[0001] 本发明属于海洋生物细胞培养技术，具体涉及一种南极鱼细胞系构建的方法和应用。

[0002] 南极鱼类通常是指生活在南大洋的鲈形目南极鱼亚目鱼类，能够适应水温常年维持在0℃以下的极端环境的鱼类，南极鱼类在进化过程中发生了一系列细胞、分子和基因组水平上的改变，以适应南极寒冷的环境。由于全球气候变暖，气候变化对南极的生态系统造成了不可逆转的影响，对南极的生物多样性和生态环境造成了严重的威胁。

[0003] 真裸南极鱼(Harpagifer antarcticus)，属辐鳍鱼纲，鲈形目，裸南极鱼科，裸南极鱼属，分布于南冰洋海域，栖息深度为0‑84公尺，体长可达9.5公分，为底栖性鱼类，属肉食性，个体较小，体色与周围环境相似。真裸南极鱼作为重要的南极鱼类，在了解南极生物资源多样性和适应性进化的研究中备受青睐。

[0004] 鱼类细胞系作为一种体外培养系统，是进行病毒学、毒理学、生理学及分子遗传学等研究的重要基础材料。近年来随着极地勘测和样品获取技术的飞速发展，极地动物生命科学领域的研究也取得了长足进步。揭秘极地动物，特别是渔业动物的基因组结构，发掘功能基因，探究极地动物适应寒冷环境的分子机制，不仅具有重要的科学意义，而且还有重大的应用价值和潜力。

[0005] 然而，目前关于南极鱼细胞系的建立仍处于空白。因此，建立南极鱼细胞系对于进行南极鱼生理学、毒理学及分子遗传学等研究提供了宝贵的材料，对于南极鱼细胞系资源开发及种质资源保存具有重要意义。

[0053] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

[0054] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。

[0055] 下面结合实施例，对本发明作进一步说明：

[0056] 实施例1.南极鱼鳍细胞系的构建方法

[0057] 1.配制细胞培养液

[0058] 南极鱼鳍细胞系所使用的细胞完全培养基是在L‑15基础培养基中添加体积分数为20％的胎牛血清(简称FBS)(Gibco,A5669701)、10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(简称bFGF)(碧云天，P5453)、50μmol/L 2‑甲氧雌二醇(2‑ME)(Sigma，M3184)以及200IU/mL青霉素‑链霉素‑两性霉素B混合液(索莱宝，P7630)。

[0059] L‑15基础培养基的成分及终浓度为：900mg/L D‑半乳糖，300mg/LL‑谷氨酰胺，550mg/L焦葡萄糖酸钠，pH值为7.0‑7.4。

[0060] 2.原代培养

[0061] 在无菌条件下，取健康南极鱼的鳍条组织放入含有5％青霉素‑链霉素‑两性霉素B的1×磷酸盐缓冲盐水(简称1×PBS)中，用1×PBS冲洗3次。使用无菌剪刀将鳍条组织剪成3
1mm 左右的组织块，并用无菌巴氏吸管将组织块转移至15ml的无菌离心管，加入1×PBS冲
3
洗3次，冲洗掉碎屑和黏膜。随后将清洗干净的鳍条组织块均匀接种于25cm的培养瓶中，加入适量L‑15基础培养基，确保培养基浸没过组织块,且不让组织块漂浮移动，在培养瓶侧壁记录细胞信息，包括组织类别、时间及培养代数，放置在10℃培养箱中静置培养。细胞接种后24h后更换1mL新鲜L‑15完全培养基，每日观察细胞外迁情况。观察到有细胞从组织块迁出后，将培养基补至3mL继续培养，此后每2～3d更换1次L‑15基础培养基。

[0062] 3.传代培养

[0063] 待细胞从组织块周围迁出生长至培养瓶底面积的50％～60％时，吸弃培养瓶中原培养基，用1×PBS重洗细胞两次，加入胰酶进行消化，待南极鱼鳍细胞变圆脱落后，加入细胞完全培养基，使细胞均匀接种在培养瓶中。待细胞生长到培养基底面积的85～95％时，吸弃培养基，用1×PBS冲洗细胞两次，加入胰蛋白酶‑EDTA消化液消化3～5min，期间在倒置显微镜下注意观察，细胞基本脱离贴壁状态为宜，否则可适当延长消化时间。消化完毕后，向培养瓶中加入1mL的细胞完全培养基，收集细胞至离心管中，1000r/min离心5min，弃上清，用细胞完全培养基重悬，按照1：1的比例接种到两个培养瓶中，并将瓶中培养基补足到3mL。在培养瓶侧壁记录细胞信息，包括组织类别、时间及培养代数。

