[0001] 本发明属于外泌体技术领域，具体涉及一种细胞外囊泡保护剂及其应用。

[0002] 外泌体(Exosomes)是细胞分泌的小型膜囊泡，直径约30‑150纳米，近年来在生物医学研究中引起了广泛关注。研究发现外泌体在各种正常的生理过程和疾病进程中发挥着各种各样功能，得益于其低免疫原性和靶向性，在疾病治疗方面展现了良好的临床应用潜力。

[0003] 然而，关于外泌体储存条件的研究较少，缺乏标准化的外泌体储存条件。目前常用的‑80℃条件，不同的保存缓冲液中外泌体保存稳定性差异很大，有研究显示( A et al.,Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations.J Extracell Vesicles.2022Jun；11(6):e12238.doi:10.1002/jev2.12238.PMID:35716060；PMCID:PMC 9206228.)，

[0004] 保护效果差的缓冲液中外泌体在1.5个月时浓度下降超过一半，保存效果并不理想。另外，‑80℃保存条件比较苛刻，对于运输和长期保存来说是很大的挑战，严重制约外泌体在临床中的应用。因此，迫切需要开发一个稳定的处方，使高浓度外泌体可以在冷藏(2‑8℃)或常温下保存、运输，并且可以耐多次冻融。

[0055] 下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0056] 实施例1外泌体制剂处方的筛选

[0057] 本发明外泌体制剂处方筛选方案见下方表1。共设置10组处方，其中组1、组2、组3主要筛选缓冲液体系；组4、组5、组6、组7主要通过单因素实验筛选合适的冷冻保护剂，判断是否需要添加F68、白蛋白；组8、组9、组10主要通过多因素组合判断变量之间是否有叠加效果。组11为对比例1(参考专利CN202310822228)、组12为对比例2(参考专利CN202311665550)。

[0058] 表1外泌体制剂处方筛选方案

[0059]

[0060]

[0061] 实施例2外泌体溶液‑80℃、2‑8℃、37℃保存稳定性和冻融稳定性考察

[0062] 1、实验材料

[0063] (1)MSCs(间充质干细胞)外泌体产生方式：外泌体细胞培养上清液是通过从干细胞培养液中去除干细胞以及其他所有细胞成分后得到的余留液体，包括培养基、细胞因子和外泌体。

[0064] (2)MSCs(间充质干细胞)外泌体培养方式：固定床预培养过夜，检测预培养基生物安全性，复苏固定床所需细胞3‑5亿，将所需要量的种子细胞复苏后制成50‑100ml细胞悬液，打开取样孔盖子，将细胞悬液加入罐体内部，开启批次培养模式，参数设置：温度：37℃，pH：7.2，DO：50％，通气量：100ml/min，转速：550rpm，待24h‑72h取样检测GLU、LAC、AMM、LDH，取样观察游离并计游离细胞数，取样条结晶紫染色，观察细胞贴壁状态，DO曲线，待观察细胞贴壁状态良好，打开固定床循环模式参数设置：温度：37℃，pH：7.2，DO：50％，通气量：50ml/min，转速：550rpm，循环流速：10ml/min，取样循环流速：10ml/min。

[0065] (3)上清收集：开启循环模式后收集上清。通过检测NTA来判断固定床外泌体产量和换液数量，关停循环模式，使用清空模式将罐体内部上清排出，上清收集完毕，根据收集量打开填充模式补加完全培养基至达到固定床循环液面开启循环模式继续培养，根据NTA检测数据判断培养周期。

[0066] 2、实验方法

[0067] (1)外泌体制备：同一批MSC细胞培养液上清，经过多级澄清过滤，然后通过300KD中空纤维浓缩，将缓冲液分别置换成生理盐水、PBS、20mM Tris+137mM NaCl三种原液，原液10
外泌体浓度>5×10 颗粒/ml。

[0068] (2)根据表1中筛选方案的设计，用对应的缓冲液稀释对应的外泌体原液至理论浓10
度为5×10 颗粒/ml；并添加相应的保护剂成分，通过分别添加F68母液(1000×)、蔗糖母液(30×)、海藻糖母液(50×)、白蛋白母液(100×)使F68、蔗糖、海藻糖、白蛋白的终浓度分别为0.005％、1.5％、25mM、0.2％。组1、组2、组3不添加保护剂直接分装到5ml西林瓶中，分装规格1ml/瓶，每组8瓶。组4按1:1000添加F68母液(1000×)后分装到到5ml西林瓶中，分装规格1ml/瓶，共10瓶。组5～组10和组4类似，添加相应的保护剂成分后，分装到5ml西林瓶中，分装规格1ml/瓶，每组10瓶。组11制备方法为：将生理盐水保存的原液置换成10mM PBS+
10
0.05％F68+8％海藻糖溶液中，并调整浓度至5×10 颗粒/ml，分装到5ml西林瓶中，分装规格1ml/瓶，每组10瓶。组12制备方法为：将生理盐水保存的原液置换成10mM PB+100mg/ml海
10
藻糖溶液中，并调整浓度至5×10 颗粒/ml，分装到5ml西林瓶中，分装规格1ml/瓶，每组10瓶。所有组的西林瓶在无菌条件下加塞压盖。

