[0001] 本发明属于器官移植技术领域，具体涉及白果内酯在制备器官保护液中的应用。

[0002] 肝脏缺血再灌注损伤(hepatic ischemia‑reperfusion injury，HIRI)是肝移植过程中一个关键且复杂的挑战，对肝移植患者的术后恢复和长期预后有重要影响。HIRI可导致严重的肝组织损伤和功能障碍，甚至威胁患者的生命。HIRI的发生机制涉及复杂的病理生理过程，包括细胞氧化应激、炎症反应、细胞凋亡等。

[0003] 已有大量研究表明利用低温机械灌注可以减少肝脏缺血再灌注损伤的严重程度，显著延长供肝的保存时间，提高移植成功率。此外，低温机械灌注不仅可以是一种供肝的保存手段，还可以作为一种治疗手段，通过加入特定药物到供肝灌注保存液中，进一步修复和改善供肝质量。目前临床上常用的供肝灌注保存液主要包括HTK液和UW液，对延长供肝保存起到了一定的效果。

[0004] 公开号为CN116789888A的发明申请公开了一种能够减轻器官缺血再灌注损伤的抗自由基聚合物及其制备方法和用途。该发明可以靶向线粒体，具有结合自由基的功能，有明显减轻肝脏缺血再灌注损伤作用，添加于器官保存液中有减轻肝脏冷缺血损伤的作用。

[0005] 公开号为CN117581858A的发明申请公开了一种冷保存液及其在减少细胞、组织或器官缺血再灌注损伤中的应用，通过在保存液中添加磷酸胆碱、喹啉‑4‑羧酸、牛磺熊脱氧胆酸钠，发现使用添加了这些物质的保存液对细胞、组织和/或器官进行冷保存，细胞存活率高，能够有效减少冷保存‑复温引起的细胞凋亡，降低线粒体ROS，维持细胞膜完整性，有效减少冷保存‑复温引起的线粒体损伤，减少缺血再灌注损伤并促进肝脏再生，这对于器官移植保存技术的进步有十分积大的意义。

[0006] 为进一步对提高肝移植的成功率和效果，减少术后并发症，扩大供肝的使用范围，对供肝灌注保存液进行改良成为了当前肝脏疾病研究领域的热点和难点。

[0007] 白果内酯(bilobalide，BB)是银杏叶提取物的主要成分之一，是一种倍半萜类化合物，CAS：33570‑04‑6，分子式：C15H18O8，结构式如式Ⅰ所示。

[0008]

[0025] 为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对发明的可实施范围的限定。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

[0026] 白果内酯BB购自MedChemExpress有限公司，CAS号：33570‑04‑6，货号：HY‑N0076。N‑乙酰半胱氨酸(NAC)购自MedChemExpress有限公司，CAS号：616‑91‑1，货号：HY‑B0215。
HTK液购自璞川医疗科技(上海)有限公司。

[0027] 实施例1：白果内酯减轻肝热缺血再灌注损伤效果测试

[0028] 1.动物

[0029] 实验动物为40只健康雄性C57BL/6小鼠(7～8周龄)，体重为20±2g，购自浙江省医学科学院动物实验中心(杭州，中国)。所有动物都被饲养在一个标准环境中，自由获取食物和水，并有12小时/12小时的光暗循环。

[0030] 2.实验分组与模型建立

[0031] 2.1实验分组

[0032] 按随机数字表法将40只C57BL/6小鼠(20±2g)平均分为以下4组：

[0033] (1)假手术组(Sham组)：小鼠开腹前6小时及1小时腹腔注射300μl生理盐水，只行开腹关腹操作，但不进行HIRI；

[0034] (2)肝脏缺血再灌注损伤组(HIRI组)：将小鼠缺血前6小时及1小时腹腔注射300μl生理盐水；

[0035] (3)肝脏缺血再灌注损伤+白果内酯组(HIRI+BB组)：将小鼠缺血前6小时及1小时腹腔注射30mg/kg的BB；

[0036] (4)肝脏缺血再灌注损伤+N‑乙酰半胱氨酸(NAC)组(HIRI+NAC组)：将小鼠缺血前6小时及1小时腹腔注射200mg/kg的NAC。

[0037] 2.2小鼠70％肝脏热缺血再灌注损伤模型建立

[0038] 将小鼠术前禁食12h，自由饮水。使用1％戊巴比妥钠腹腔注射的方式对小鼠进行麻醉，麻醉满意后，用胶布使小鼠固定于手术台上，小鼠取仰卧位，腹部备皮，沿着腹白线逐层剪开皮肤、肌肉层以暴露肝门部，找到肝左、中叶的肝动脉和门静脉。用无损伤血管钳夹闭肝左、中叶的肝蒂，使肝脏发生约70％的缺血。肉眼观察到，与未阻断血流的肝右叶相比，阻断的肝叶变为灰白色，则表示血流阻断成功。将小鼠放在37℃保温毯上维持体温，缺血90min后取出血管夹并关腹，再灌注时间为6h。

