[0001] 本发明属于功能基因技术领域，具体涉及一种南极磷虾脱卤酶及其在卤代烷烃化合物降解中的应用。

[0002] 由于在工业与农业生产过程中不可避免地会产生大量的卤代烷烃副产物，这些副产物不仅会造成资源的浪费，而且某些副产物具有一定的毒性与污染性，对人体以及环境造成危害。而卤代烷脱卤酶因其独特的催化机制、广泛的底物特异性而备受关注，不但具有重要的理论价值，而且已经部分应用于回收化工过程的副产品、有毒环境污染物的生物修复、化学战剂的去污、环境污染物生物传感、蛋白质分析的蛋白质标签与细胞成像等领域中。尤其在化学战剂的应用领域，芥子气(双‑2‑氯乙基硫醚)是一种常规的化学战剂也是一种糜烂性毒剂，能够使生物体内的遗传物质烷基化，进而引起皮肤和组织的起泡、糜烂与坏死。

[0003] 对于卤代烷烃副产物的净化方法传统使用的是化学的洗消方法，但这些化学试剂大多具有毒性、腐蚀性，并不适合对人员、服装、精密仪器等进行使用。而脱卤酶则可以在温和条件下有效的降解双‑2‑氯乙基硫醚，生成氯离子与无毒的硫二甘醇，有望代替传统的化学洗消方法，表现出巨大的应用潜力。自1985年发现第一个卤代烷烃脱卤酶(HLDs)以来，在海洋菌、病原菌、古生菌以及植物共生体和植物寄生虫的细菌菌株中均有被发现。第一个被报道的卤代烷脱卤酶是1985年Xanthobacter autotrophicus GJ10中发现的DhlA，它能够水解1，2‑二氯乙烷，1993年与1997年又相继发现了可以水解1,3,4,6‑四氯‑1,4‑环己烷与1‑氯丁烷的LinB与DhaA，他们分别发现于Sphingomonas paucimobilis UT26菌株与Rhodococcus rhodochrous菌株，这三种卤代烷脱卤酶的晶体结构与底物特异性已被广泛研究。根据系统发育分析，可以将HLDs分为HLD‑I、HLD‑II和HLD‑III三个亚科，三个亚科的有着不同组成的催化五联体，分别为Asp‑His‑Asp+Trp‑Trp、Asp‑His‑Glu+Asn‑Trp、Asp‑His‑Asp+Asn‑Trp，目前经生化鉴定的HLDs大多属于HLD‑II。根据底物特异性分为4个组，分别为SSG‑I、SSG‑II、SSG‑III与SSG‑IV，SSG‑I类可以转化许多难降解的氯化底物；偏爱溴化和碘化化合物的HLDs被归类为SSG‑IV。

[0004] 海洋动物尤其来自于南极磷虾的脱卤酶却未有报道南极磷虾是南极生态系统的关键物种，种群密度可以达到每立方米10,000‑30,000只，若以生物质能来说，它们可能是地球上生物量最多的动物物种(大约共有5亿吨)。南极磷虾自身为低于南极上空高紫外等极端条件，产生了与其它海域海洋生物不同的基因与生物酶系，本发明自南极磷虾体内发现了一种对双‑2‑氯乙基硫醚具有较好降解作用的脱卤酶，并在酵母细胞中实现了高效表达制备。

[0023] 本发明所发现的酶被归类于卤代烷脱卤酶，所述的卤代烷脱卤酶是一类能够催化卤代烷烃化合物碳‑卤键断裂的水解酶，与脂肪酶、酯酶、羧肽酶等均属于α/β水解酶超家族，卤代烷烃化合物被水解后转化为相应的醇、卤素离子与质子，整个酶促反应过程中不需要辅酶/辅基或者氧的参与。其底物谱比较广泛，可以催化氯代、溴代、碘代烷烃、环烷烃、酯、醚、环氧化物等卤代烷烃化合物的水解。

[0024] 下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。

[0025] 实施例1：南极磷虾脱卤酶基因的克隆及表达载体的构建

[0026] 以南极磷虾cDNA基因组序列为模板，使用HeF/HeR为引物对南极磷虾脱卤酶基因进行扩增(引物中含有EcoRI‑NotI)酶切位点。PCR扩增的南极磷虾脱卤酶琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，基因片段全长1083bp(含酶切位点)。引物如下:

