[0001] 本发明涉及荧光探针技术领域，更具体的说是涉及基于羟基苯基苯并噻唑染料专一响应HClO的荧光探针及其制备方法和应用。

[0002] 内源性次氯酸HClO是在髓过氧化物酶(MPO)催化下由过氧化氢与氯离子反应产生。由于HClO在细胞内能够稳定的存在，它能够作为研究细胞内活性氧(ROS)变化的代表物之一。细胞内的HClO水平的波动与过度氧化应激有密切的关系，从而引起一系列的疾病，例如关节炎、心血管疾病、神经退行性疾病、癌症等。因此，开发一种检测细胞HClO的方法并探讨其在疾病诊断和各种病理生理特性中的作用至关重要。

[0003] 迄今为止，检测HClO的方法主要有碘量法、比色法、色谱法、荧光探针法、电化学法等。其中由于小分子荧光探针具有无创、实时评估以及其操作简单等优势，引起了科研工作者对其极大的关注。迄今为止，科研工作者已经报道了许多检测HClO的识别基团，其中包括硫醚、硫代氨基甲酸酯、对氨基苯醚、不饱和C＝C键、肟、硒化物、酰肼和其它识别基团等。尽管已经报道了许多检测HClO的荧光探针，但是超级快速检测氧化应激过程中HClO水平波动的荧光探针仍然很少。因此，构建对HClO具有高特异性的新型长波长荧光探针并实现对细
胞和活体成像的研究仍迫在眉睫。

[0004] 羟基苯基苯并噻唑作为典型的ESIPT荧光染料，具有原料成本低、合成简单、可修饰位点多、荧光量子产率高和光稳定性好等优点；另外更重要的是，羟基苯基苯并噻唑类荧光染料的分子量相对较小、生物相容性好、容易渗透活细胞、非常适用于生物荧光成像而被广泛关注。基于此，制备基于羟基苯基苯并噻唑荧光染料专一性响应生物细胞内HClO的荧
光探针，并实现在活体层面的应用具有重要意义。

[0005] 因此，提供基于羟基苯基苯并噻唑染料专一响应HClO的荧光探针及其制备方法和应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

[0050] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他
实施例，都属于本发明保护的范围。

[0051] 实施例1

[0052] 荧光探针的制备步骤(合成路线见图1)如下：

[0053] (1)化合物1的制备

[0054]

[0055] 将5‑溴水杨醛、2‑氨基苯硫醇和无水二甲基亚砜在180℃搅拌6h，获得反应液，将反应液冷却至室温，并将1/2反应液体积的H2O缓慢加入反应液中，过滤沉淀，并用水洗涤沉淀，干燥，得到化合物1；

[0056] 5‑溴水杨醛、2‑氨基苯硫醇按照和无水二甲基亚砜的摩尔比为1：1：400；

[0057] (2)化合物2的制备

[0058]

[0059] 将步骤(1)制得的化合物1、六亚甲基四胺(HMTA)溶解于乙酸(ACOH)并回流搅拌，120℃搅拌10h，通过旋转蒸发除去溶剂得到粗产品；将粗产品通过硅胶柱层析，使用石油
醚/乙酸乙酯(15：1，v/v)作为流动相，分离得到化合物2；

[0060] 化合物1、六亚甲基四胺和乙酸的摩尔比为10：1：500；

[0061] (3)探针BTHCl的制备

[0062]

[0063] 将步骤(2)制得的化合物2、二甲基硫代氨基甲酰氯和碳酸钾溶解于乙腈(CH3CN)，在室温下搅拌12h，通过旋转蒸发除去溶剂得到粗产品；将粗产品通过硅胶柱层析，使用石油醚/乙酸乙酯(6：1，v/v)作为流动相，分离得到荧光探针BTHCl；

[0064] 化合物2、碳酸钾、二甲基硫代氨基甲酰氯和乙腈的摩尔比为1：2：1：500。

[0065] 荧光探针BTHCl的核磁氢谱图见图2；荧光探针BTHCl的核磁碳谱图见图3。

[0066] 1H NMR(500MHz,DMSO)δ9.99,8.74,8.73,8.22,8.21,8.20,7.99,7.97,7.63,7.63,7.62,7.62,7.61,7.60,7.60,7.56,7.56,7.54,7.54,7.54,7.53,7.53,7.28,7.26,
7.26,3.60,3.43.

[0067] 13C NMR(126MHz,DMSO)δ188.21,184.91,159.66,152.16,151.30,136.70,135.78,134.97,132.57,130.32,127.47,126.70,123.77,122.86,120.39,119.83,43.94.