[0064] 4.细胞冻存及复苏

[0065] 4.1细胞冻存

[0066] 南极鱼鳍细胞系生长至汇合度为90％左右时进行冷冻保存，弃原培养基，PBS冲洗细胞两次，用质量体积百分比为0.25％胰蛋白酶‑EDTA消化液消化3～5min，待细胞基本全部变圆，脱离贴壁状态时加入含有体积分数为20％FBS的L‑15基础培养基终止消化，收集细胞至离心管中，1000r/min离心5min，收集细胞沉淀，用细胞冻存液重悬细胞保存到细胞冻存管中，将细胞冻存管转移到程序性降温盒，在‑80℃保存24h后转入液氮(‑196℃)长久保存。所述细胞冻存液各成分的体积比：10％DMSO，10％FBS和80％L‑15完全培养基。

[0067] 4.2细胞复苏

[0068] 对冻存细胞进行复苏时，将在液氮中保存的细胞迅速转移到12℃水浴锅中不断轻晃动解冻，当细胞冻存管内的冰晶融化时，1000g离心5min后弃上清，加入3ml的L‑15完全培2
养基重悬细胞，接种到25cm培养瓶中，放置于10℃、终浓度5％ CO2培养箱中进行培养，次日观察细胞生长状态并更换细胞完全培养基。

[0069] 实施例2南极鱼鳍细胞生长条件的比较

[0070] 2.1不同培养基对南极鱼鳍细胞的生长影响

[0071] 将第25代南极鱼鳍细胞以1×105个/孔的初始密度接种在24孔板中，待细胞贴壁稳定后，吸除原培养基后用1×PBS冲洗两次，分别培养于L‑15(Gibco,11415064)、MEM(Gibco,C11095500BT)、DMEM(Gibco,C11998899BT)和DMEM/F12(Gibco,C11330500BT)培养基中，且上述四种培养基中均添加20％ FBS、10ng/mL bFGF、50μmol/L 2‑ME以及200IU/mL青霉素‑链霉素‑两性霉素B混合液，并且每3天更换一次新鲜培养基。将细胞放在10℃、终浓度为5％ CO2培养箱中进行培养，并在培养的第1、5、10、15、20、25天取各培养基的每孔细胞，用血球计数板进行计数。实验做3个平行。以培养时间(单位：天)为横坐标，细胞数量为纵坐标，绘制生长曲线。结果如图2所示。

[0072] 如图2所示，由(a)可以看出，L‑15培养基为南极鱼鳍细胞系生长的最适培养基。

[0073] 2.2不同培养温度对南极鳍细胞生长的影响

[0074] 将第26代南极鱼鳍细胞以1×105个/孔的初始密度接种在24孔板中，待细胞贴壁稳定后，吸除原培养基后用1×PBS冲洗两次，加入新L‑15完全培养基，分别培养于12℃、10℃和4℃培养箱继续培养，所用细胞培养基是在L‑15培养基中添加20％ FBS、10ng/mL bFGF、50μmol/L2‑ME以及200IU/mL青霉素‑链霉素‑两性霉素B混合液，且每3天更换一次新鲜培养基。将细胞放在10℃、终浓度为5％ CO2培养箱中进行培养，并在培养的第1、5、10、15、20、25天取各培养基的每孔细胞，用血球计数板进行计数。实验做3个平行。以培养时间为横坐标，细胞数量为纵坐标，绘制生长曲线。结果如图2所示。

[0075] 由图2的(b)可以看出，10℃为南极鱼鳍细胞系生长的最适培养温度。

[0076] 2.3不同胎牛血清含量对南极鱼鳍细胞生长的影响

[0077] 将第27代南极鱼鳍细胞以1×105个/孔的初始密度接种在24孔板中，待细胞贴壁稳定后，吸除原培养基后用1×PBS冲洗两次，分别培养与体积分数为0％、5％、10％、15％、20％和25％FBS的L‑15基础培养基，且每3天更换一次新鲜培养基。将细胞放在10℃、终浓度
5％ CO2培养箱中进行培养，并在培养的第1、5、10、15、20、25天取各培养基的每孔细胞，用血球计数板进行计数。实验做3个平行。以培养时间为横坐标，细胞数量为纵坐标，绘制生长曲线。结果如图3所示。

[0078] 如图3所示，南极鱼鳍细胞系生长的最适FBS含量为20％。

[0079] 实施例3细胞来源鉴定

[0080] 使用海洋动物基因组DNA提取试剂盒提取第30代生长良好的南极鱼鳍细胞的DNA。根据真裸南极鱼线粒体细基因(GenBank:MT559889.1)设计特异性引物(HA‑F:5’‑CTGCCTCTAATCACTAGCTTACT‑3’，如SEQ ID NO.1所示，HA‑R:5’‑TTCGGATGTCTTGTTCACCTT‑
3’，如SEQ ID NO.2所示)进行PCR扩增。