[0027] HeF 5，‑CGGCCGATGGCGGGCTTGAAGTTCTATTTGA‑3，

[0028] HeR 5，‑GCGGGCTTATGATAGTTTTCCATCAACAAAG‑3，

[0029] 确定所筛选的基因，其核苷酸片段的序列如下：

[0030] ATGGCGGGCTTGAAGTTCTATTTGATACGGCTGTTGGTACTACCCATCCTTATCATCAAAGTTCAAGCGCTACAAATGGT

[0031] GAACATTTTACTGAGCATCGCATCAAAGTTATTTATCACAGGAAAGAAACAAATGATAGTTCGTACCCCGGAAGAAAACT

[0032] TTTCTAACTTGGATAAAGTTGGCTACACCTTCAAAGCTAACTACGTTGAACTTCCAATAGGTGGGGGAAAAGCACTGCCA

[0033] AGGGTGCACTATGTTGATGAAGGCCCACGAGATGCCATGGAAACAATCCTATGTCTTCATGGGGAGCCAAGTTGGTCTTT

[0034] CCTCTACCGCCACATGATCCCCATTCTTGCCAAGGCTGGTTACCGTGTTATTGCTCCAGACTTCATAGGCTTTGGGAAAT

[0035] CTGATAAATACACATATATGGAATGTTACACTCATGAAATGCATACTCAGACTCTTCGACTGCTTCTAGATTATTTAAAG

[0036] GTGTCAAATGTTACAGTGGTTGGGCAGGATTGGGGTGGTCTTATCGGTTGCTCCGTGTTGAAGGATTCTCCAGATAAATT

[0037] CTCTCGTCTTGTTGTCATGAACACCGGCGTCCCTGATGGCATCATAAAAAAGTTCACCCCATATGTCATAGCCAATGCTA

[0038] CACCTGTTATACTCTGGCAGGCAGTTGTTCAGCTTCTTGGAGTATGGTTACCAATAGGTCTCTTGTTCAAACACATCTTG

[0039] AAGAATAACCCCTCTAAGGATGTAATAAAGGGTTACTGTGCCCCATTCCCTTCTGCACTCTACAAGGCCGGTGCAGCAGC

[0040] ATGGCCACTGAATGTTCCAGTCCTCCCTGGTGGGCCTATTGCTGCTGATATGAAGATAGCACAAACCTTCCTGAAAAGAT

[0041] GGAAGAATCCTGTGCTTATTATGTTCTCAGATAGTGACCCTATCTCTGCCTCATGGAAATACACTTTTGAAGAGTTATGT

[0042] CCTGCGGCACACCAGAAGACAATTGTAGGTGCTGGTCACATGCTGCAGGAAGAGAAGGGAGAAGAGATCGCTTACAACAT

[0043] TGTCAGCTTTGTTGATGGAAAACTATCATAA(SEQ ID NO:1)。

[0044] 其编码蛋白的氨基酸序列如下：

[0045] MAGLKFYLIRLLVLPILIIKVQALQMVNILLSIASKLFITGKKQMIVRTPEENFSNLDKVGYTFKANYVELPIGGGKALP

[0046] RVHYVDEGPRDAMETILCLHGEPSWSFLYRHMIPILAKAGYRVIAPDFIGFGKSDKYTYMECYTHEMHTQTLRLLLDYLK

[0047] VSNVTVVGQDWGGLIGCSVLKDSPDKFSRLVVMNTGVPDGIIKKFTPYVIANATPVILWQAVVQLLGVWLPIGLLFKHIL

[0048] KNNPSKDVIKGYCAPFPSALYKAGAAAWPLNVPVLPGGPIAADMKIAQTFLKRWKNPVLIMFSDSDPISASWKYTFEELC

[0049] PAAHQKTIVGAGHMLQEEKGEEIAYNIVSFVDGKLS(SEQ ID NO:2)。

[0050] 将本发明获得的卤代烷烃脱卤酶氨基酸序列在NCBI上进行序列比对，结果表明，该酶序列与目前已经报道的卤代烷烃脱卤酶蛋白序列相似性较低，其中与来自中国对虾(Penaeus chinensis)的卤代烷烃脱卤酶(NCBI登录号XP_047472246.1)的相似度最高，仅为59.1％，与美洲螯龙虾(美洲螯龙虾)卤代烷烃脱卤酶(NCBI登录号XP_042239770.1)的相似度为58.99％。表明所筛选获得的卤代烷烃脱卤酶是一种新型的脱卤酶。