[0068] 实施例2

[0069] 荧光探针的制备步骤如下：

[0070] (1)化合物1的制备

[0071] 将5‑溴水杨醛、2‑氨基苯硫醇和无水二甲基亚砜在175℃搅拌5.5h，获得反应液，将反应液冷却至室温，并将1/2反应液体积的H2O缓慢加入反应液中，过滤沉淀，并用水洗涤沉淀，干燥，得到化合物1；

[0072] 5‑溴水杨醛、2‑氨基苯硫醇按照和无水二甲基亚砜的摩尔比为1：1.5：400；

[0073] (2)化合物2的制备

[0074] 将步骤(1)制得的化合物1、六亚甲基四胺溶解于乙酸，并回流搅拌，125℃搅拌11h，通过旋转蒸发除去溶剂得到粗产品；将粗产品通过硅胶柱层析，使用石油醚/乙酸乙酯(15：1，v/v)作为流动相，分离得到化合物2；

[0075] 化合物1、六亚甲基四胺和乙酸的摩尔比为15：1：500；

[0076] (3)化合物3的制备

[0077] 将步骤(2)制得的化合物2、二甲基硫代氨基甲酰氯和碳酸钾溶解于乙腈，在室温下搅拌13h，通过旋转蒸发除去溶剂得到粗产品；将粗产品通过硅胶柱层析，使用石油醚/乙酸乙酯(6：1，v/v)作为流动相，分离得到荧光探针BTHCl；

[0078] 化合物2、碳酸钾、二甲基硫代氨基甲酰氯和乙腈的摩尔比为1：3：1.5：500。

[0079] 实施例3

[0080] 荧光探针的制备步骤如下：

[0081] (1)化合物1的制备

[0082] 将5‑溴水杨醛、2‑氨基苯硫醇和无水二甲基亚砜在185℃搅拌5h，获得反应液，将反应液冷却至室温，并将1/2反应液体积的H2O缓慢加入反应液中，过滤沉淀，并用水洗涤沉淀，干燥，得到化合物1；

[0083] 5‑溴水杨醛、2‑氨基苯硫醇按照和无水二甲基亚砜的摩尔比为1：2：400；

[0084] (2)化合物2的制备

[0085] 将步骤(1)制得的化合物1、六亚甲基四胺溶解于乙酸并回流搅拌，122℃搅拌12h，通过旋转蒸发除去溶剂得到粗产品；将粗产品通过硅胶柱层析，使用石油醚/乙酸乙酯(15：1，v/v)作为流动相，分离得到化合物2；

[0086] 化合物1、六亚甲基四胺和乙酸的摩尔比为20：1：500；

[0087] (3)化合物3的制备

[0088] 将步骤(2)制得的化合物2、二甲基硫代氨基甲酰氯和碳酸钾溶解于乙腈，在室温下搅拌14h，通过旋转蒸发除去溶剂得到粗产品；将粗产品通过硅胶柱层析，使用石油醚/乙酸乙酯(6：1，v/v)作为流动相，分离得到荧光探针BTHCl；

[0089] 化合物2、碳酸钾、二甲基硫代氨基甲酰氯和乙腈的摩尔比为1：4：2：500。

[0090] 试验例

[0091] 利用实施例1制备的荧光探针进行性能测试

[0092] (1)溶液中检测HClO的荧光探针BTHCl的反应时间测试

[0093] 用乙腈配制1mM BTHCl的荧光探针储备液；

[0094] 荧光探针BTHCl(10μM)与HClO(80μM)在溶液体系为乙腈/PBS缓冲液(1：99，v/v，10mm，pH 7.4)中进行反应，结果见图4，加入HClO后，荧光探针BTHCl和HClO的响应时间超快速(约15s)。

[0095] (2)溶液中检测HClO的荧光探针BTHCl的浓度滴定测试以及浓度线性关系

[0096] 在37℃的乙腈/PBS(1：99，v/v，10mm，pH 7.4)中测试了探针BTHCl(10μM)与不同浓度的HClO(0，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，40，45，50，60，70，80μM)的光谱性能。发现随着HClO的浓度逐渐增加，探针在225nm和306nm处有吸收逐渐增强，并在440nm处出现了一个逐渐增强的红移的吸收峰(图5)；并且在550nm处的荧光峰也逐渐增强，其荧光强度在HClO浓度至80μM时达到最大且增强约171倍(探针BTHCl(10μM)在550nm处的荧光
值为0.528359，探针BTHCl(10μM)+HClO(80μM)在550nm处的荧光值为90.94859)(图6)。

[0097] 以HClO浓度为横坐标，探针BTHCl在550nm处的荧光强度为纵坐标，绘制图并进行2
线性拟合，得到该探针的线性回归方程为：Y＝1.742X+2.012，线性相关系数R＝0.994并计算出检测限为1.7nM(见图7)。

