[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及浓缩血小板制品、生产工艺、血小板保存液及储存方法。

[0002] 血小板(blood platelet，PLT)是血液主成份之一，主要功能是凝血和止血，修补破损的血管。PLT是巨核细胞成熟后脱颗粒释放到血液中的血细胞，形状多样不规则，直径1～4μm到7～8μm不等，且个体差异很大(5～12立方微米)，无细胞核。PLT在血液中是与其他细胞混合存在的，常成群分布在红细胞之间。根据《全血及成分血质量要求》(GB 18469)中9
对浓缩血小板质量要求红细胞混入量必须≤2.0×10个(来源于400mL全血)，传统制备浓缩血小板为了达到要求，会降低血小板收率，因此研究高纯度、高收率分离制备血小板工艺非常必要。

[0003] 目前国内绝大部分血站使用的浓缩血小板制品是用血浆保存，血浆中含有抗原、抗体、凝血酶等异体蛋白。在输血过程中常会引起患者引发发热、过敏等变态反应，因此，进一步研究可替代血浆使用的血小板保存液是极其必要的。

[0030] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

[0031] 实施例1：

[0032] 如图1所示，本申请提供的浓缩血小板制品生产工艺包括如下步骤：

[0033] S1：取新鲜抗凝全血并振摇解聚；

[0034] 其中，振摇解聚是在20‑24℃条件下进行，持续时间20‑40min。无菌新鲜抗凝全血，可以是采集人或动物的静脉血并加入抗凝剂得到，抗凝剂可选择市售的柠檬酸‑柠檬酸钠防凝液，或肝素等。

[0035] S2：对振摇解聚后的新鲜抗凝全血进行轻离心，得到上层富血小板血浆Ⅰ和下层血细胞Ⅰ；

[0036] 其中，轻离心的具体条件可以为：150‑250g，15‑20min。轻离心条件下，能有效地将尽量多血小板保留在血浆中，又能将红细胞、淋巴细胞等其它血细胞进行分离。

[0037] S3：对下层血细胞Ⅰ进行梯度离心，得到含白膜层、血浆及少量红细胞的上层及下层红细胞Ⅱ。

[0038] 其中，梯度离心的条件可以为：440‑470g，6‑8min；2400‑2700g，4‑6min。

[0039] 具体地，对血细胞进行第一阶段的离心的具体条件为：440‑470g，8‑6min，第一阶段的离心是为了将血小板与红细胞进行初步分离；对血细胞进行2400‑2700g第二阶段的离心，离心时间为6‑8min，可使被初步分离的红细胞迅速沉降，减少血小板损失。

[0040] 本申请人发现，这一步骤如果使用非梯度离心，血小板容易与红细胞共沉降，当离心力较低时，则无法有效去除红细胞，离心力较高时，则血小板损失较多。

[0041] S4：对所述含白膜层、血浆及少量红细胞的上层进行梯度离心，得到富血小板血浆Ⅱ和和下层红细胞Ⅲ。

[0042] 其中，梯度离心的条件可以为：260‑320g，5‑7min；450‑500g，5‑7min。

[0043] 第一阶段的离心条件为260‑320g，5‑7min，是为使红细胞与白膜层温和分离。第二阶段的离心条件为450‑500g，5‑7min，目的是有效去除红细胞。梯度离心条件下，白膜层的成分能够较好地维持在上层。