[0039] 3.样本采集和检测项目

[0040] 3.1肝功能检测

[0041] 再灌注6h后摘除小鼠眼球，采集各组小鼠的血样。在室温下放置30分钟后，所有血样以3000转/分的速度离心15分钟，取血清。采用全自动血生化仪(深圳雷杜生命科技)测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)浓度。

[0042] 3.2肝组织苏木精‑伊红(Hematoxylin and eosin，HE)染色取肝脏标本，用4％多聚甲醛固定24小时，石蜡包埋，切片。然后对切片进行脱蜡、苏木精染色、伊红染色、脱水封口。使用数字切片扫描仪(奥林巴斯，日本东京)对切片进行扫描成像。病理学家分析了组织学样本，并使用铃木评分来评估肝坏死的程度，所述铃木评分标准如表1所示。

[0043] 表1

[0044]数值评估 肝窦淤血 细胞空泡化 细胞坏死
0 无 无 无
1 极少 极少 单个细胞坏死
2 轻度 轻度 ‑30％细胞坏死
3 中度 中度 ‑60％细胞坏死
4 重度 重度 ＞60％细胞坏死

[0045] 3.3Tunel法

[0046] 根据生产厂家(ServiceBio，中国)的说明书，对肝组织石蜡切片进行TUNEL染色以检测肝细胞凋亡。使用数字切片扫描仪(奥林巴斯，日本东京)对切片进行扫描成像。使用ImageJ软件对图像进行分析。细胞核呈明显的黄色染色，提示TUNEL阳性的细胞正在发生凋亡。测定TUNEL阳性的肝细胞占肝细胞总数的百分比。

[0047] 3.4免疫荧光染色

[0048] 肝脏样本用4％多聚甲醛固定，脱水，石蜡包埋，切片。免疫荧光染色检测抗体：抗Ly6g，抗F4/80，4℃过夜。与荧光团结合的二抗孵育后，用DAPI进行细胞核染色。最后用数字切片扫描仪(奥林巴斯，日本东京)对切片进行扫描成像并观察荧光染色结果。

[0049] 3.5肝组织炎性因子检测

[0050] 将肝组织加入10倍组织重量的PBS后机械匀浆，离心后取上清，用ELISA试剂盒检测Tnf‑α、IL‑1β以评估肝组织中炎症因子表达水平。

[0051] 4.实验结果

[0052] 4.1白果内酯可以减轻肝脏缺血再灌注损伤

[0053] 再灌注6小时后，我们检测了各组小鼠血清肝功能生化指标(ALT、AST)。为了确定小鼠最佳给药浓度，我们进行了梯度给药实验，对BB给药浓度梯度(10、20和30mg/kg)的评估表明，30mg/kg的保护效果最好(图1)。因此，随后的所有实验都使用了30mg/kg的浓度。与假手术组相比，HIRI组、HIRI+BB组和HIRI+NAC组小鼠血清ALT、AST水平显著升高，HIRI+BB组与HIRI+NAC组血清ALT、AST水平均比HIRI组显著降低，且HIRI+BB组较HIRI+NAC组降低ALT、AST更为显著。

[0054] HE病理结果显示，HIRI组小鼠的肝损伤较HIRI+BB组严重，坏死面积更大。Suzuki评分进一步证实了这一观察结果(图2)。这些结果均证实了BB对HIRI的肝脏保护作用。

[0055] 4.2白果内酯可以减轻肝脏缺血再灌注损伤诱导的细胞凋亡

[0056] 细胞凋亡是HIRI中的一种基本现象。采用原位末端转移酶标记法(TUNEL法)检测BB对HIRI诱导的肝组织切片中细胞凋亡的影响。与假手术组相比，HIRI组的TUNEL阳性细胞数显著增加(图3)。BB治疗后TUNEL阳性细胞数减少(p<0.05)。此外，HIRI组大鼠肝组织中凋亡蛋白cleaved‑caspase 3表达增加，经BB处理后表达明显减少(图4)。综上所述，这些结果表明BB减少了HIRI诱导的细胞凋亡。

[0057] 4.3白果内酯可以减轻工作缺血再灌注损伤期间的炎症

[0058] 在再灌注过程中，一系列炎症综合征反应被激活，产生许多炎性细胞因子，进一步加重对肝组织的损伤，阻碍其功能。与假手术组比较，HIRI组肝组织Tnf‑α、IL‑1β表达水平显著升高(图5)。而HIRI+BB组Tnf‑α、IL‑1β表达水平较HIRI组明显降低。此外，Ly‑6g染色显示HIRI+BB组与HIRI组相比，中性粒细胞浸润明显受到抑制(图6)。F4/80染色显示HIRI+BB组与HIRI组相比，巨噬细胞浸润明显减少(图7)。因此，根据我们的数据，我们得出结论，在HIRI期间BB减轻了炎症反应。

