[0001] 本发明属于分子生物技术领域，具体涉及RhALEU蛋白及其编码基因在月季花瓣衰老调控中的应用。

[0002] 花卉产业是大农业的重要组成部分，集经济、社会、生态效益于一体的绿色产业。鲜切花是花卉产业中最重要的产品，月季在全球四大切花中居于首位。月季切花极不耐长距离运输，采后流通中的损耗通常超过30％，有时甚至高达50％，采后贮运损耗大已经成为制约月季切花产业提质增效的瓶颈问题。因此，培育耐贮运新品种和研发高效采后保鲜技术是突破“月季切花采后损耗高”这一产业瓶颈的有效途径，而花瓣衰老关键基因的挖掘及其生物学机制的解析是品种改良和技术创新的理论基础。

[0003] 花瓣衰老从外部形态上看，主要表现为萎蔫、脱落和花色改变等；生理本质是细胞膨压下降、水解活动增强等一系列过程。其中蛋白质含量变化最能体现衰老进程，随着衰老进程推进，催化代谢水解酶增加，花瓣中可溶性蛋白不断减少，游离氨基酸含量增加，导致花瓣PH值上升，花瓣褐变、蓝变。尽管衰老这一过程十分重要，但花瓣衰老过程中发挥作用的蛋白酶还没有全部被识别和定性。

[0004] 半胱氨酸蛋白酶(Cysteine Proteases)是蛋白水解酶中的一大类，对不同植物物种天然或诱导衰老期间基因表达的分析表明，CPs是植物衰老过程中表达最丰富的蛋白酶之一。在所有的植物半胱氨酸蛋白酶中，木瓜类半胱氨酸蛋白酶(papain‑like cysteine protease,PLCPs)研究得最详尽。PLCPs是衰老过程中与大量蛋白质降解有关的主要酶，拟南芥的SAG2编码PLCPs，并且被用作衡量叶片衰老的标准，其中ALEU编码与衰老相关的蛋白酶，但研究机制尚未清楚，并且是否发挥作用参与衰老过程尚不清楚。

[0025] 病毒诱导的基因沉默(Virus‑induced gene silencing,VIGS)是一种转录后基因沉默技术，作为一种有效的反向遗传学技术已经广泛应用于植物基因工程的研究中，其中较为常用的病毒载体为烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus，TRV)。TRV由两个载体pTRV1和pTRV2共同行使功能。本发明的载体pTRV‑1和pTRV‑2由清华大学刘玉乐教授赠与。在本发明中将对照pTRV‑1和pTRV‑2的组合命名为pTRV，将pTRV‑1和pTRV‑2‑RhALEU的组合命名为pTRV‑RhALEU。

[0026] 实施例1基因RhALEU的获得和RhALEU基因在月季花瓣不同开放阶段的表达模式[0027] 1、基因克隆和序列分析

[0028] 本发明利用拟南芥中ALEU基因，在月季(Rosa hybrida‘Samantha’)基因组数据(https://lipmbrowsers.toulouse.inra.fr/pub/RchiOBHm‑V2/)使用Blast进行比对，并结合NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库中的注释，最后筛选得到13个ALEU基因(图1)。选取与拟南芥ALEU基因亲缘关系最近的基因RchiOBHm_Chr2g0095151作为候选基因，命名为RhALEU(全长参见SEQ ID NO.1)。RchiOBHm_Chr2g0095151的ORF长度为1074bp(参见SEQ ID NO.2)，可编码一个含357个氨基酸的蛋白(参见SEQ ID NO.3)。

[0029] 2、月季幼苗的培养

[0030] 月季‘萨曼莎’组培苗培养在含1.0mg/L 6‑苄基氨基嘌呤(6‑BA)、0.05mg/Lα‑萘乙酸(NAA)和3mg/L赤霉素(GA3)的MS培养基上，在22±1℃，长日照(光照16h/黑暗8h)。将四周龄的小苗移至含有0.1mg/L NAA的1/2MS培养基上生根。接下来，将生根幼苗移栽到蛭石与泥炭苔藓的1:1比例的培养土中，在22±1℃，相对湿度～60％，长日照(光照16h/黑暗8h的条件)下，通过组培获得的生根幼苗。

