[0001] 本发明属于肥料制备领域，具体涉及一种促进作物生长的氨基酸肥料。

[0002] 近年来，全球蛋白质短缺已经成为越来越急迫的世界性难题，世界鱼粉产量也因近海污染、过度捕捞、休渔期延长等原因而急剧下滑，寻求新型蛋白质来源是一个目前亟待发展的研究领域。昆虫蛋白是以昆虫的卵、幼虫、蛹和成虫等为原料加工成的一种蛋白质原料，其具有蛋白质含量丰富、氨基酸比例均衡等优势，有成为新型饲料蛋白质资源的潜力，能够缓解当下蛋白质原料不足的现状。因此，越来越多的研究致力于昆虫蛋白生产工艺的开发。

[0003] 专利CN 118020864A公开了一种替代鱼粉的蛋白饲料及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：(1)黑水虻幼虫粉碎，向其中加入氮源、碳源、尿素、磷酸氢钙，混合均匀得混合原料；(2)制备酵母发酵液，向发酵液中加入复合酶制剂，搅拌均匀得混合发酵液；(3)将混合发酵液接种到混合原料中进固体发酵，发酵结束后烘干，得到替代鱼粉的蛋白饲料，该蛋白饲料与鱼粉具有相似营养成分，蛋白消化率能够完全替代进口鱼粉，能够促进动物生长。专利CN 116725124A公开了一种含五谷虫、蚕蛹、蜂蛹的昆虫蛋白粉及制备工艺，所述含五谷虫、蚕蛹、蜂蛹的昆虫蛋白粉中包括比例为3：3：3：1的五谷虫、蚕蛹、蜂蛹和辅料，该昆虫蛋白粉不用进行提取，减少了昆虫蛋白提取时的浪费，提高了昆虫蛋白的利用率。

[0004] 白星花金龟是鞘翅目金龟甲科昆虫，广泛分布于中国及周边国家，它分幼虫和成虫两个生长阶段。在成虫期它是一种重要的农业害虫，然而其幼虫不会危害作物，且可以将农业废弃物转化为优质的昆虫蛋白与脂肪。但目前对于将白星花金龟作为原料制成蛋白粉的相关研究较少。此外，由于中国近年来对环境保护越来越重视、农业进入绿色发展阶段，对于农业中所用到的化肥、农药等的环保性要求更高，需尽快构建国家绿色肥料体系，包括绿色原料、绿色制造、绿色产品、绿色流通和绿色施用。

[0005] 因此，研发一种以白星花金龟为原料制成昆虫蛋白，并将其运用于环保型肥料中，对于农业的绿色、高质量发展具有重要意义。

[0051] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0052] 为了更好的说明本发明的具体实施方式，下面通过实施例做进一步的举例说明。

[0053] 以下实施例中所述的质量份数可以是克、千克、吨或其它质量单位。

[0054] 本发明中所用白星花金龟虫体为白星花金龟幼虫；所用胰蛋白胨、PDA斜面培养基和LB平板培养基均购自广东环凯微生物科技有限公司；所用碱性蛋白酶的酶活为200000U/g，均购自上海源叶生物科技有限公司；所用米曲霉为米曲霉CICC 40214、植物乳植物杆菌为植物乳植物杆菌CICC 10345；所用壳聚糖为壳寡糖(Mn<10000)，购自南通绿神生物工程有限公司；所用变形假单胞菌为变形假单胞菌CICC 22994。

[0055] 制备例1

[0056] 米曲霉的驯化：

[0057] 在无菌环境下，将保存的米曲霉母种在PDA斜面培养基上接种1块0.5cm×0.5cm的菌块，于37℃条件下培养至菌丝走满，得到活化后的米曲霉；

[0058] S1：挑取活化后的米曲霉接种到灭菌后、pH为6、含有3wt％复合白星花金龟粉末的500mL无机盐液体培养基中，在37℃、150r/min振荡的条件下培养7天，得到米曲霉一次驯化液；

