沉香复方中药组合物。

[0050] 对比例1

[0051] 本对比例的沉香复方中药组合物，与实施例1相比，区别在于，本对比例只包括沉香提取物、山萝卜花提取物和柴胡提取物，黄芩提取物缺少的量按其他物质的比例分配至对应组分。

[0052] 对比例2

[0053] 本对比例的沉香复方中药组合物，与实施例1相比，区别在于，本对比例只包括沉香提取物、山萝卜花提取物和黄芩提取物，柴胡提取物缺少的量按其他物质的比例分配至对应组分。

[0054] 对比例3

[0055] 本对比例的沉香复方中药组合物，与实施例1相比，区别在于，本对比例只包括沉香提取物、黄芩提取物和柴胡提取物，山萝卜花提取物缺少的量按其他物质的比例分配至对应组分。

[0056] 对比例4

[0057] 本对比例的沉香复方中药组合物，与实施例1相比，区别在于，本对比例只包括黄芩提取物、山萝卜花提取物和柴胡提取物，沉香提取物缺少的量按其他物质的比例分配至对应组分。

[0058] 实施例2

[0059] 本实施例的沉香复方中药组合物，由以下组分组成：沉香提取物30g，山萝卜花提取物5g，柴胡提取物5g和黄芩提取物5g。

[0060] 上述沉香复方中药组合物的制备方法包括：将各个原料按照比例混合，搅拌均匀，得到沉香复方中药组合物。

[0061] 实施例3

[0062] 本实施例的沉香复方中药组合物，由以下组分组成：沉香提取物25g，山萝卜花提取物6g，柴胡提取物7g和黄芩提取物10g。

[0063] 上述沉香复方中药组合物的制备方法包括：将各个原料按照比例混合，搅拌均匀，得到沉香复方中药组合物。

[0064] 试验例1

[0065] 1、培养基及溶液配制

[0066] (1)DMEM完全培养基：向DMEM培养基中加入FBS10％/双抗1％

[0067] (2)LPS：以1×PBS缓冲液为稀释液，配制1mg/ml的LPS溶液

[0068] 2、供试样品对HaCat细胞分泌皮质醇的影响

[0069] (1)细胞接种：将HaCat细胞按10000个/孔接种于96孔板，置于培养箱中培养。

[0070] (2)实验分组：设置阴性对照组、激动剂阳性对照组、抑制剂阳性对照组和样品组。样品组中包括实施例和对比例得到的沉香复方中药组合物，各组均设2‑6个复孔。

[0071] (3)皮质醇转化反应：将50mM的Cortisone溶液稀释至100μM，按50μl/孔加至孔板中，待测样品稀释与加样：以完全培养基为稀释液，按照样品试验浓度表配制不同浓度的样品工作液，加50μl/孔，共100μl/孔反应体系，沉香复方中药组合物的实验浓度采用5.0wt％(沉香复方中药组合物在体系中的质量百分比)。

[0072] 阴性对照组：加等量完全培养基；

[0073] 激动剂阳性对照组：加100μM的Cortisone 100μl/孔；

[0074] 抑制剂阳性对照组：加200μM的Metyrapone 100μl/孔。

[0075] 将以上各组置于培养箱内培养24h，在显微镜下观察细胞形态。

[0076] (4)取孔板中的上清，通过ELISA法检测皮质醇含量，操作步骤如下：

[0077] A、标准品梯度稀释。

[0078] B、收集细胞培养上清液到无菌离心管中，离心取上清。

[0079] C、各反应孔中加入50μl标准品工作液及检测样本，各组均设2个复孔，向各反应孔中加入50μl生物素标记抗体工作液至反应孔，孵育。

[0080] D、弃去液体，甩干，各反应孔中加入洗涤液，浸泡后甩干。

[0081] E、各反应孔中加入100μl HRP标记链霉亲和素工作液至反应孔中，孵育。

[0082] F、各反应孔中加入300μL洗涤液，间隔30s，甩干洗涤液。

[0083] G、各反应孔中加入90μL显色剂至反应孔中，于37℃避光显色15min左右。

[0084] H、各反应孔中加入50μL终止液，即刻用酶标仪450nm波长下测量OD值，OD值与皮质醇含量成反比。

[0085] I、根据标准品的已知浓度和所测OD值计算标准曲线回归方程(R2>0.99)，将样品孔的OD值代入计算所测样品的浓度，再乘稀释倍数即得到原样品的实际皮质醇浓度。实验结果如表1所示。

