[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种编码KO蛋白的基因及其在早期预判芒果未知种矮生性状中的应用

[0002] 矮化栽培是多年生木本果树大规模集约化生产不变的发展趋势。植物矮化主要分为遗传性矮化和生理性矮化。单一基因突变属于遗传性矮化，其矮化机理多为基因合成蛋白，蛋白影响激素，激素影响表型；受环境因素影响，导致植株表型发生变化，属于生理性矮化，其矮化作用机理多为环境变化影响植物激素分泌，最终导致变化。但不论哪种矮化模式，都要通过激素来影响表型，植株生长过程中的激素多与赤霉素(gibberellins，GAs)有关。

[0003] 内根‑贝壳杉烯氧化酶(ent‑kaurene oxidase，KO)是一类单加氧化酶，其位于赤霉素合成途径的上游，其将内根‑贝壳杉烯(ent‑kaurene)氧化为内根‑贝壳杉烯酸(ent‑kaurenic acid)，调控着赤霉素的合成量。KO存在于植物的各个组织中，在植物体生长旺盛期的的花序、茎、叶及胚中表达量较高，而在年老的叶片和茎中的表达量较低。目前，KO基因已在豌豆、玉米、黄瓜、梨、苹果、山核桃、石榴等多种植物中被分离和克隆。研究表明，KO基因位点发生阻断会导致KO的功能丧失，从而阻断赤霉素的合成过程，使植株节间变短，株高变矮。例如，豌豆PsKO1矮化突变体因KO基因的突变使植物体内GA含量缺乏，导致豌豆节间和根的长度缩短，根系变弱，植株矮小；拟南芥ga3‑1矮化突变体植株由于KO等位基因的一个碱基位点的突变，导致KO的活性减弱，进而抑制了植物的生长发育；水稻GA缺陷型半矮化突变体d35由于OsKO2在外显子的一个核苷酸位点变异，导致OsKO2的功能丧失，使植株表现出半矮化的表型；通过EMS诱变得到一个水稻矮化突变体，研究发现由于OsKO1基因上的两个连续突变位点，导致细胞色素P450结构域中的苏氨酸(Thr)转化为蛋氨酸(Met)，阻断了GA的生物合成，植物体表现出发芽延迟、半矮化的表型。同时，KO基因表达水平的变化也会影响植物体的形态建成，如苹果M26矮化砧木由于KO的合成较少，从而削弱了植物体内赤霉素的合成，导致苹果砧木的矮化；山核桃中由于CcKO的过量表达，改变了GA合成途径下游GA20ox和GA2ox基因的表达量，三个基因的表达水平协同调控作用，促进了植株株高的伸长。

[0004] 通过对比具有乔生特性和矮生特性植物材料KO基因的表达量，可以预判植物其是否具有矮生特性，既省时又省力。目前还未见利用KO基因预判芒果品种是否具有矮生特性的相关报道。

[0024] 下面结合对本发明专利的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域所属的技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0025] 在以下是实例中，主要耗材和仪器如下：

[0026] 1.耗材

[0027] III 1st  Strand  cDNA  Synthesis  SuperMix  for  qPCR(gDNAdigesterplus)，YEASEN；2×HS Taq Universal SYBR Green Qpcr Master Mix,SAIPUBIO；1.5ml离心管，上海生工生物工程股份有限公司，F601620‑9001；0.2ml 8Strip Real‑time PCR Tubes，上海生工生物工程股份有限公司，F603001‑0001；枪头，美国Axygen。

[0028] 2.仪器

[0029] ND5000超微量紫外可见分光光度仪；QuantStudio(TM)7Flex  System ThermoFisherScientific；高速冷冻离心机，杭州奥圣生物技术有限公司，iCEM‑24R；迷你离心机，美国精骐有限公司，4016006；移液器，德国Eppendorf公司。

[0030] 实施例1：芒果KO基因的克隆与序列分析

[0031] 1.RNA提取

[0032] 采用RNA prep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)提取桂七芒叶片总RNA。

[0033] 称取3g桂七芒叶片组织放入已灭菌的研钵中，迅速在液氮中研磨成粉末，然后参照植物总RNA提取试剂盒说明书操作提取总RNA。试验中的所有耗材均需用DEPC原液浸泡1.5d，再利用高温蒸汽灭菌锅121℃，灭菌0.5h，以确保灭活RNA酶。

