[0001] 本发明涉及从豆科(Leguminosae)中植物分离的基因的新用途，尤其涉及从蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)中分离的RH1基因或其编码蛋白在调控植物物理休眠中的用途，属于RH1基因或其编码蛋白的新用途领域。

[0002] 豆科(Leguminosae)植物约有700属18000种，是仅次于菊科和兰科的第三大科，广泛分布于全世界，是人类食物和油料以及牧草、绿肥、药材和木材等的重要来源，具有重要的经济、生态学和生物学价值。但由于大部分豆科作物基因组较大，遗传转化体系尚不成熟等因素，限制了豆科植物功能基因组学的研究。

[0003] 蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)是一年生草本植物，放牧型牧草，因其生长周期短、倍性小、基因组小、自花受粉及固氮等特点，是豆科植物遗传学和基因组学研究的理想模式植物。

[0004] 种子的物理休眠是高等植物中广泛存在的一种适应性特征，是由种子或果实的被覆层中一层或多层不透水的栅栏组织所引起的一种现象。种子的这种不透水性又被称为种子的“硬实性”，具有这种特性的种子需要通过打破物理休眠才能萌发。

[0005] 蒺藜苜蓿种子在实验室需要磨破种皮才能吸水萌发，处理过程费时费力。田间出苗需则通过化学与物理方法打破植物种子的物理休眠。物理方法包括：阳光暴晒、热水浸泡、机械磨皮、物理碾磨等方法加速吸水，其中机械磨皮是指将苜蓿种子掺入一定砂石在砖地上轻轻摩擦，以达到种皮粗糙而不碎，但实际操作过程中往往会损失一部分种子。化学方法包括：用浓硫酸、或钼酸铵及硼酸溶液浸种，浸种后立即用清水洗净。处理过程中不仅会对人体产生危害，残留的化学试剂也会对环境造成污染。

[0006] 调控种子的物理休眠不仅能够及时打破植物种子的物理休眠，还能促进植物种子的萌发率；因此，获得能够有效调控植物种子的物理休眠的基因或蛋白对于促进植物种子萌发、降低生产成本等均具有重要的应用价值。

[0041] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

[0042] 试验例1 蒺藜苜蓿RH1转基因植株的获得及表型分析1表达载体pEarlyGate203‑RH1的构建
利用引物cacc‑RH1‑CDS‑F和RH1‑CDS‑R从蒺藜苜蓿幼嫩叶片CDS上扩增出含有cacc位点的完整开放阅读框，产生钝端（blunt‑end）的PCR产物。将PCR产物通过TOPO克隆反应定向克隆到pENTR载体，构建含有目的基因RH1的入门载体，转化大肠杆菌DH5α，PCR扩增筛选重组质粒，并测序鉴定。将经测序正确的入门载体pENTR‑RH1与植物过表达载体pEarlyGate203进行LR反应，将表达载体上的CCDB基因替换为目的基因RH1，构建植物表达载体pEarlyGate203‑RH1，转化大肠杆菌DH5α，PCR扩增鉴定重组质粒。

[0043] RH1蛋白的氨基酸序列如下：MANTSGVRKGAWTYEEDNCLKAYILKHGVGKWHLIPERTGLNRCRKSCRLRWVNYLNPYINRENFSKDEVDLILRLHNLLGNRWSLIAGRLPGRTANDVKNYWNTYLRKKVESEAKEKEKSNETMKAHEVIKPRPITLSSRSHFVHDSNKDRYVPIYQDDSSETMVPSQIGGDYASAVQPSLGNNVQTPCAMWSDSLWDMGSSEKIGSCSSLQEVNNFNMDFPDDSFWDFNFSDFEFLRDL （SEQ ID NO.1）。