[0059] S2：将1mL步骤S1的米曲霉一次驯化液接种到灭菌后、pH为6、含有8wt％复合白星花金龟粉末的500mL无机盐液体培养基中，在37℃、振荡的条件下培养7天，得到米曲霉二次驯化液；

[0060] S3：将1mL步骤S2的米曲霉二次驯化液接种到灭菌后、pH为6、含有15wt％复合白星花金龟粉末的500mL无机盐液体培养基中，在37℃、振荡的条件下培养7天，得到米曲霉三次驯化液；

[0061] S4：取100μL步骤S3的米曲霉三次驯化液在PDA平板培养基上进行涂布，在37℃下培养3天，得到驯化后的米曲霉。

[0062] 制备例2

[0063] 植物乳植物杆菌的驯化：

[0064] 在无菌环境下，从保存的植物乳植物杆菌菌株甘油管吸取100μL菌液，采用平板划线法均匀涂在LB平板培养基上，于37℃条件下倒置培养至菌落长出，得到活化后的植物乳植物杆菌；

[0065] S1：挑取活化后的植物乳植物杆菌接种到灭菌后、pH为6.5、含有3wt％复合白星花金龟粉末的无机盐液体培养基中，在37℃、振荡的条件下培养7天，得到植物乳植物杆菌一次驯化液；

[0066] S2：将1mL步骤S1的植物乳植物杆菌一次驯化液接种到灭菌后、pH为6.5、含有8wt％复合白星花金龟粉末的无机盐液体培养基中，在37℃、振荡的条件下培养7天，得到植物乳植物杆菌二次驯化液；

[0067] S3：将1mL步骤S2的植物乳植物杆菌二次驯化液分别接种到灭菌后、pH为6.5、含有15wt％复合白星花金龟粉末的无机盐液体培养基中，在37℃、振荡的条件下培养7天，得到植物乳植物杆菌三次驯化液；

[0068] S4：取100μL步骤S3的植物乳植物杆菌三次驯化液在LB平板培养基上进行涂布，在37℃下培养1天，得到驯化后的植物乳植物杆菌。

[0069] 制备例3

[0070] 驯化后的米曲霉种子液的制备：

[0071] 在无菌环境下，将制备例1中驯化后的米曲霉接种到500mL马铃薯培养基中，于37℃条件下振荡培养3天后，在5000r/min下离心分离，得到菌体，用无菌水稀释菌体至6×8
10CFU/mL，得到驯化后的米曲霉种子液。

[0072] 制备例4

[0073] 驯化后的植物乳植物杆菌种子液的制备：

[0074] 在无菌环境下，将制备例2中驯化后的植物乳植物杆菌接种到500mL液体培养基中，于37℃条件下振荡培养1天后，在5000r/min下离心分离，得到菌体，用无菌水稀释菌体8
至6×10CFU/mL，得到驯化后的植物乳植物杆菌种子液。

[0075] 其中，制备例1、2中所用无机盐液体培养基的制备步骤为：将(NH4)2SO42g，Na2HPO4·12H2O 2g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO40.5g，微量元素液0.5mL和维生素液0.5mL溶解于500mL去离子水中，调节pH＝7，在120℃下灭菌20min后，自然冷却至室温，得到无机盐液体培养基；

[0076] 微量元素液配方：CaCl225mg，MnCl4·4H2O 5mg，去离子水1L；

[0077] 维生素液配方：核黄素200mg，对氨基苯甲酸200mg，盐酸硫胺素400mg，烟酸400mg，盐酸吡哆醇400mg，泛酸钙400mg，叶酸2mg，生物素2mg，肌醇2000mg，去离子水1L。

[0078] 制备例3中所用马铃薯培养基的制备步骤为：将马铃薯去皮，切成约1cm3的小块，取100g马铃薯小块放入500mL的去离子水中煮沸30min，用双层纱布过滤，向滤液中加入10g葡萄糖，再补充去离子水至500mL，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为7后，在120℃下灭菌20min，自然冷却至室温，得到马铃薯培养基；

[0079] 制备例4中所用液体培养基的制备步骤为：取5g酵母粉、10g胰蛋白胨和10gNaCl溶于1L去离子水中，于121℃下灭菌20min，自然冷却至室温，得到液体培养基。