[0034] RNA提取完毕后立即用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，同时利用紫外分光光度计260/280nm吸光值检测RNA的浓度和纯度，当OD260/280nm达到2.0左右表示提取的RNA纯度较高，将提取成功的RNA放入‑80℃冰箱中保存备用。

[0035] 2.cDNA合成

[0036] 采用M‑MuL第一链cDNA合成试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)将提取的芒果高质量的RNA合成cDNA第一链，具体操作步骤如下：

[0037] (1)在冰浴的无RNA酶的PCR管中加入如下反应混合物：总RNA 5μL，Oligo(DT)(0.5μg/μL)1μL，RNase free ddH2O 6μL；

[0038] (2)将上述反应液离心混均后，在PCR仪中65℃温浴5min后，立即冰浴冷却30s，再离心3‑5s后加入5x Reaction Buffer 4μL，RNase Inhibitor(40U/μL)1μL，DNTP Mix(10mmom/L)2μL，M‑MuLV RT(200U/μL)1μL；

[0039] (3)将上述混合液放入PCR仪中42℃孵育反应60min，然后70℃处理10min，待试验结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测cDNA的完整性，放入‑20℃冰箱中保存备用。

[0040] 3.引物设计

[0041] 根据NCBI数据库中已公布的开心果(pistacia vera L..)的KO编码基因的序列(登录号：XP_031283332.1)，利用Primer5软件设计特异性引物(具体见表1)。

[0042] 表1特异性引物名称及序列

[0043]

[0044] 以桂七芒叶片cDNA为模板，以表1中特异性引物，选用2x高保真PCR Mix预混液进行PCR扩增。PCR扩增体系见表2。

[0045] 表2PCR扩增体系

[0046]

[0047] PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃30s，58℃120s，72℃90s，39个循环；72℃延伸10min。

[0048] 4.目的片段回收

[0049] 采用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)进行目的片段的回收，具体操作参照说明书进行。

[0050] 5.目的片段连接

[0051] 采用零背景TOPO‑Blunt平末端克隆试剂盒进行连接，具体操作如下：

[0052] (1)在冰浴的PCR管中配制表3的连接体系。

[0053] 表3连接体系

[0054]

[0055] (2)20‑30℃室温连接5min。

[0056] 6.重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态

[0057] 采用热激法将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，具体操作如下：

[0058] (1)自‑80℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞DH5α，放入冰上融解，待其刚刚融化后，立即分装到遇冷的1.5mL的离心管中；

[0059] (2)将4μL连接反应液加入到50μL大肠杆菌感受态DH5α细胞中，轻弹数下管底使其混匀，迅速放置冰上孵育反应30min；

[0060] (3)将离心管放入42℃水浴锅中热激90s后快速放入冰上冰浴5min；

[0061] (4)反应结束后，加入500μL无菌的不含任何抗生素的LB液体培养基，在37℃、200rmp摇床中孵育60min；

[0062] (5)待摇床结束后，4000rpm离心3min收集菌体，吸掉一部分上清液，保留100μL菌液混匀，将剩余菌液均匀的涂布在含25μg/mL的Kana抗性的平板上；

[0063] (6)37℃正置平板至菌液被完全吸收，然后倒置平板培养12‑16h；

[0064] (7)在每个平板中挑取8‑10个白色单菌落分别加入到含有Kana抗生素的1mL LB液体培养基中，在37℃摇床中225rpm继续振荡培养3h；

[0065] (8)将得到的菌液进行菌液PCR检测，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应结果，挑取检测与目的条带大小一致的3‑5个菌液测序。

[0066] 7.KO基因及氨基酸序列理化性质分析

[0067] 7.1根据NCBI网站中BLAST对氨基酸序列进行序列相似性分析。

[0068] 结果见图1。

[0069] 由图1可知，根据NCBI上登录的黑麦草、棉花、砂仁等植物的KO蛋白序列进行比较，确定获得的基因为芒果KO基因。

[0070] 7.2用protparam分析KO序列，利用PROSITE Scan对基因进行保守区域预测分析。

[0071] KO基因的开放阅读框为1554bp；KO基因编码517个氨基酸，分子重量为58.65KD，理论等电点为8.56。

[0072] 7.3采用DNAMAN软件分析基因氨基酸的结构特征。

[0073] KO蛋白的氨基酸组成见图2。

[0074] 由图2可知，KO蛋白氨基酸组成主要是亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、谷氨酸和丙氨酸等氨基酸组成，其中酸性氨基酸(Asp+Glu)60个，碱性氨基酸(Arg+Lys)65个。

