[0001] 本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种人源神经干细胞保存液及其制备方法。

[0002] 神经干细胞(Neural stem cells，NSC)是干细胞家族中的重要成员，来源于发育早期的外胚层，具有自我更新和分化潜能，可以部分替代丢失和受损的神经细胞，用于修复受损的神经系统。尽管神经干细胞在治疗阿尔茨海默症等神经退行性疾病的详细机理尚不清楚，但其临床应用越来越受到关注，并且取得一定的成果，目前已成为未来生命科学和医学研究领域广泛关注的焦点。

[0003] 目前，有资质实现高通量分离、培养、扩增人源神经干细胞的国内机构很少，但是人源神经干细胞的临床应用范围十分广泛。神经干细胞的培养已趋向成熟，神经干细胞治疗应用也很深入，然而神经干细胞临床项目和受众面广泛的神经干细胞治疗往往涉及细胞制备单位和细胞移植单位之间的长途运输。活细胞是细胞制品的关键有效成分，长时间的运输对细胞活力的维持提出高质量的要求。因此，迫切需要开发一种神经干细胞保存液，使神经干细胞在此保护液中活性持久维持，满足运输到国内大多数地区及周边国家的需求，同时能够直接用于人体，安全无毒。

[0004] 目前，国内干细胞机构通常采用生理盐水、细胞培养基作为临床干细胞应用的溶液介质。生理盐水安全便利，常作为输注介质，然而在生理盐水中的干细胞活力下降速度快，仅用生理盐水作细胞保存液的方法只适合短暂保存或即时使用的干细胞制品。细胞培养基也常作为细胞保护液的主要成分，其提供细胞生长代谢所需的营养物质，包括氨基酸、糖类、无机盐、维生素等，对于维持细胞渗透压及活力有较好的作用。然而，目前国内大部分细胞培养基是科研级应用，不能应用于临床研究。同时由于生产厂家、生产方法的不同，细胞培养基的成本、质量也不等，较好质量的细胞培养基价格更贵。

[0023] 为了更加充分地理解展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例对本发明所产生的技术效果做进一步的详细、完整地描述。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下所获得其他实施例，均属于本发明的保护范围，下面结合实施例对本发明进行具体描述。

[0024] 以下实施例中除非特别说明，所用试剂和材料均为市购。

[0025] 实施例1

[0026] 2×10^6/mL人源神经干细胞的保存，步骤如下：

[0027] 1、人源神经干细胞保存液的配制：将氯化钾、氢氧化钠、二水合磷酸二氢钠、六水合氯化镁、丙酮酸钠、葡萄糖和山梨醇混合，边加纯水边搅拌均匀，定容至100mL后，用250mL的0.22μm滤器过滤。

[0028] 2、制备人源神经干细胞悬液：(500g,3min)离心后，弃去上清，保存液重悬细胞，调整浓度为2×10^6/mL，该浓度细胞悬液分装5管，0.2mL/管，将5管保存液重悬的细胞转移至2‑8℃，分别在0h，24h，48h，72h，168h时间点取样，AO/PI染液染色，在细胞计数仪计数细胞存活率，如表1所示。

[0029] 表1

[0030] 保存时间(h) 细胞存活率0 92.53±0.13％
24 91.01±0.38％
48 90.79±1.07％
72 85.03±0.61％
168 79.32±1.41％

[0031] 表1结果表明，在2‑8℃条件下，48h内用保存液保存总细胞浓度为2×10^6/mL的细胞活率高于90％；保存液保存72h，总细胞浓度为2×10^6/mL的细胞活率低于90％；超出72h，细胞活率显著低于90％。采用细胞保存液可至少48h维持低浓度细胞活率在90％以上，用于回输细胞的长时间运输保存，符合临床回输要求。

[0032] 实施例2

[0033] 5×10^6/mL人源神经干细胞的保存，步骤如下：

[0034] 1、人源神经干细胞保存液的配制：将氯化钾、氢氧化钠、二水合磷酸二氢钠、六水合氯化镁、丙酮酸钠、葡萄糖和山梨醇混合，边加纯水边搅拌均匀，定容至100mL后，用250mL的0.22μm滤器过滤。

[0035] 2、制备人源神经干细胞悬液：(500g,3min)离心后，弃去上清，保存液重悬细胞，调整浓度为5×10^6/mL，该浓度细胞悬液分装5管，0.2mL/管，将5管保存液重悬的细胞转移至2‑8℃，分别在0h，24h，48h，72h，168h时间点取样，AO/PI染液染色，在细胞计数仪计数细胞存活率，如表2所示。

[0036] 表2

[0037]保存时间(h) 细胞存活率
0 94.43±0.12％
24 92.32±0.09％
48 92.37±0.29％
72 93.34±0.56％
168 87.24±2.26％

[0038] 表2结果表明，在2‑8℃条件下，72h内用保存液保存总细胞浓度为5×10^6/mL的细胞活率高于90％，甚至可达93％；保存液保存168h，总细胞浓度为5×10^6/mL的细胞活率仍可维持80％以上。采用细胞保存液可至少72h维持高浓度为5×10^6/mL细胞活率在90％以上，用于回输细胞的长时间运输保存，符合临床回输要求。

[0039] 以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等均应包含在本发明的保护范围之内。