[0080] 制备例5

[0081] 虫体小分子蛋白浆的制备步骤为：

[0082] (1)取干燥、粉碎至20目的400g白星花金龟虫体和10g香蕉皮混合均匀，在120℃下灭菌20min，得到复合白星花金龟粉末；

[0083] (2)向步骤(1)的复合白星花金龟粉末加入2050g纯水，再加入4.1g碱性蛋白酶，搅拌均匀，将pH调节至9后，在45℃下酶解5h，在100℃下灭酶15min，得到白星花金龟酶解液；

[0084] (3)将步骤(2)的白星花金龟酶解液pH调节为6，再向其中接种3wt％的混菌种子液，在37℃下振荡培养3天，得到虫体小分子蛋白浆。

[0085] 所用混菌种子液由质量比为1.5:1的制备例3驯化后的米曲霉种子液和制备例4驯化后的植物乳植物杆菌种子液组成。

[0086] 制备例6

[0087] 变形假单胞菌种子液的制备：

[0088] (1)在无菌环境下，从保存的变形假单胞菌菌株的甘油管吸取100μL菌液，采用平板划线法均匀涂在LB平板培养基上，于37℃条件下倒置培养至菌落长出，得到活化后的变形假单胞菌；

[0089] (2)在无菌环境下，将活化后的变形假单胞菌接种到500mL LB液体培养基中，于37℃条件下振荡培养14h后，在5000r/min下离心分离，得到菌体，用无菌水稀释菌体至5×7
10CFU/mL，得到变形假单胞菌种子液。

[0090] 制备例7

[0091] 生物发酵提取物的制备步骤为：

[0092] 取0.8kg制备例6得到的变形假单胞菌种子液接种于10kg特定发酵培养基中，在25℃、有氧环境下，发酵培养4天，于4℃下以5000r/min的转速离心10min，将得到的上清液于50℃下烘干，得到生物发酵提取物。

[0093] 所用特定发酵培养基的制备：将8g蛋白胨、4g牛肉浸粉、7g氯化钠、1.5g磷酸氢二钾、7mg一水合硫酸锰、80g壳聚糖、15g甘油、0.5g阿拉伯糖和5g甲醇，溶于1L去离子水，调节pH为7.5，得到特定发酵培养基。