[0081] 其中，MT559889.1具体如下(参见SEQ ID NO.3所示)：

[0082] CTGCCTCTAATCACTAGCTTACTCTCTGCCCCAGTAAAACCAATTTGAGCAGTAACACACGTCAAACCCGCCGTCAAGACAGCATTCTTTGTAAGTCTCCTCCCCTTATTCCTTTTTCTTAACCACGGCATAGAAGAAGTTATCTCCACCTGAACTTTAATAGACACCCTAACATTTGACGTAACTATTAGCCTTAAATTTGATCACTACTCACTTATCTTCACACCCGTGGCTTTGTACGTAACCTGGTCGATTCTAGAATTTGCAACCTGGTACATGAGCGATGACCCCGACATGGGCCGATTCTTTAAGTACCTCTTGATTTTCCTCATCGCAATAATTGTGCTAGTTACAGCTAATAACCTCTTTCAACTTTTCATCGGCTGGGAAGGCGTCGGCATCATATCTTTCCTCCTTATCGGCTGGTGGTCCGGCCGAGCCGACGCCAACACAGCCGCCCTCCAAGCAGTTGTATATAACCGAGTGGGGGACATCGGACTAATTTTTGCCATGGCCTGAATAGCCACAAGCTGCAACTCCTGGGACATGGAGCAGATTTTTATCACAATCCAACATTTCAACGTAACTCCCCCTGCTTTAGGGTTAATTATTGCCGCTGCTGGAAAGTCCGCCCAATTCGGCCTCCATCCGTGACTCCCCTCTGCTATAGAGGGCCCAACACCAGTATCCGCCCTCCTTCACTCCAGCACCATAGTAGTTGCCGGTATTTTCCTCCTTATCCGCATGAGCCCCCTACTCGAGAAAAGCCCAATCGCTCTAACCCTCTGCCTATGTCTGGGAGCATTAACAGCTATGTTTGCAGCCTGCTGCGCTCTGACCCATAACGACCTCAAAAAGATTATTGCATTCTCTACATCTAGCCAACTCGGCCTTATGATAGTCACTATCGGCCTCAACCAACCACAACTCGCCTTCCTTCACATCTGCATGCATGCATTTTTTAAAGCCATACTTTTCCTCTGCTCCGGATCAATTATCCACAGTCTACAAGGTGAACAAGACATCCGAA

[0083] HAF具体序列如下(参见SEQ ID NO.4所示)：

[0084] CTGCCTCTAATCACTAGCTTACTCTCTGCCCCAGTAAAACCAATTTGAGCAGTAACACACGTCAAACCCGCCGTCAAGACAGCATTCTTTGTAAGTCTCCTCCCCTTATTCCTTTTTCTTAACCACGGCATAGAAGAAGTTATCTCCACCTGAACTTTAATAGACACCCTAACATTTGACGTAACTATTAGCCTTAAATTTGATCACTACTCACTTATCTTCACACCCGTGGCTTTGTACGTAACCTGGTCGATTCTAGAATTTGCAACCTGGTACATGAGCGATGACCCCGACATGGGCCGATTCTTTAAGTACCTCTTGATTTTCCTCATCGCAATAATTGTGCTAGTTACAGCTAATAACCTCTTTCAACTTTTCATCGGCTGGGAAGGCGTCGGCATCATATCTTTCCTCCTTATCGGCTGGTGGTCCGGCCGAGCCGACGCCAACACAGCCGCCCTCCAAGCAGTTGTATATAACCGAGTGGGGGACATCGGACTAATTTTTGCCATGGCCTGAATAGCCACAAGCTGCAACTCCTGGGACATGGAGCAGATTTTTATCACAATCCAACATTTCAACGTAACTCCCCCTGCTTTAGGGTTAATTATTGCCGCTGCTGGAAAGTCCGCCCAATTCGGCCTCCATCCGTGACTCCCCTCTGCTATAGAGGGCCCAACACCAGTATCCGCCCTCCTTCACTCCAGCACCATAGTAGTTGCCGGTATTTTCCTCCTTATCCGCATGAGCCCCCTACTCGAGAAAAGCCCAATCGCTCTAACCCTCTGCCTATGTCTGGGAGCATTAACAGCTATGTTTGCAGCCTGCTGCGCTCTGACCCATAACGACCTCAAAAAGATTATTGCATTCTCTACATCTAGCCAACTCGGCCTTATGATAGTCACTATCGGCCTCAACCAACCACAACTCGCCTTCCTTCACATCTGCATGCATGCATTTTTTAAAGCCATACTTTTCCTCTGCTCCGGATCAATTATCCACAGTCTACAAGGTGAACAAGACATCCGAA.