[0051] 使用EcorⅠ与NotI双酶切PGAPZαA载体与南极磷虾脱卤酶基因，并用DNA产物纯化试剂盒回收酶切产物。利用连接酶将南极磷虾脱卤酶基因与双酶切后的PGAPZαA载体进行重组，将其转化到毕赤酵母细胞中，48h后挑取单菌，进行菌液PCR验证阳性重组克隆，阳性克隆再进行DNA测序验证基因序列的正确性。

[0052] 实施例2：制备重组南极磷虾脱卤酶

[0053] 取测序鉴定的阳性重组毕赤酵母GS115/PGAPZαA‑脱卤酶菌液100μL，接种于5.0mL含博莱霉素的YPD液体培养基(甘油2％，酵母粉1％，蛋白胨2％)，28℃培养过夜，次日取500.0μL种子液接种于50.0mL含博莱霉素的YPD液体培养基28℃继续培养54h，8000g离心
5min，收集上清液，通过截留分子量10Kda的超滤浓缩膜浓缩20倍后即为重组南极磷虾脱卤酶粗酶液。将上清液SDS‑PAGE检测(图2)。当诱导剂甘油添加量2％，诱导54小时后，发酵上清液中获得了分子量39Kda的重组脱卤酶。

[0054] 实施例3南极磷虾脱卤酶的活力测定

[0055] 酶活力测定方法:双(2‑氯乙基)醚作为底物，总反应体系500μl，缓冲液为0.1mol/L Gly‑NaOH，底物的终浓度为10mmol/L，加酶量为10μl粗酶液。40℃反应20min后，吸取200μl加入装有20μl 30％(体积分数)HNO3离心管中终止反应，之后加入55μl Hg(SCN)2溶液和110μl NH4Fe(SO4)2溶液，混匀静置10min后取200μl加入96孔板中，使用酶标仪测量在600nm下的吸光度。

[0056] 酶活力定义:在一定条件下，1min催化底物产生1μmol Cl‑所需的酶量定义为1个酶活力单位。

[0057] 以2.0％的甘油作为诱导剂，摇瓶发酵8h即有重组脱卤酶分泌到胞外(图3)，在产酶量最高的54h时取样，重组酶活力对双(2‑氯乙基)醚的降解活力达到2000U/mL(表1)。

[0058] 表1：重组南极磷虾脱卤酶活力及对照表

[0059]

[0060] 以配制的双(2‑氯乙基)醚作为底物，当底物浓度100mmol/L，40℃条件下，添加重组卤代烷烃脱卤酶，测定不同时间的降解降解效率，结果表明，0.5h,1h,2h,3h,5h后，双(2‑氯乙基)醚的降解率分别达到了7.9％，18.3％，37.6％，53.7％与63.2％。结果表明本发明得到的重组卤代烷烃脱卤酶可以在温和条件下有效的实现底物分解。

[0061] 实施例4南极磷虾脱卤酶的稳定性保护剂

[0062] 酶的失活是限制酶制剂工业生产和应用的重要因素。酶的稳定化的主要方法有3种，即添加保护剂、化学修饰和固定化处理。本发明提供了一种南极磷虾脱卤酶化学保护剂的最佳用量。其中硼砂0.02克/ml，氯化钙0.03克/ml，甘油5％(v/v)。30度保存90天，重组脱卤酶的活力始终维持在88％以上(图4)。

[0063] 综上，本发明提供了一种南极磷虾脱卤酶基因、蛋白序列及其制备方法，所提供的脱卤酶来自南极磷虾，该酶底物谱广泛，可以催化氯代、溴代、碘代烷烃、环烷烃、酯、醚、环氧化物等卤代烷烃化合物碳‑卤键断裂，在生物催化、生物修复、生物传感和细胞成像等领域都具有应用前景。