[0094] 制备例8

[0095] 生物发酵提取物的制备步骤与制备例7相同，区别在于所用特定发酵培养基中甘油的添加量为30g。

[0096] 制备例9

[0097] 生物发酵提取物的制备步骤与制备例7相同，区别在于所用特定发酵培养基中阿拉伯糖的添加量为1.5g。

[0098] 制备例10

[0099] 生物发酵提取物的制备步骤与制备例7相同，区别在于所用特定发酵培养基中甲醇的添加量为10g。

[0100] 制备例11

[0101] 生物发酵提取物的制备步骤与制备例7相同，区别在于所用特定发酵培养基中未加入甘油。

[0102] 制备例12

[0103] 生物发酵提取物的制备步骤与制备例7相同，区别在于所用特定发酵培养基中未加入阿拉伯糖。

[0104] 制备例13

[0105] 生物发酵提取物的制备步骤与制备例7相同，区别在于所用特定发酵培养基中未加入甲醇。

[0106] 制备例14

[0107] 生物发酵提取物的制备步骤与制备例7相同，区别在于变形假单胞菌种子液的接种量为1.2kg。

[0108] 制备例15

[0109] 生物发酵提取物的制备步骤与制备例7相同，区别在于所用特定发酵培养基中未加入甘油、阿拉伯糖和甲醇。

[0110] 实施例1

[0111] 一种促进作物生长的氨基酸肥料，按照质量份计，包括以下原料：

[0112] 虫体小分子蛋白浆700份、磷酸二氢钾45份、尿素100份、微量元素20份、生物发酵提取物10份。

[0113] 所用虫体小分子蛋白浆由制备例5得到；所用生物发酵提取物由制备例7得到。

[0114] 实施例2

[0115] 一种促进作物生长的氨基酸肥料，按照质量份计，包括以下原料：

[0116] 虫体小分子蛋白浆850份、磷酸二氢钾55份、尿素120份、微量元素40份、生物发酵提取物20份。

[0117] 所用虫体小分子蛋白浆由制备例5得到；所用生物发酵提取物由制备例7得到。

[0118] 实施例3

[0119] 一种促进作物生长的氨基酸肥料，按照质量份计，包括以下原料：

[0120] 虫体小分子蛋白浆800份、磷酸二氢钾50份、尿素110份、微量元素30份、生物发酵提取物15份。

[0121] 所用虫体小分子蛋白浆由制备例5得到；所用生物发酵提取物由制备例7得到。

[0122] 实施例4

[0123] 一种促进作物生长的氨基酸肥料，按照质量份计，包括以下原料：

[0124] 虫体小分子蛋白浆750份、磷酸二氢钾48份、尿素105份、微量元素25份、生物发酵提取物18份。

[0125] 所用虫体小分子蛋白浆由制备例5得到；所用生物发酵提取物由制备例7得到。

[0126] 实施例5

[0127] 一种促进作物生长的氨基酸肥料，按照质量份计，包括以下原料：

[0128] 虫体小分子蛋白浆780份、磷酸二氢钾52份、尿素115份、微量元素35份、生物发酵提取物13份。

[0129] 所用虫体小分子蛋白浆由制备例5得到；所用生物发酵提取物由制备例7得到。

[0130] 对比例1

[0131] 一种促进作物生长的氨基酸肥料，按照质量份计，包括以下原料：

[0132] 虫体小分子蛋白浆780份、磷酸二氢钾52份、尿素115份、微量元素35份。

[0133] 所用虫体小分子蛋白浆由制备例5得到。

[0134] 实施例1‑5和对比例1中所述微量元素由质量比为1:1:1:1的氯化铁、硼镁肥、硫酸锌和硫酸铜混合均匀得到。

[0135] 性能测试

[0136] 1、虫体小分子蛋白浆的性能测试

[0137] 将制备例5中制备得到的虫体小分子蛋白浆送往广东省微生物分析检测中心粗蛋白含量测试，粗蛋白含量测试方法参照GB/T 6432‑2018(7.2)。分析结果表明，制备例5中虫体小分子蛋白浆的粗蛋白含量为16.24％。

[0138] 再将制备例5中制备得到的虫体小分子蛋白浆在广东省微生物分析检测中心进行氨基酸含量测试，氨基酸含量测试方法参照GB/T 18246‑2019，氨基酸含量测试的具体测试结果见表1。

[0139] 表1

[0140]

[0141] 由表1可知，制备例5中得到的虫体小分子蛋白浆中各氨基酸含量均较高。

[0142] 2、生物发酵提取物的性能测试

[0143] 对制备例7‑15得到的生物发酵提取物进行以下测试：

[0144] 2.1氨基寡糖素的含量测试：

[0145] 参考邓晓娇，颜聪，薛建强，等《. 一种测定农药氨基寡糖素含量的高效液相色谱方法》，DOI:10.16201/j.cnki.cn10‑1660/tq.2023.11.07.中的方法测定生物发酵提取物中氨基寡糖素的含量。

[0146] 2.2鼠李糖脂的含量测试：

[0147] 硫酸‑苔黑酚法测定鼠李糖脂含量：使用53wt％的浓硫酸溶解苔黑酚，使苔黑酚溶液的终浓度为0.19％，再用超纯水配制50、100、200、300、400、500mg/L不同浓度的鼠李糖溶液，按照1:9的体积比与苔黑酚溶液反应。在80℃下加热30min后，室温静置15min，然后在421nm处测量吸光度。再以鼠李糖浓度为横坐标，OD421吸光值为纵坐标制作鼠李糖脂标准曲线。

