[0001] 本发明涉及微生物组合物技术领域，具体涉及一种用生物质资源制备多层结构生物炭包埋微生物的微胶囊及其制备方法。

[0002] 生物炭是生物有机材料在缺氧及低氧环境中经热裂解后的固体产物，其主要的成分是碳分子，大多为粉状颗粒。生物炭是活性炭的生产原料之一，可制作成具有吸附性能的材料，可用于制备肥料缓释载体，延缓肥料养分在土壤中的释放，减少肥料损失，提高肥料利用率。生物炭还可作为土壤改良剂增加土壤肥力，增加土壤有机碳含量、增加土壤有机质 或腐殖酸含量，从而提高土壤的养分吸持容量及持水量，达到促进作物生长的效果；生物炭大多呈碱性，可以作为石灰替代物，通过提高土壤碱基饱和，降低可交换铝的水平，消耗土壤质子提高酸性土壤pH，达到改良土壤酸碱度的效果。

[0003] 20世纪90年代中期，发现生物炭可作为二氧化碳俘获和碳封存剂使用，可降低大气二氧化碳浓度，对全球气候具有调节作用。生物炭可能够吸附重金属、农药、除草剂及是由污染物等，降低植物吸收上述组分的概率达到净化土壤或者净化水体的目的。废弃生物质热裂解产生生物炭的过程中还可以获得混合气和生物油，制成氢气副产品，可用作氢能源、精炼生物油染料、合成氨等。鉴于生物炭的重要性，越来越多的生物炭用途被发现和应用。

[0004] 传统生物炭是采用土窑、砖窑或者钢制窑生产的，是隔绝氧气的闷燃烧的慢速裂解过程，特点是产率高、耗时长。而现代工业生产生物炭主要是在马弗炉等设备中高温快速裂解，特点是产率偏低、耗时短。不同应用场景对生物炭微结构的需求也不同，比如，吸附剂需要生物炭具有丰富的多孔微结构。为了克服上述生产生物炭过程中出现的问题，满足实际应用需求，生物炭的制备方法不停地被改进。

[0005] 由于生物炭的主要成分是碳分子，所以富含有机物的秸秆、粪便、食品加工废料、生活垃圾、污泥等均具有制备生物炭的潜力。目前，秸秆和食品加工废料多用作制备动物饲料，但是有一些生物资源中在富含碳元素的同时，还可能存在大量有油脂，比如食品加工废料，如果在饲料中大量添加，则容易产出高脂饲料，不利于动物的生长，所以需要寻求生物资源利用的新途径。

[0006] 而固定化微生物技术不仅有利于优势菌种的固定，提高难降解有机物的降解效率，还能在微生物装置内维持高浓度的生物量，易于固液分离，具有一定的优越性。目前用于制备固定化微生物的方法很多，主要有吸附法、共价结合法、胶联法、包埋法等。要完成微生物的固定化，关键是要选择一种合适的生物载体，这种载体应具有如下特点：（1）具有稳定的网状空隙结构，在一定PH值和温度下，不容易被破坏；
（2）能够控制固定化微生物颗粒的大小和孔隙度；
（3）固定化方法简单、易行，固定化条件尽可能温和；
（4）载体所使用的材料价廉易得，固定化成本低；
（5）在生化反应器内长时间运转过程中，固定化系统具有良好的机械稳定性和化学稳定性；
（6）载体对微生物来说是惰性的，不会损伤细胞；
（7）固定化系统使底物、产物和其他代谢产物能够自由扩散；
（8）单位体积的固定化系统拥有尽可能多的微生物，以便更好地起到生物催化作用。

[0007] 目前虽然有许多有关于载体的科研成果，但这些成果在有着比较好的工业应用效 果的同时，也存在着一定的问题，例如目前经过煅烧造粒的载体，成本过高，难以实现工业化应用，且同时由于是经过煅烧的载体，自身硬度比较大，不易溶解，难以达到稳定的微生物缓释效果。例如目前应用范围较广泛的PVA载体，本身有着很好的可塑性，且有着优良的微生物包埋效果与缓释效果，但是材料本身却容易污染环境。再例如目前同样应用较为广泛的由凹凸棒以及海藻酸钠等材料制备而成的载体，本身含水量过大，只能以液体保存的方式进行储存，储存运输成本过高，同样难以实现工业化。