[0069] (3)‑80℃、2‑8℃、37℃保存稳定性研究方案

[0070] 将准备好的样品分别放进‑80℃冰箱、2‑8℃冷藏箱、37℃温箱进行相关稳定性实验，方案见表2。12组不同处方的样品各1瓶组成1套样品，‑80℃、2‑8℃温度各放4套样品，每个时间点取出1套样品，通过NTA检测外泌体的浓度、粒径、电位。

[0071] 表2外泌体液体保存稳定性方案

[0072]考察项目 0h 2周 4周
‑80℃ 浓度、粒径、电位 浓度、粒径、电位 浓度、粒径、电位
2‑8℃ 浓度、粒径、电位 浓度、粒径、电位 浓度、粒径、电位

[0073] (4)外泌体溶液冻融稳定性研究方案

[0074] 外泌体溶液冻融稳定性研究方案见表3，0h的1套样品连续进行5次冻融，‑80℃冻，室温溶，冻融频率1天/次。冻融1次、3次、5次取样，通过NTA检测外泌体的浓度、粒径、电位。

[0075] 表3外泌体液体冻融稳定性方案

[0076]

[0077] 3、实验结果

[0078] 外泌体溶液‑80℃存放2周或4周，各处方检测数据汇总见表4。处方1、处方2和处方3比较，发现PBS缓冲液外泌体浓度收率高于生理盐水和Tris缓冲液组，粒径、Zeta电位无明显变化。处方4、处方5、处方6、处方7之间比较，发现浓度收率相近，各保护剂对外泌体的保护效果相近。处方3、处方10的浓度收率都很低，说明PH8.0的Tris缓冲液不适合外泌体‑80℃保存。对比例，处方11、处方12的浓度收率偏低，同时粒径明显增大，不适合外泌体‑80℃保存。

[0079] 表4外泌体液体‑80℃保存稳定性

[0080]

[0081]

[0082] 外泌体溶液2‑8℃存放2周，各处方检测数据汇总见表5。处方1、处方2和处方3比较，发现PBS组缓冲液外泌体浓度收率高于生理盐水和Tris缓冲液组，粒径、Zeta电位无明显变化。处方4、处方5、处方6、处方7之间比较，发现处方4、处方5、处方6浓度收率较高，说明F68、海藻糖、蔗糖对外泌体的保护效果更好。处方3、处方10的浓度收率都很低，说明PH8.0的Tris缓冲液不适合外泌体2‑8℃保存。处方12的浓度收率偏低，不适合外泌体2‑8℃保存。

[0083] 表5外泌体溶液2‑8℃保存稳定性

[0084]

[0085]

[0086] 外泌体溶液冻融稳定性检测数据汇总见表6，结果显示PBS组冻融3次、冻融5次的浓度收率高于生理盐水组；另外，处方4和8冻融3次和5次收率均>80％，说明PBS中添加了F68、蔗糖在冻融过程中对外泌体起到了很好的保护作用；最后，处方11、处方12冻融5次收率>80％，说明海藻糖在冻融过程中对外泌体起到了很好的保护作用。

[0087] 表6外泌体溶液冻融稳定性检测数据汇总

[0088]

[0089] 4、结论

[0090] 综合考虑外泌体溶液‑80℃保存、2‑8℃保存、冻融稳定性结果，PBS缓冲液优于生理盐水和Tris缓冲液；4号、8号处方略优于其他处方，适合在‑80℃、2‑8℃稳定保存，并且可以耐5次冻融。

[0091] 实施例3外泌体冻干保存稳定性

[0092] 1、实验材料

[0093] (1)MSCs(间充质干细胞)外泌体产生方式：外泌体细胞培养上清液是通过从干细胞培养液中去除干细胞以及其他所有细胞成分后得到的余留液体，包括培养基、细胞因子和外泌体。