[0044] RH1基因的核苷酸序列如下：ATGGCGAATACAAGCGGCGTTAGAAAAGGTGCATGGACATATGAAGAAGACAACTGTCTCAAGGCTTACATTCTCAAGCATGGTGTAGGAAAATGGCATTTAATTCCTGAAAGAACAGGATTGAATAGATGTCGTAAAAGTTGTAGATTGAGGTGGGTAAATTATTTAAATCCCTACATCAACCGGGAGAATTTTTCTAAGGATGAAGTTGATTTGATTCTAAGGTTACACAACCTCCTAGGCAATAGATGGTCATTGATTGCTGGAAGGCTTCCAGGTAGAACAGCTAATGATGTGAAAAACTATTGGAATACATATTTACGCAAGAAGGTTGAATCAGAAGCAAAAGAAAAAGAGAAATCTAATGAAACAATGAAAGCTCATGAGGTTATTAAACCTCGGCCTATAACTTTATCATCTCGTTCACATTTTGTTCATGATTCAAATAAAGATCGTTATGTTCCCATATATCAAGATGATTCATCAGAGACTATGGTTCCAAGTCAAATTGGTGGAGATTATGCCTCTGCTGTACAACCAAGTCTTGGTAATAATGTCCAAACACCGTGTGCAATGTGGTCAGACAGTTTATGGGACATGGGGAGCAGTGAGAAAATTGGCTCATGCTCTTCATTACAAGAGGTGAACAACTTCAACATGGATTTTCCTGATGACTCCTTTTGGGATTTCAACTTTTCTGATTTTGAATTTCTTCGAGATCTTTAA （SEQ ID NO.2）。

[0045] 2蒺藜苜蓿的遗传转化将含有植物表达载体pEarlyGate203‑RH1的农杆菌培养至OD600为0.8‑2.0，3800 rpm离心15 min，弃上清，菌体沉淀用CO渗透液重悬，侵染蒺藜苜蓿幼嫩叶片用。

[0046] 取生长5周左右的蒺藜苜蓿无菌苗的幼嫩叶片后，用刀划破叶片，使叶片有伤口，将重悬农杆菌菌液加入叶片，超声1 2 min后静置30 min，最后将叶片平铺暗培养2天后，转~移至有植物抗性的诱导培养基上，挑选愈伤组织继续进行培养，转移至光照培养基上进行分化直至长出绿芽，转移至生根培养基上直至长出新的幼苗，在植株生长过程中对其表型进行统计。

[0047] 植株生长过程中的表型情况如图1‑A、图1‑B所示，与野生型蒺藜苜蓿R108相比，过表达RH1蒺藜苜蓿植株通体呈现紫色，在植株的叶片、茎秆、花瓣、果荚、种子中均有花青素的积累。

[0048] 3 RNA水平的PCR检测随机选取DNA水平鉴定的两株阳性蒺藜苜蓿植株叶片、花为材料，提取总RNA，以反转录获得的cDNA为模板，以RH1基因特异定量引物RH1‑qF/RH1‑qR组成的引物对扩增RH1基因，并以引物MtActin‑qF/MtActin‑qR组成的引物对扩增蒺藜苜蓿内参基因MtActin，进行Quantitative Real‑time PCR (qRT‑ PCR)。

[0049] qRT‑ PCR的结果如图1‑C所示，两个转基因植株叶片和花中RH1基因的表达水平均明显高于野生型，进一步验证了RH1基因的过表达导致蒺藜苜蓿物理休眠被解除，说明RH1基因在蒺藜苜蓿物理休眠调控中起到重要的作用。

[0050]  表2 本试验中所用到的引物序列

[0051] 试验例2 蒺藜苜蓿RH1转基因植株种子的物理休眠被解除的验证试验将野生型和转基因RH1蒺藜苜蓿种子分别置于无菌水中，分别观察野生型和转基因RH1蒺藜苜蓿种子情况。试验结果如图2所示，与野生型种子相比，转基因RH1蒺藜苜蓿种子开始吸水，种皮膨胀破裂，说明转基因蒺藜苜蓿种子的物理休眠被打破，而野生型种子仍保持原状，最终转基因蒺藜苜蓿种子能够达到发芽的状态，而野生型仍然保持原状没有变化。

[0052] 将约100 mg的野生型和转基因RH1成熟种子浸泡在室温无菌水中，在3次独立实验中，每30 min测量一次重量。被吸收的水等于吸胀种子的全部重量减去干种子的原始重量，以此评价种子的吸水性。

[0053] 野生型和转基因RH1成熟种子吸水速率的变化如图3‑A所示，转基因RH1种子随着时间推移吸水性逐渐升高，野生型没有明显变化，说明RH1基因可以通过打破种子的物理休眠从而提高种子萌发率。

[0054] 统计约100 mg的野生型和转基因RH1成熟种子的吸胀率和萌发率，吸胀率和萌发率的结果如图3‑B所示，转基因RH1成熟种子的吸胀率达到0.44，萌发率达到0.43。进一步证明了RH1基因能够打破蒺藜苜蓿种子的物理休眠，提高种子萌发率。