[0017] 现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。

[0018] 实施例1

[0019] 一种生物炭基缓释型包埋微胶囊的制备方法，包括步骤一、制备生物炭粉：
取50kg废弃灵芝种植菇包散料，去除石子等杂质，烘干、粉碎，加入至石灰水池子中浸泡12个小时，石灰水质量分数为2%，即石灰水中氢氧化钙质量分数为2%，过滤，将滤渣烘干，置于惰性气体中的马弗炉中热裂解，温度为300℃，冷却至室温，取出物料洗涤至中性，烘干，粉碎至130目颗粒，得到生物炭粉；
步骤二、制备核心层颗粒：
分别称取以下材料：950g聚乳酸（PLA）、50g上述步骤一中制备的生物炭粉，将聚乳酸置于容器中，在加热器上加热至溶化为液态，将生物炭粉加入聚乳酸溶液中，并不断搅拌，降温后，加入红平红球菌，使红平红球菌和生物炭粉均匀分布于聚乳酸溶液中，当溶液无气泡时，将溶液输入至胶囊机中，制成直径1‑2mm的胶囊颗粒，用水洗涤至中性后，室温干燥，得到含有红平红球菌的核心层颗粒；
步骤三、制备包埋固定层颗粒：
配置几丁质溶液，称取25.0g壳聚糖粉溶解于1L醋酸溶液中，醋酸溶液浓度为
0.1mol/L，制得几丁质溶液，取300g步骤二所得的核心颗粒，加入到配置好的900ml几丁质溶液中，加热搅拌混合均匀，得核心层几丁质溶液，向得核心层几丁质溶液中滴入2L浓度为
1mol/L的氢氧化钠溶液中，经离子交换凝胶法得到包埋固定层颗粒；
步骤四、制备生物炭多级包埋缓释胶囊：
包埋固定层颗粒表面浸涂，将浸涂层包裹在包埋固定层颗粒外，形成生物炭多级包埋缓释胶囊，其方法为，称取30g琼脂粉溶解于1L蒸馏水中，配置质量分数为3%的水琼脂，将步骤三所得的包埋固定层颗粒加入水琼脂之中，充分搅拌，待水琼脂凝固，经水洗、烘干后，得到含有红平红球菌的生物炭多级包埋缓释胶囊。

[0020] 实验验证：

[0021] 一、含有红平红球菌核心层颗粒降解半衰期验证：取5kg被石油烃污染过的土壤，将步骤二制得的含有红平红球菌核心层颗粒均匀撒入土壤之中，并每隔24h向土壤喷洒水保持其湿润环境，以保证红平红球菌生命活动，保持其环境在pH为8.0，温度在30℃，经红平红球菌生物炭包埋聚乳酸处理后，发现在261mg/kg单位时，降解半衰期在9天左右；
二、含有含有红平红球菌的生物炭多级包埋缓释胶囊的半衰期验证：
取5kg被多氯联苯污染过的土壤，将步骤四制得的含有红平红球菌的生物炭多级包埋缓释胶囊均匀撒入土壤之中，并每隔24h向土壤喷洒水保持其湿润环境，以保证芽孢杆菌生命活动，保持其环境在pH为8.0，温度在30℃，经红平红球菌生物炭包埋胶囊处理后，发现在261mg/kg单位时，最佳降解的半衰期为3天，这是由于经过多级包埋之后，保证了红平红球菌的存活，提高了红平红球菌存活率，进而提高了降解率。

[0022] 实施例2

[0023] 一种生物炭基缓释型包埋微胶囊的制备方法，具体实施步骤如下：步骤一、制备生物炭粉：
从竹园中取50kg废弃竹节烘干、粉碎，加入至石灰水池子中浸泡12个小时，石灰水质量分数为2%，即石灰水中氢氧化钙质量分数为2%，过滤，将滤渣烘干，置于惰性气体中的马弗炉中热裂解，温度为300℃，冷却至室温，取出物料洗涤至中性，烘干，粉碎至230目颗粒，得到生物炭粉；
步骤二、制备核心层颗粒：
分别称取以下材料：950g聚乳酸（PLA）、50g上述步骤一中制备的230目生物炭粉将聚乳酸置于容器中，在加热器上加热至溶化为液态，将生物炭粉加入聚乳酸溶液中，降温后，加入双歧杆菌，并不断搅拌，使生物炭粉、双歧杆菌均匀分布于聚乳酸溶液中，当溶液无气泡时，将溶液输入至胶囊机中，制成直径1‑2mm的胶囊颗粒，用水洗涤至中性后，室温干燥，得到核心层颗粒；
步骤三、制备包埋固定层颗粒：
将核心层颗粒包覆于凝胶固定化溶液中，制成包埋固定层颗粒，配置几丁质溶液，称取25.0g壳聚糖粉溶解于1L醋酸溶液中，醋酸溶液浓度为0.1mol/L，得几丁质溶液，取步
300g骤二所得的核心层颗粒，加入到配置好的900ml几丁质溶液中，加热搅拌混合均匀，得核心层几丁质溶液，向核心层几丁质溶液中滴入2L浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液中，经离子交换凝胶法得到包埋固定层颗粒；
步骤四、制备生物炭多级包埋缓释胶囊：
包埋固定层颗粒表面浸涂，将浸涂层包裹在包埋固定层颗粒外，形成生物炭多级包埋缓释胶囊，其方法为，称取30g琼脂粉溶解于1L蒸馏水中，配置质量分数为3%的水琼脂，将步骤三所得的包埋固定层颗粒加入水琼脂之中，充分搅拌，待水琼脂凝固，然后经水洗、烘干后，得到生物炭多级包埋缓释胶囊。