[0148] 再分别取0.1g制备例7‑15中得到的生物发酵提取物，用超纯水配制成100mg/L的样品溶液，按照上述方法与苔黑酚溶液反应后，测量421nm处的吸光度值，将其带入鼠李糖脂标准曲线中，计算出生物发酵提取物中的鼠李糖脂含量。

[0149] 具体测试数据见表2。

[0150] 表2

[0151]编号 氨基寡糖素含量(％) 鼠李糖脂含量(％)
制备例7 75.3 8.5
制备例8 70.2 5.3
制备例9 68.5 4.7
制备例10 66.9 5.0
制备例11 60.4 3.3
制备例12 58.8 3.9
制备例14 72.5 7.2
制备例15 50.6 2.6

[0152] 由表3可知，制备例7中得到的生物发酵提取物含有较多的氨基寡糖素和鼠李糖脂。相比于制备例7，制备例8‑10中分别改变了甘油、阿拉伯糖和甲醇的其中一种物质的添加量，对变形假单胞菌的诱导作用减弱，氨基寡糖素和鼠李糖脂的分泌量降低；制备例11‑13中缺少了甘油、阿拉伯糖和甲醇中的其中一种物质、制备例15中未加入甘油、阿拉伯糖和甲醇，均会导致变形假单胞菌对氨基寡糖素和鼠李糖脂的分泌量显著降低；制备例14中变形假单胞菌的接种量增多，特定发酵培养基中的营养物质有限，产生竞争性抑制，变形假单胞菌对壳聚糖的降解作用减弱，氨基寡糖素和鼠李糖脂的含量均降低。

[0153] 由表3可知，将制备例7中得到的生物发酵提取物应用于氨基酸肥料中。

[0154] 3、氨基酸肥料的性能测试

[0155] 将实施例3和对比例1中的原料分别混合后得到的氨基酸肥料进行作物促生长实验。

[0156] 3.1材料与方法

[0157] (1)试验地点：铁门关经济技术开发区化工园区附近农田；

[0158] (2)试验作物：番茄(粉红D‑80)，2023年5月10日育苗，2023年7月1日定植，4000株/亩，2023年8月10日至2023年9月30日采收；

[0159] (3)试验设计：试验设四个处理，各处理3次重复，随机区组排列，每个小区面积50平米，呈长方形，设保护行，试验处理设计如下：

[0160] 处理1：基础施肥+叶面喷施实施例3的氨基氨酸肥料；

[0161] 处理2：基础施肥+叶面喷施对比例1制备的对照肥料；

[0162] 处理3(空白对照)：基础施肥+叶面喷施等量清水；

[0163] 基础施肥包括：2500kg/亩优质腐熟有机肥(本公司产品)，30kg/亩过磷酸钙，20kg/亩硫酸钾，10kg/亩尿素；

[0164] (4)施用方法：处理1、2中氨基酸肥料的施用方法为：将氨基酸肥料的600倍稀释液分别于2023年7月15日起每月1日和15日对番茄叶面喷施一次，每次用量为0.8L/亩；处理3中，清水喷施，次数、用量与其他处理一致。

[0165] 3.2测试结果

[0166] 通过测量以下数据，分析各处理的番茄生物学性状

[0167] (1)叶片厚度和叶绿素含量：2023年7月30日，每个处理随机选取10株，每株选取中部位置的6个叶片测量叶片厚度和叶绿素含量求平均值，其中，叶片厚度采用叶片厚度测定仪测量，叶绿素含量采用叶绿素测定仪测量。

[0168] (2)果数和单果重：每个处理随机选取10株，统计采收期内的果数以及果重，计算单株总果数以及平均果重。

[0169] 具体测量结果见表4。

[0170] 表4

[0171]

[0172] 由表4可以看出，相比于处理2、3，处理1中所用的氨基酸肥料能够显著提高叶片的厚度和叶绿素含量，提高番茄果实的品质，这是由于实施例3中的氨基酸肥料中既含有作物生长的各种营养成分，又含有氨基寡糖素和鼠李糖脂，能够杀死一部分有害病菌，提高作为对氨基酸肥料的吸收，促进作物的生长和结果。

[0173] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于技术方案的范围内。