[0031] 3、RNA提取和荧光定量RT‑PCR分析

[0032] 通过实时荧光定量PCR(qRT‑PCR)检测RhALEU在不同级别的表达量变化。不同级别的具体评判标准参考本发明人之前的研究(Ma,N.,Cai,L.,Lu,W.et al.Exogenous ethylene influences flower opening of cut roses(Rosa hybrida)by regulating the genes encoding ethylene biosynthesis enzymes.Sci.China Ser.C.‑Life Sci.48,434–444(2005).https://doi.org/10.1360/062004‑37.)。具体方法如下：使用热硼酸盐法从月季花瓣中提取总RNA(Ma,N.,Tan,H.,Liu,X.,Xue,J.,Li,Y.,&Gao,J.(2006).Transcriptional regulation of ethylene receptor and CTR genes involved in ethylene‑induced flower opening in cut rose(Rosa hybrida)cv.Samantha.Journal of experimental botany,57(11),2763–2773)。用HiScript III逆转录酶(Vazyme)从1μg总RNA中得到cDNA。荧光定量RT‑PCR(qRT‑PCR)使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Low ROX Premixed)试剂(Vazyme)在Applied Biosystems StepOnePlusTM实时定量PCR系统中进行‑ΔΔCT反应。以RhUBI2基因作为内对照，至少3个生物学重复。用2 法计算相关基因表达。

[0033] qRT‑PCR反应体系

[0034]

[0035] qRT‑PCR反应程序

[0036]

[0037] 结果表明RhALEU基因的转录水平随花朵开放级数增加而升高(图2)，这表明RhALEU基因可能参与花瓣衰老过程，并且在花朵衰老阶段发挥主要作用。图2中S3是花朵外瓣松散状态，S4是花朵外瓣平展但未露花芯，S5是花朵完全开放，花芯露出。

[0038] 实施例2病毒诱导的基因沉默

[0039] 实验方法参考本发明人之前的研究(Tian,J.,Pei,H.,Zhang,S.,Chen,J.,Chen,W.,Yang,R.,Meng,Y.,You,J.,Gao,J.,&Ma,N.(2014).TRV‑GFP:a modified Tobacco rattle virus vector for efficient and visualizable analysis of gene function.Journal of experimental botany,65(1),311–322.)。具体地说，利用含有EcoR I和BamH I酶切位点的pTRV2的酶切载体插入300bp的RhALEU特异性片段(ORF区38bp和3’非翻译区262bp，参见SEQ ID NO.6)构建pTRV2‑RhALEU载体。具体步骤如下：

[0040] (1)ORF区38bp和3’非翻译区262bp的PCR扩增

[0041] 引物的设计：特异性片段引物RhALEU‑TRV‑F序列参见SEQ ID NO.4；特异性片段引物RhALEU‑TRV‑R序列参见SEQ ID NO.5；RhALEU定量引物RhALEU‑qRT‑F序列参见SEQ ID NO.7；RhALEU定量引物RhALEU‑qRT‑R序列参见SEQ ID NO.8；RhUBI2定量引物RhUBI2‑qRT‑F序列参见SEQ ID NO.9；RhUBI2定量引物RhUBI2‑qRT‑R序列参见SEQ ID NO.10。

[0042] PCR扩增：

[0043] PCR扩增体系

[0044]

[0045] 将PCR管置于PCR仪中，执行PCR扩增反应程序如下：

[0046]

[0047] 扩增结果经过琼脂糖凝胶电泳结果如图3。从图3可以看出，本发明扩增得到了特异性基因片段大小为300bp。采用 Gel DNA Extraction Mini Kit试剂盒进行目的片段回收。

[0048] (2)载体构建

[0049] 采用2×Seamless Cloning Mix试剂盒，于0.2mL PCR管中建立如下反应体系，温和混合后短暂离心，在PCR仪保温(50℃，15min)。反应结束后将离心管放冰上，得到连接产物pTRV2‑RhALEU，准备转化实验中使用。若暂不做转化实验，于‑20℃冻存连接产物。

[0050] 同源重组反应体系

[0051]

[0052] (3)pTRV2‑RhALEU载体的根癌农杆菌菌株GV3101的获得

[0053] (3.1)转化大肠杆菌感受态细胞

[0054] (3.1.1)取T1 Phage Resistant感受态细胞于冰浴解冻1‑2min，加入载体，温和混匀后在冰浴中静置5min。

[0055] (3.1.2)将离心管置于42℃水浴加热60sec，然后迅速转移离心管至冰浴，冷却细胞2‑3min，期间保持离心管静置。

[0056] (3.1.3)加无菌的500μL LB培养基(不含抗生素)于每个离心管，混合均匀，于180rpm摇床37℃振荡培养60min。

[0057] (3.1.4)吸取适量体积转化的感受态细胞加到含对应抗生素的LB固体琼脂培养基上，涂布器均匀涂开感受态细胞。

[0058] (3.1.5)液体吸收后倒置平板，37℃培养16h。

[0059] (3.2)质粒小提

[0060] 使用RapidLyse Plasmid Mini Kit试剂盒，操作步骤如下：

[0061] (3.2.1)实验操作前请将Buffer QLB(请先检查是否已加入RapidLyse Mix)置于冰上，预冷至0～4℃。

[0062] (3.2.2)取2mL离心管加入1mL过夜培养的菌液，12000rpm离心1min，尽可能吸弃上清(若菌液较多可几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管内)。