[0044] 本申请人发现，S4这一步骤如果使用非梯度离心，会使白膜层与红细胞一起下沉，导致血小板大量损失。

[0045] S5：将富血小板血浆Ⅰ和富血小板血浆Ⅱ合并后得到混合富血小板血浆Ⅰ，用于下一步离心。

[0046] S6：对混合富血小板血浆Ⅰ进行离心，得到混合富血小板血浆Ⅱ和红细胞。

[0047] 其中，离心的条件可以为：350‑430g，5‑7min。这一步骤是为了将混合富血小板血浆Ⅰ中的红细胞去除。

[0048] S7：对上层混合富血小板血浆Ⅱ进行离心，得到上层血浆和下层血小板Ⅴ。

[0049] 其中，离心的条件可以为：2250‑2750g，15‑20min。

[0050] S8：向血小板V加入一定量血浆或血小板保存液后，即得浓缩血小板制品。浓缩血小板制品的合适浓度为：800‑1400E9/L。

[0051] 可选地，在步骤S8之前可以预先制备血小板保存液，本申请提供的血小板保存液的成分和浓度为：氯化钠75‑85mmol/L、氯化钾4‑5mmol/L、氯化镁1‑3mmol/L、醋酸钠20‑24mmol/L、氯化钙1‑2mmol/L、柠檬酸3‑5mmol/L、碳酸氢钠43‑46mmol/L、葡萄糖12‑16mmol/L、柠檬酸钠9‑11mmol/L、海藻糖5‑15mmol/L。血小板保存液的pH值为7.2～7.4。本申请提供的血小板保存液能有效维持血小板稳定性，提高血小板质量和减轻保存期损伤，可以替代传统血浆保存血小板。制备血小板保存液的方法为：根据血小板保存液的成分和浓度称量各个组分，分别混合均匀后使用一定量注射用水溶解，随后分装并使用高压蒸汽灭菌，冷却后备用。

[0052] 本申请还提供上述工艺制得的血小板存储方法，将一定量的血小板与一定体积的血小板保存液混合，保存于22±2℃的恒温振荡箱中，可将血小板储存3‑7天仍保持较好活力。

[0053] 实施例2：

[0054] 1、制备血小板保存液

[0055] 本发明的血小板保存液pH值7.2～7.4，具体组分如下表1所示。

[0056] 按下表分三个批次配比称量各个组分，分别混合均匀后使用注射用水溶解定容至1000mL，随后分装并使用高压蒸汽灭菌，冷却后备用。

[0057] 表1血小板保存液配比组分表

[0058]

[0059] 2、离心提取血小板工艺对比

[0060] 参见图1，取猪的无菌新鲜抗凝全血400mL置于22℃温度条件下振摇解聚血小板30min，振摇结束后对全血进行取样、计重。200g，20min轻离心后得到上层富血小板血浆Ⅰ和下层血细胞Ⅰ；对下层血细胞Ⅰ进行梯度离心：460g，6min；2650g，4min，得到含白膜层、血浆及少量红细胞的上层及下层红细胞Ⅱ；保留离心后得到的含白膜层、血浆及少量红细胞的上层，下层红细胞Ⅱ可以另作红细胞制备工艺原料。将得到的含白膜层、血浆及少量红细胞的上层再次梯度离心：290g，6min；460g，5min，得到上层富血小板血浆Ⅱ和下层红细胞Ⅲ，除去离心得到的下层红细胞Ⅲ，保留得到的上层富血小板血浆Ⅱ。通过无菌接管机将富血小板血浆Ⅰ和富血小板血浆Ⅱ合并为混合富血小板血浆Ⅰ并进行第二次离心：390g，5min，得到上层混合富血小板血浆Ⅱ和下层红细胞Ⅳ，保留得到的上层混合富血小板血浆Ⅱ，去除下层红细胞Ⅳ。将混合富血小板血浆Ⅱ在2500g，15min条件下离心后，得到上层血浆和下层血小板V。

[0061] 重复3次上述工艺提取血小板，在下层血小板V中分别加入等量体积血小板保存液保存，作为三个实施例组。重复3次传统离心工艺：150‑200g，20‑30min离心分离400mL猪的新鲜抗凝全血中的血小板，再在下层血小板V中分别加入等量体积血小板保存液保存，作为三个对比例组。实施例组和对比例组使用的血小板保存液体积相同，取样检测的结果如下表2所示：

[0062] 表2浓缩血小板制备工艺对比

[0063]

[0064] 注：血小板收率/％＝制备后体积*制备后血小板计数/(全血体积*全血血小板计数)

[0065] 结果表明，本发明实施例组制备浓缩血小板收率明显高于对比例组，且红细胞残余量、白蛋白残余量及血红蛋白量均远低于对比例组。说明用此工艺制备浓缩血小板收率高，纯度高。