[0075] 7.4用Phobius(http://phobius.sbc.su.se/)在线分析蛋白序列跨膜区，分析结果见图3。

[0076] 由图3可知，KO蛋白为胞浆蛋白，KO编码的蛋白质均没有信号肽。对KO蛋白序列的跨膜结构域进行预测结果显示，KO跨膜区域明显。

[0077] 7.5利用DNAMAN对KO蛋白二级结构预测，结果见图4。

[0078] 由图4可知，在KO编码蛋白中，螺旋结构占43.13％，折叠占10.44％，无规则卷曲占46.42％。

[0079] 7.6对KO蛋白三级结构预测，预测结果见图5。

[0080] 由图5可知，KO蛋白由若干不同个α‑螺旋、β‑转角和随机卷曲构成蛋白肽链，预测结果与二级结构分析结果高度一致。

[0081] 7.7利用DNAMAN预测KO的亲水性和疏水性，预测结果见图6。

[0082] 由图6可知，KO多肽链第164位的精氨酸具有最低值‑3.53，亲水性最强；而第31位的亮氨酸具有最高值3.94，疏水性最强。

[0083] 7.8为了研究Mango KO蛋白的进化情况，使用MEGA7.0构建KO蛋白氨基酸序列的系统进化树，结果见图7。

[0084] 由图7可知，芒果KO与开心果KO(XP_031279374.1)亲缘关系较近；其次为文冠果(KAH7567353.1)、漾濞槭(TXG52327.1)、苦楝(KAJ4701830.1)、温州蜜柑(GAY65602.1)、甜橙(XP_006492563.2)、克莱门柚(XP_024040161.1)、山荆子(TQD97754.1)、苞叶木(KAF3446236.1)和长蒴黄麻(OMO74862.1)等植物的亲缘关系较近。

[0085] 实施例2：基因相对量PCR检测

[0086] 取广西亚热带作物研究所芒果资源圃芒果叶片，探究KO基因在不同乔生品种和矮生品种不同时期中的表达情况。其中，乔生品种为金煌芒、黄象牙和红象牙；矮生品种为桂七芒、爱文芒和秋芒；分别取萌芽期、开花期、坐果3‑4周、坐果7‑8周及果实成熟期的成熟叶片进行分析。

[0087] 通过实时荧光定量PCR，采用SYBR GREEN染料法，以杧果‑GAPDH为内参，做相对定量检测，具体操作如下：

[0088] 1.RNA提取

[0089] 同实施例1。

[0090] 2.RNA质量检测及浓度测定

[0091] 测定样品OD值，并观察其在260nm和280nm的吸收值以确定RNA的质量。进行琼脂糖凝胶电泳，确定抽提RNA的完整性和DNA的污染情况。

[0092] 3.RNA反转录

[0093] 3.1残留基因组DNA去除

[0094] 取适量RNA(本实验取300ng)，添加RNase‑freeddH2O至12μL，加入3μL5×gDNA digester Mix，用移液器轻轻吹打混匀，42℃孵育5min；

[0095] 3.2逆转录反应

[0096] 在上一步混合液中加入5μL III SuperMix plus，用移液器轻轻吹打混匀，得到20μL反应体系。PCR程序设置为：27℃4min，55℃12min，85℃5min。反应产物即为cDNA，立即用于PCR反应。

[0097] 4.实时荧光定量

[0098] 配制表4反应体系。

[0099] 表4反应体系

[0100]

[0101] 两步法荧光定量PCR扩增条件的设置：

[0102] 扩增曲线：94℃5min，循环1次；94℃12s，60℃35s，循环40次。

[0103] 熔解曲线：94℃20s，60℃65s，94℃20s，连续检测信号。

[0104] 结果见图8。

[0105] 由图8可知，在芒果5个关键物候期矮生品种KO基因表达量在2以下且各个时期表达量变化不大；在乔生芒果品种中KO基因表达量均在10以上，最高可达20，不同的乔生芒果品种KO基因表达量在5个关键物候期无规律性变化，但在任意芒果物候期乔生芒果品种KO基因表达量显著高于矮生芒果品种，芒果KO基因的表达情况可以作为芒果是否具有矮生性状的早期预判指标。

[0106] 综上，本发明通过荧光定量分析法测定KO基因表达量可以为早期预判供试材料是否具有矮生性状提供支持。

[0107] 前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。