[0098] (3)干扰性和抗干扰性离子实验

[0099] 在不同的荧光比色皿中，分别加入4mL乙腈/PBS缓冲液(1：99，v/v，10mm，pH 7.4)和荧光探针储备液，结果见图8，当探针BTHCl(40μM)分别加入活性氮以及活性氧化物(HClO‑ 1 t ‑(40μM)、ONOO (50μM)、H2O2(50μM)、O2(50μM)、·OBu(50μM)、·OH(50μM)、O2(50μM)、TBHP‑ 2‑
(50μM)、HS (50μM)、SO3 (50μM)、Hcy(50μM)、Cys(50μM)、GSH(50μM))等分析物种后，探针BTHCl可以对HClO进行专一性识别，并在550nm处出现明亮的黄色荧光，而跟其它种类分析
物反应后没有荧光出现，因此，探针可以实现专一性响应HClO。Blank不加入活性氮以及活性氧化物。

[0100] 当BTHCl(10μM)在分别加入上述分析物后再加入80μM HClO反应12s后，可以看出HClO在与各种分析物共存情况下，BTHCl在复杂的溶液体系内依然能够专一性检测到HClO，且荧光程度较强。实验证明，BTHCl能够在响应HClO时不受其它物质的干扰(见图9)。

[0101] (4)pH值的响应性实验

[0102] 配置pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的PBS缓冲液，对BTHCl(10μM)以及BTHCl(10μM)和HClO(80μM)反应后荧光强度的变化进行了研究。

[0103] 结果如图10所示，荧光探针BTHCl的荧光强度在pH值为2.0‑12.0的溶液中基本保持不变；在加入HClO后，随着pH值的不断升高，其位于550nm处荧光逐渐增强，且在生理范围
7.0‑8.0的pH值下，荧光强度最强。实验证明荧光探针BTHCl能够适应生物体内的pH环境。

[0104] (5)MTT细胞毒性实验

[0105] 在37℃、DMEM培养基、5％CO2的条件下，在96孔板中进行MTT实验来评估探针BTHCl(0‑20μM)对细胞毒性，不同浓度的探针BTHCl分别处理不同细胞(4T1细胞、MCF‑7细胞、MDA‑MB‑231细胞、LX‑2细胞、HepG2细胞)做三组平行实验继续培养24h，然后用PBS洗涤3次，加入0.5mg/L的MTT继续孵育4h，吸出培养基，加入100μL的DMSO(大约15min)。每个实验一式三份进行。利用酶标仪测量490nm处的紫外吸收，基于以下等式计算细胞活力：细胞毒性(％)＝(实验组的平均吸光度/对照组的吸光度)×100％。

[0106] 结果见图11、图12、图13、图14和图15，在低浓度探针下细胞存活率可高达90％以上，探针几乎没有细胞毒性。

[0107] (6)检测HClO的荧光探针对4T1细胞、MCF‑7细胞、MDA‑MB‑231细胞、LX‑2细胞、HepG2细胞内HClO的检测性能测试

[0108] 细胞成像前，用0.2％(w/v)胰蛋白酶‑EDTA溶液将贴壁细胞分离，并分散至细胞培养基中，然后将细胞悬浮液转移至共聚焦皿中让其贴皿底部生长。为了研究探针BTHCl检测细胞外源性HClO的能力，先孵育探针BTHCl(10μM，0.5h)后，然后孵育不同浓度HClO(0μM、5μM、10μM、30μM，50μM，0.5h)，用PBS洗涤3次后，进行共聚焦成像。Control为不加入探针BTHCl和HClO；BTHCl为只加入探针BTHCl，不加入HClO。

[0109] 结果如图16所示，细胞先孵育探针后，细胞几乎观察不到荧光，而随着加入HClO的浓度增加，细胞内的荧光逐渐增强。该结果也表明，本发明的荧光探针具有检测不同细胞内HClO的良好应用前景。

[0110] (7)检测HClO的荧光探针对斑马鱼活体内HClO的检测性能测试

[0111] 首先将斑马鱼平行分组，第一组斑马鱼作为对照实验(Control，不加入探针BTHCl和HClO)；第二组斑马鱼用探针BTHCl(10μM，0.5h)孵育；第三组斑马鱼用HClO(100μM，0.5h)孵育后，再用BTHCl(10μM，0.5h)孵育；第四组斑马鱼用LPS(1μg/mL，16h)和PMA(1μg/mL)孵育后，再用BTHCl(10μM，0.5h)孵育；第五组斑马鱼用LPS(1μg/mL，16h)和PMA(1μg/mL)孵育后，再用NAC(1mM，2h)孵育，最后再用BTHCl(10μM，0.5h)孵育。LPS和PMA为次氯酸诱导剂；
NAC为次氯酸抑制剂。

[0112] 如图17所示，仅使用探针孵育的斑马鱼几乎没有显示出荧光。然而，用HClO或PMA+LPS孵育斑马鱼后，再用探针孵育斑马鱼，斑马鱼有明亮的荧光信号显现。由此说明探针可以快速地原位监测斑马鱼活体内源性HClO的产生。

[0113] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的
一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一
致的最宽的范围。