[0066] 3、血浆与血小板保存液的保存血小板效果对比

[0067] 参见图1，取猪的无菌新鲜抗凝全血400mL置于22℃振摇解聚血小板30min，振摇结束后对全血进行取样、计重。200g，20min轻离心后得到上层富血小板血浆Ⅰ和下层血细胞Ⅰ；对下层血细胞Ⅰ进行梯度离心：460g，6min；2650g，4min，得到含白膜层、血浆及少量红细胞的上层及下层红细胞Ⅱ；保留离心后得到的含白膜层、血浆及少量红细胞的上层，下层红细胞Ⅱ可以另作红细胞制备工艺原料。将得到的含白膜层、血浆及少量红细胞的上层再次梯度离心：290g，6min；460g，5min，得到上层富血小板血浆Ⅱ和下层红细胞Ⅲ，除去离心得到的下层红细胞Ⅲ，保留得到的上层富血小板血浆Ⅱ。通过无菌接管机将富血小板血浆Ⅰ和富血小板血浆Ⅱ合并为混合富血小板血浆Ⅰ并进行第二次离心：390g，5min，得到上层混合富血小板血浆Ⅱ和下层红细胞Ⅳ，保留得到的上层混合富血小板血浆Ⅱ，去除下层红细胞Ⅳ。
将混合富血小板血浆Ⅱ在2500g，15min条件下离心后，得到上层血浆和下层血小板Ⅴ，除去血浆，保留下层血小板Ⅴ，通过无菌接管机加入一定量血小板保存液或血浆，最后得到的浓缩血小板制品浓度在800‑1400E9/L的适宜范围。

[0068] 以表1中所示3个批次的血小板保存液分别制备浓缩血小板制品，作为实施例组的3个平行样(n＝3)，以血浆制备的浓缩血小板制品作为对比对例组。实施例组和对比对例组的浓缩血小板制品体积相同，浓度一致，均保存于22±2℃的恒温振荡箱中。分别在第0、1、5和7天检测各组血小板的回收率、pH值、血小板凝聚功能，实施例组的3个平行样检测结果取平均值。

[0069] 表3不同保存时间血小板回收率对比％(n＝3)

[0070]   0d 1d 5d 7d对比例组 100 97.2±1.5 75.45±3.1 60.34±5.32
实施例组 100 98.3±0.9 83.23±2.2 72.23±3.44

[0071] 血小板形态是圆盘形，因能运动和变形，常呈现多形态，在储存期间常会聚集，导致血小板数量减少。通过血小板回收率可以得到储存期间各组血小板数量和聚集情况。通过上述统计结果可以看出使用本申请血小板保存液对血小板形态保护作用更好，回收率高于用血浆保存的对比例组。

[0072] 表4不同保存时间保存液pH值(n＝3)

[0073]  0d 1d 5d 7d
对比例组 7.3±0.3 7.3±0.22 6.8±0.31 6.5±0.09
实施例组 7.28±0.2 7.26±0.18 7.00±0.08 6.84±0.12

[0074] 在储存期间血小板会发生糖酵解，从而导致乳酸盐增加，降低pH值。当pH值降低到6.0后，血小板会失去活性。本申请血小板保存液中有葡萄糖、枸橼酸盐、醋酸盐和磷酸盐，以提供和维持充足的能量代谢、缓冲能力和抗凝效果并抑制乳酸的产生。在血小板保存期间可以稳定pH值，有利于血小板保存，可以有效防止血小板发生储存损伤。

[0075] 表5不同保存时间血小板聚集率％(n＝3)

[0076]   0d 1d 5d 7d对比例组 97.27±10.23 88.34±9.44 64.32±10.63 44.45±12.22
实施例组 98.22±9.45 90.45±7.46 78.74±13.54 63.89±8.43

[0077] 血小板聚集实验可以反应血小板聚集功能，表5可以反应出对比例组在第5天血小板聚集显著降低至65％，实施例组维持在78％。在第7天两组间差异明显，显示出血小板保存液具有较好保护血小板功能作用。

[0078] 以上实验验证了本发明可以更好的提取高纯度血小板，提高血小板收率。并且提供的新型血小板保存液可以替代传统的血浆保存，为浓缩血小板存储期内代谢提供能量，维持pH值稳定，稳定血小板状态和活性。