[0059] 综上所述，本发明的白果内酯在部分肝缺血再灌注损伤模型中，白果内酯能保护肝脏减轻缺血再灌注损伤，缓解了HIRI引起的细胞凋亡，减轻HIRI期间肝脏的炎症反应，因此白果内酯可以用于缓解肝脏缺血再灌注损伤。

[0060] 实施例2：新型离体肝脏灌注保存液减轻移植供肝冷缺血再灌注损伤效果测试[0061] 1.动物

[0062] 实验动物为40只健康雄性SD大鼠，体重为250g～300g，购自浙江省医学科学院动物实验中心(杭州，中国)。所有动物都被饲养在一个标准环境中，自由获取食物和水，并有12小时/12小时的光暗循环。

[0063] 2.实验分组与模型建立

[0064] 2.1实验分组

[0065] 按随机数字表法将20只SD大鼠(250g～300g)平均分为以下2组：

[0066] (1)对照组(HTK组)：将供肝在HTK液中进行1小时低温机械灌注后移植；

[0067] (2)实验组(灌注液组)：将供肝在新型灌注保存液中进行1小时低温机械灌注后移植。

[0068] 灌注保存液成分构成如表2所示。

[0069] 表2

[0070] 成分 浓度白果内酯 500mg
青霉素钠 1g
肝素 20000U
N‑乙酰半胱氨酸 10mg
二甲基亚砜(DMSO) 5ml
HTK液 补齐至1000ml

[0071] 2.2大鼠肝移植联合低温机械灌注损伤模型建立

[0072] 2.2.1供肝的获取：以0.8ml/100g体重剂量的麻药注入大鼠腹腔，麻醉大鼠。

[0073] 固定供体大鼠，消毒，开腹，游离肝脏。分离好的胆总管，用显微剪剪开一V字切口，插入胆管支架。将胆管支架用针线固定，离断胆总管。结扎右肾静脉，结扎右肾上静脉(两处结扎尽量靠近下腔静脉)。供体全身肝素化。穿刺主动脉，用HTK液10ml缓慢灌洗肝脏，正确灌洗后可见全肝颜色变白)。之后继续剪断肝后部结缔组织，充分分离出供肝，取出供肝后置于装有0‑4℃的器官保存液的低温机械灌注仪中保存。

[0074] 2.2.2供肝准备及低温灌注：将静脉留置针插入门静脉内，并用5‑0丝线活结固定。将静脉留置针与灌注仪连接开始灌注1小时，参数设定：恒流：1ml/min；器官池温度：4℃，灌注时间：1h。灌注结束后在门静脉与肝下下腔静脉套管。于肝上下腔静脉开口两侧安置牵引线备用。

[0075] 2.2.3受体去肝

[0076] 受体大鼠麻醉、开腹、游离肝脏，结扎胆总管上端。用显微钳钳夹针线缝扎肝固有动脉。结扎右肾上腺静脉。于肝上下腔静脉后安置牵拉皮条。用弯头显微镊挑起肝下下腔静脉，将右肾静脉与右肾上腺静脉间的下腔静脉段用血管夹夹闭，阻断肝下下腔静脉。之后阻断门静脉，无肝期开始。经门静脉将肝内血冲入体循环。(注入2ml生理盐水)。分离好肝脏后将其移除。检查受体大鼠腹腔内有无出血点，妥善止血。

[0077] 2.2.4供肝植入

[0078] 将纱布覆盖于移除肝脏的大鼠腹腔上，将供肝停止灌注取出留置针后置于纱布上。之后用供肝上的牵引线将供肝与受体大鼠的肝上上腔静脉缝合固定。

[0079] 将肝上下腔静脉两侧缝合固定后行肝上下腔静脉连续缝合。先以一侧结扎线向对侧连续缝合静脉后端断口后打结固定，再连续缝合前侧断口，至将缝合完毕时留一小口，用注射器经小口向肝上下腔静脉中注入适量生理盐水排除静脉内气泡，之后继续缝合，完成前端断口缝合，打结固定后剪断两侧多余缝线，完成肝上下腔静脉闭合。门静脉、肝下下腔静均采用套管后用5‑0丝线固定。受体胆管用显微剪剪开V字型开口后将供体胆管支架插入并用5‑0丝线固定。关闭腹腔，完成手术。

[0080] 3.样本采集和检测项目

[0081] 3.1肝功能检测

[0082] 再灌注6h后摘除小鼠眼球，采集各组大鼠的血样。在室温下放置30分钟后，所有血样以3000转/分的速度离心15分钟，取血清。采用全自动血生化仪(深圳雷杜生命科技)测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)浓度。

[0083] 3.2器官保存效果

[0084] 如图8制备的器官保存灌注液作为实验组(新灌注液组)，其血清ALT、AST水平明显著低于单纯HTK液作为对照组(HTK组)。上述结果说明：移植供肝在加入新型器官保存灌注液中4℃灌注1小时后保护肝脏冷缺血再灌注损伤的效果显著优于HTK液。