[0024] 具体地，为了实验观察，在步骤二制备核心层颗粒时，加入双岐菌的同时，加入50ml结晶紫混合物，其中结晶紫混合物为试验验证缓释速率过程中，作为显色指示剂，以观察试验变化情况，实际生产中可不加结晶紫溶液。

[0025] 实验验证：酸性环境下核心层颗粒的缓释速率验证：
配置1L稀盐酸溶液，pH为2，模拟胃内胃酸pH的环境，加入本实施例中步骤二制得的核心层颗粒，观察其指示颜色，1min后溶液变紫，经检测其缓释速率为0.058ug/min。

[0026] 酸性环境下包埋固定层颗粒的缓释速率验证：配置1L稀盐酸溶液，pH为2，模拟胃内胃酸pH的环境，加入本实施例中步骤四制得的多级包埋缓释胶囊，观察其指示颜色，4min后溶液变紫，经检测其缓释速率为0.011ug/min，缓释速率延缓近五倍。

[0027] 三、碱性环境下核心层颗粒的缓释速率验证：配置1L碳酸氢钠溶液，pH为8，模拟人体口腔内的pH环境，加入本实施例中步骤二制得的核心层颗粒，观察其指示颜色，2min后溶液变紫，经检测后其缓释速率为0.041ug/min；
四、碱性环境下包埋固定层颗粒的缓释速率验证：
配置1L碳酸氢钠溶液，pH为8，模拟人体口腔内的pH环境，加入本实施例中步骤四制得的多级包埋缓释胶囊，观察其指示颜色，5min后溶液变紫，经检测其缓释速率为
0.0082ug/min，缓释速率延缓近五倍。

[0028] 实施例3

[0029] 步骤一、制备生物炭粉：从稻田中取50kg秸秆烘干、粉碎，加入至石灰水池子中浸泡12个小时，石灰水质量分数为2%，过滤，将滤渣烘干，置于惰性气体中的马弗炉中热裂解，温度为300℃，冷却至室温，取出物料洗涤至中性，烘干，粉碎至200目颗粒，得到生物炭粉；
步骤二、制备核心层颗粒：
分别称取以下材料：950g聚乳酸（PLA）、50g上述步骤一中制备的200目生物炭粉，将聚乳酸置于容器中，在加热器上加热至溶化为液态，将生物炭粉加入聚乳酸溶液中，并不断搅拌，加入芽孢杆菌冻干粉，使芽孢杆菌生物炭粉均匀分布于聚乳酸溶液中，当溶液无气泡时，将溶液输入至胶囊机中，制成直径1‑2mm的胶囊颗粒，用水洗涤至中性后，室温干燥，得到含有芽孢杆菌的核心层颗粒；
步骤三、制备包埋固定层颗粒：
配置几丁质溶液，称取25.0g壳聚糖粉溶解于1L醋酸溶液中，醋酸溶液浓度为
0.1mol/L，制得几丁质溶液，取300g步骤二所得的核心颗粒，加入到配置好的900ml几丁质溶液中，加热搅拌混合均匀，得核心层几丁质溶液，向核心层几丁质溶液中滴入2L浓度为
1mol/L的氢氧化钠溶液中，经离子交换凝胶法得到包埋固定层颗粒；
步骤四、制备生物炭多级包埋缓释胶囊：
包埋固定层颗粒表面浸涂，将浸涂层包裹在包埋固定层颗粒外，形成生物炭多级包埋缓释胶囊，其方法为，称取30g琼脂粉溶解于1L蒸馏水中，配置质量分数为3%的水琼脂，将步骤三所得的包埋固定层颗粒加入水琼脂之中，充分搅拌，待水琼脂凝固，经水洗、烘干后，得到含有芽孢杆菌的生物炭多级包埋缓释胶囊。

[0030] 实验验证：

[0031] 含有芽孢杆菌核心层颗粒降解半衰期验证：取5kg被多氯联苯污染过的土壤，将步骤二制得的含有芽孢杆菌核心层颗粒均匀撒入土壤之中，并每隔24h向土壤喷洒水保持其湿润环境，以保证芽孢杆菌生命活动，保持其环境在pH为7，温度在30℃，经芽孢杆菌生物炭包埋聚乳酸处理后，发现在10ppm单位时，降解半衰期在十天左右；
含有含有芽孢杆菌的生物炭多级包埋缓释胶囊的半衰期验证：
取5kg被多氯联苯污染过的土壤，将步骤四制得的含有芽孢杆菌的生物炭多级包埋缓释胶囊均匀撒入土壤之中，并每隔24h向土壤喷洒水保持其湿润环境，以保证芽孢杆菌生命活动，保持其环境在pH为7，温度在30℃，经芽孢杆菌生物炭包埋胶囊处理后，发现在
10ppm单位时，最佳降解的半衰期为2天，这是由于经过多级包埋之后，保证了芽孢杆菌的存活，提高了芽孢杆菌存活率，进而提高了降解率。

[0032] 本发明不局限于所述实施方式，任何人应得知在本发明的启示下作出的结构变化，凡是与本发明具有相同或相近的技术方案，均落入本发明的保护范围之内。

[0033] 本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。