[0085] 扩增时，以南极鱼鳍细胞DNA为模板，配制50μL的PCR反应体系：25μL的2×Taq PCR Mix，上、下游引物各2μL，2μL的DNA模板，19μL的无菌水。

[0086] PCR的反应条件：95℃预变性5min；95℃变性1min；58℃退火1min；72℃延伸1min；进行34个循环，最后72℃再延伸7min。取5μLPCR产物在1％琼脂糖凝胶中进行电泳检测并拍照。将PCR产物纯化后连接到pEASY‑T1载体(全式金，CT111‑02)并转化到大肠杆菌感受态细胞Trans T1(全式金，CD501‑02)中，挑阳性单克隆送至测序公司测序,将测序结果通过NCBI的BLAST工具进行序列比对分析。结果参见图3。由图4的(a)可以看出，经琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，在1030bp处有特异性条带，与预期目的条带一致，DNA标准品(DNA Marker)采用的是DL2000。

[0087] 由图4的(b)可以看出，测序后与NCBI数据库中的序列进行BLAST比对，结果显示扩增序列与NCBI数据库中真裸南极鱼线粒体基因序列一致性为100％，说明南极鱼细胞来源于真裸南极鱼。

[0088] 实施例4染色体分析

[0089] 取第22代南极鱼细胞进行核型分析，传代后的细胞在10℃、终浓度为5％ CO2培养箱中培养10d后在培养基中加入秋水仙素，使其终浓度为10μg/ml，在培养箱中继续培养6h后用胰蛋白酶‑EDTA消化液消化，1000g离心5min收集细胞，弃上清，加入5mL 0.075mol/L的KCl溶液37℃低渗30min。用预冷的卡诺固定液(甲醇：冰醋酸＝3：1比例，现配现用)预固定2min后离心弃上清，再加入卡诺固定液室温固定30min，1000g离心5min，弃上清。根据细胞沉淀量加入适量卡诺固定液吹打均匀，在30cm左右的高度处采取冷滴片法滴片，晾干后使用5％的吉姆萨染液染色30～40min，用缓水流轻轻冲掉吉姆萨染液，晾干后置于显微镜下观察染色体情况，选择100个细胞分裂中期染色体进行拍照统计。结果参见图5。

[0090] 如图5所示，图5的(a)显示南极鱼鳍细胞的染色体条数主要分布40～50，图5的(b)显示了共有62个细胞含有48条染色体，图5的(c)显示了共有62％的南极鱼鳍细胞具有48条染色体(2n＝48)。

[0091] 实施例5GFP报告基因的转染

[0092] 取第22代南极鱼细胞用胰酶消化法消化后，1000g离心5min收集细胞，加入电转工TM TM作液(SF 4D‑Nucleofector X Solution为16.4μL，Supplement3.6μL，pmaxGFP Vector 
4 TM
400ng)重悬细胞，使细胞数量为2×10 个。使用Lonza电转仪和Amaxa 4D‑
TM
Nucleofector Optimization Protocol for Cell Lines电转试剂盒进行电转。将细胞悬液加入到Lonza电转仪的电转槽中，电转条件为DS‑150，转染结束后加入200μL细胞完全培养基在室温下放置十分钟后，将细胞转移至6孔板中并加入3mL细胞培养基，转染48h后在荧光倒置显微镜下观察并记录表达绿色荧光蛋白的表达情况后观察绿色荧光并拍照，最终结果参见图6。

[0093] 图6显示了南极鱼鳍细胞系pmaxGFP质粒转染，其中，(a)为绿色荧光蛋白(GFP)在南极鱼鳍细胞中的表达，(b)为明场中的南极鱼鳍细胞。

[0094] 需要说明的是，上述的南极鱼鳍细胞为真裸南极鱼鳍细胞HA‑Fin‑cell2024，分类命名为真裸南极鱼(Harpagifer antarcticus)，保藏在中国典型培养物保藏中心(地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号)，保藏编号为保藏编号为CCTCC NO：C2024157，保藏日期为2024年6月20日。

[0095] 需要说明的是，本发明的保护范围中现有技术部分并不局限于本申请文件所给出的实施例，所有不与本发明的方案相矛盾的现有技术，包括但不局限于在先专利文献、在先公开出版物，在先公开使用等等，都可纳入本发明的保护范围。

[0096] 此外，本案中各技术特征的组合方式并不限本案权利要求中所记载的组合方式或是具体实施例所记载的组合方式，本案记载的所有技术特征可以以任何方式进行自由组合或结合，除非相互之间产生矛盾。

[0097] 以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。