[0086] 表1

[0087]   浓度 皮质醇含量(ng/ml) 皮质醇抑制率(％)阴性 / ‑67.64 /
阳性 / 248.31 /
美替拉酮 200μM 126.51 49.1
实施例1 5.0wt％ 75.29 69.7
实施例2 5.0wt％ 70.63 71.6
实施例3 5.0wt％ 72.85 70.7
对比例1 5.0wt％ 147.23 40.7
对比例2 5.0wt％ 150.36 39.4
对比例3 5.0wt％ 149.62 39.7

[0088] 由表1可知，与对比例相比，本发明实施例提供的沉香复方中药组合物可以明显皮质醇的生成。

[0089] 试验例2

[0090] 本试验例探究实施例和对比例得到的沉香复方中药组合物对炎症因子IL‑6的抑制效果，具体包括以下步骤：

[0091] (1)细胞接种：将RAW264.7细胞按4500个/孔接种于96孔板，置于37℃，5％ CO2培养箱中培养24h。

[0092] (2)实验分组：设置空白组和样品组，样品组中的受试物为实施例和对比例制得的组合物。

[0093] (3)LPS诱导炎症反应：将1mg/mL的LPS溶液(溶剂为PBS缓冲液)稀释至2μg/mL，按50μL/孔加至孔板中，置于培养箱中培养。

[0094] (4)加样：以完全培养基为稀释液，配制样品工作液，100μL/孔，阴性对照组和阳性对照组加等量完全培养基，置于培养箱内培养24h。

[0095] (5)取孔板中的上清，通过ELISA法检测IL‑6含量，操作步骤如下：

[0096] A、预先计算好所需的酶标条，实验前拿出试剂盒，恢复至室温；

[0097] B、标准品梯度稀释：用标准品&样品稀释液将标准品倍比稀释为500，250，125，62.5，0ng/mL；

[0098] C、收集细胞培养上清液到无菌离心管中，离心取上清；

[0099] D、各反应孔中加入标准品工作液及检测样本，各组均设2个复孔，孵育；

[0100] E、弃去液体，甩干，各反应孔中加入生物素标记抗体工作液至反应孔中，孵育；

[0101] F、弃去液体，甩干，各反应孔中加入洗涤液，浸泡后甩干；

[0102] G、各反应孔中加入HRP标记链霉亲和素工作液至反应孔中，孵育；

[0103] H、各反应孔中加入洗涤液，间隔30s，甩干洗涤液；

[0104] I、各反应孔中加入显色剂至反应孔中，于37℃避光显色15min；

[0105] J、各反应孔中加入终止液，用酶标仪450nm波长下测量OD值；

[0106] K、根据标准品的已知浓度和所测OD值计算标准曲线回归方程(R2>0.99)，将样品孔的OD值代入计算所测样品的浓度，再乘稀释倍数即得到原样品的实际IL‑6浓度。试验结果如表2所示。

[0107] 表2

[0108] 组别 IL‑6分泌量(ng/mL)空白组 1.5
实施例1 0.54
实施例2 0.51
实施例3 0.52
对比例1 1.06
对比例2 1.09
对比例3 1.14
对比例4 1.05

[0109] 由表2可知，相较于对比例，实施例提供的沉香复方中药组合物对炎症因子IL‑6具有明显的抑制效果。

[0110] 所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。