[0094] (2)MSCs(间充质干细胞)外泌体培养方式：固定床预培养过夜，检测预培养基生物安全性，复苏固定床所需细胞3‑5亿，将所需要量的种子细胞复苏后制成50‑100ml细胞悬液，打开取样孔盖子，将细胞悬液加入罐体内部，开启批次培养模式，参数设置：温度：37℃，pH：7.2，DO：50％，通气量：100ml/min，转速：550rpm，待24h‑72h取样检测GLU、LAC、AMM、LDH取样观察游离并计游离细胞数，取取样条结晶紫染色，观察细胞贴壁状态，DO曲线，待观察细胞贴壁状态良好，打开固定床循环模式参数设置：温度：37℃，pH：7.2，DO：50％，通气量：50ml/min，转速：550rpm，循环流速：10ml/min，取样循环流速：10ml/min。

[0095] (3)上清收集：开启循环模式后收集上清。通过检测NTA来判断固定床外泌体产量和换液数量，关停循环模式，使用清空模式将罐体内部上清排出，上清收集完毕，根据收集量打开填充模式补加完全培养基至达到固定床循环液面开启循环模式继续培养，根据NTA检测数据判断培养周期。

[0096] 2、实验方法

[0097] (1)外泌体制备：与实施例2同一批MSC细胞培养液上清，经过多级澄清过滤，然后通过300KD中空纤维浓缩，将缓冲液分别置换成生理盐水、PBS、20mM Trs+137mMNaCl三种原10
液，原液外泌体浓度>5×10 颗粒/ml。

[0098] (2)根据表1中筛选方案的设计，用对应的缓冲液稀释对应的外泌体原液至理论浓10
度为5×10 颗粒/ml；并添加相应的保护剂成分，通过分别添加F68母液(1000×)、蔗糖母液(30×)、海藻糖母液(50×)、白蛋白母液(100×)使F68、蔗糖、海藻糖、白蛋白的终浓度分别为0.005％、1.5％、25mM、0.2％。组1、组2、组3不添加保护剂直接分装到5ml西林瓶中，分装规格1ml/瓶，每组8瓶。组4按1:1000添加F68母液(1000×)后分装到到5ml西林瓶中，分装规格1ml/瓶，共10瓶。其他组和组4类似，添加相应的保护剂成分后，分装到5ml西林瓶中，分装规格1ml/瓶，每组10瓶。西林瓶进行加塞、冻干，冻干结束后进行压盖。

[0099] (3)外泌体冻干粉2‑8℃保存稳定性研究方案

[0100] 将准备好的样品分别放进2‑8℃冷藏箱进行相关稳定性实验，方案见表7。10组不同处方的样品各1瓶组成1套样品，2‑8℃温度放3套样品，每个时间点取出1套样品，通过NTA检测外泌体的浓度、粒径、电位。

[0101] 表7外泌体冻干粉2‑8℃保存稳定性研究方案

[0102]

[0103] 3、实验结果

[0104] (1)外泌体冻干效果评估

[0105] 外泌体共进行2次冻干，一次1ml/支，冻干后外观形态见图1；另外1次2ml/支，冻干形态见图2，外观形态看1ml规格总体要好于2ml规格。另外，发现添加了蔗糖、海藻糖组，在2ml/瓶时冻干形态失败，在1ml/瓶时冻干呈压实的块状。无论1ml/瓶还是2ml/瓶，处方2、3、
4、7总体形态较好。

[0106] (2)1ml/瓶外泌体冻干后复溶效果、2‑8℃、25℃保存稳定性

[0107] 1ml/瓶外泌体冻干后复溶后、及冻干粉2‑8℃放置2周检测数据见表8，结果显示4号、8号、11号、12号处方浓度收率明显优于其他组。

[0108] 表81ml/瓶外泌体冻干后复溶效果、及冻干粉2‑8℃保存稳定性检测数据

[0109]

[0110] 1ml/瓶外泌体冻干前、冻干粉25℃放置4周检测数据见表9，结果显示4号处方的浓度收率优于11号、12号处方。

[0111] 表91ml/瓶外泌体冻干后复溶效果、及冻干粉25℃保存稳定性检测数据

[0112]

[0113] (3)2ml/瓶外泌体冻干后复溶效果

[0114] 2ml/瓶外泌体冻干后复溶后检测数据见表10。结果显示2、4、5、7、8号处方复溶后浓度收率明显优于其他组；粒径、zeta电位无明显差异。

[0115] 表10 2ml/瓶外泌体冻干后复溶效果检测数据

[0116]

[0117]

[0118] 4、实验结论

[0119] 综合外泌体冻干后的形态、冻干工艺的兼容性、复溶后浓度收率、冻干粉2‑8℃保存稳定性、冻干粉25℃保存稳定性，4号处方为最优的外泌体冻干制剂处方。

[0120] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。