[0063] (3.2.3)取600μL已预冷的Buffer QLB，加入留有菌体沉淀的离心管中，Buffer QLB使用完毕请置于2～8℃进行保存。

[0064] (3.2.4)请使用涡旋仪立即涡旋振荡30sec，彻底重悬菌体沉淀，室温孵育3min。

[0065] (3.2.5)将(3.2.4)全部溶液转移至吸附柱RapidLyse DNA Mini Columns(确认吸附柱已放入收集管)中，12000rpm离心30sec，弃废液。

[0066] (3.2.6)将吸附柱置入收集管，沿吸附柱管壁加入600μL BufferQWB，12000rpm离心30sec，弃废液。

[0067] (3.2.7)将吸附柱置入收集管，12000rpm离心1min，直至将吸附柱中的残留液体彻底去除。

[0068] (3.2.8)去新的洁净1.5mL离心管，放置吸附柱于离心管，取50μL Buffer QEB加入到吸附柱膜的中央部分，12000rpm离心30～60sec，离心后收集质粒DNA溶液于‑20℃保存或直接用于后续实验。

[0069] 3.3农杆菌转化：

[0070] (3.3.1)取‑70℃保存的GV3101(pSoup‑p19)农杆菌感受态于室温，等待细胞稍稍化冻处于冰水混合状态，然后插入冰浴中存放。

[0071] (3.3.2)每100μL GV3101(pSoup‑p19)感受态细胞加1μg质粒DNA，用手轻弹管底促进混匀，依次在冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min。

[0072] (3.3.3)加入800μL无抗生素的LB培养基，28℃振荡培养2～3h。

[0073] (3.3.4)5000rpm离心1min收菌，留取约100μL上清，轻轻吹打重悬菌块，于含相应抗生素的LB平板上均匀涂布，平板倒置，放于28℃培养箱培养2‑3天。

[0074] 按照同样的方法，将pTRV‑1载体和pTRV‑2分别转根癌农杆菌菌株GV3101中得到对应的农杆菌。

[0075] (4)携带pTRV2‑RhALEU载体的根癌农杆菌菌株GV3101侵染月季幼苗[0076] 将携带pTRV‑1、pTRV‑2、pTRV2‑RhALEU载体的根癌农杆菌菌株GV3101分别在添加50μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的Luria‑Bertani(LB)培养基中生长，接着在28℃，
200rpm的液体培养基中振荡14h，4000rpm离心收集农杆菌细胞，重悬在渗透缓冲液(10mM 
2‑(N‑吗啉基)乙磺酸(2‑(N‑Morpholino)ethanesulfonic acid,MES)，200mM乙酰丁香酮(acetosyringone)和10mM氯化镁(MgCl2)，pH 5.6，菌的终浓度为OD600＝0.8‑1.0。

[0077] 实验组为将携带pTRV‑1载体和pTRV2‑RhALEU载体的农杆菌菌液以1:1(v/v)的比例混合(对照组为携带pTRV‑1和pTRV‑2载体的农杆菌以1:1(v/v)的比例混合的混合菌液)(Virus‑induced gene silencing in tomato参考文献doi：https://doi.org/10.1046/j.1365‑313X.2002.01394.x)，室温黑暗培养3～4h，将步骤1培养的月季幼苗浸泡在含有上述农杆菌菌液的渗透缓冲液中，置于‑25KPa真空中转化。去离子水冲洗试管苗，然后在8℃黑暗中培养3天。移栽至培养土中，在22±1℃、相对湿度60％、长日照(光照16h/黑暗8h)下生长。培养40天时，对1级花朵的花朵表型进行了持续监测，即每天在固定时间点对花朵进行拍照记录。

[0078] 使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Low ROX Premixed)试剂(Vazyme)在Applied Biosystems StepOnePlusTM实时定量PCR系统中进行反应，反应体系和反应程序同实施例1，通过实时荧光定量RT‑PCR(qRT‑PCR)计算RhALEU基因和衰老Marker基因RhSAG12表达量。
‑ΔΔCT
以RhUBI2基因作为内对照，至少3个生物学重复。用2 法计算相关基因表达。结果如图4。
与TRV对照相比，RhALEU沉默的花瓣中RhALEU的表达降低了56.6％，表明RhALEU沉默的植株可以用于后续的研究(图4A)。RhALEU沉默植株与TRV对照植株开花过程的差异表现在5级(完全开放蕾期)到失去观赏价值(花朵出现明显掉瓣)(图4B)，对照植株从3.8±0.4天延长到RhALEU沉默植株的5.9±0.8天，延长了约55.3％(图4C)。与TRV对照相比，5级RhALEU沉默的花瓣中SAG12表达降低了51.2％(图4D)。这些结果表明，RhALEU在花瓣衰老中起着显著的正调控作用。