[0001] 本发明涉及植物油提取领域，具体涉及一种甘草种子油及其制备方法和应用。

[0002] 甘草属豆科植物，是一味临床使用悠久的传统中药。甘草的入药部位为根和根茎，具有补脾益气、清热解毒、润肺止咳、缓急止痛及调和诸药的作用，有“众药之王”的美誉。甘草的根和茎中富含多种活性成分(如：三萜、黄酮、多糖、有机酸等)，具有广泛的药理活性(如抗炎、抗病毒、抗菌、抗肿瘤、抗氧化等)。目前对于甘草的化学成份及药理活性方面的研究比较深入，但是对于甘草种子来说，研究甚少。

[0003] 现有技术中鲜有甘草种子油的提取方法，更未对其可能存在的有效成分及活性展开研究，故甘草种子的价值尚不明确，有待开发和研究。

[0031] 提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其
他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的
保护范围之内。

[0032] 仪器与试剂：

[0033] 甘草种子(2023年7月，采自宁夏盐池甘草种植基地的乌拉尔甘草种子)，其它化学试剂均为国产化学纯试剂；CCK‑8(上海贝博生物科技有限公司)；DMEM高糖培养基(赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司)；EDTA(胰酶)(gibco)；Foetal Bovine Serum(Biological 
Industries)；磷酸缓冲盐溶液；96孔细胞培养板；多功能酶标仪；硝酸(优级纯)；混合标准溶液(含：Sb、As、Be、Cd、Ca、Cr、Co、Cu、Fe、Pb、Li、Mg、Mn、Mo、Ni、Se、Sr、Tl、Ti、V、Zn，100μg/mL)；Al单元素标准品(100μg/mL)；Ba单元素标准品(100μg/mL)；混合内标溶液(含：Sc、Ge、‑1
Rh、In、Tb、Lu，100μg/mL)；超纯水(电阻率18.2mΩ·cm )；电感耦合等离子体质谱仪(ICP‑MS 78000)；MARS微波消解系统；Milli‑Q纯水处理系统；电子分析天平；所有所用玻璃器具均经过稀硝酸浸泡24h；芦丁；醋酸地塞米松片(浙江仙据制药有限公司)；吐温‑80(北京博奥拓达科技有限公司)。

[0034] 实验动物：SPF级ICR小鼠，雄性，体重23～30g。饲养环境条件：室温(20±2)℃，相对湿度50％～60％，自由饮食普通饲料和水，适应性饲养3天后进行实验。

[0035] 实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用原料或仪器，均为可以通过市购获得的常规产品，包括但不限于本申请实施例中采用的原料或仪器。

[0036] 实施例1甘草种子油制备

[0037] 本实施例提供一种甘草种子油的制备方法，具体步骤如下：

[0038] (1)将甘草种子粉碎，得到甘草种子粉(粒度40目)；

[0039] (2)将200g甘草种子粉用滤纸包裹，装入索氏提取器，用正己烷回流提取3次，单次索氏提取的正己烷用量1000mL，提取温度为80℃，时间为120min，提取完成后合并正己烷提取液，减压浓缩至原体积的百分之一，得到粗品油；

[0040] (3)将粗品油过中性氧化铝柱(柱管内径为15mm，填料粒径80～120目，使用量50g，填充后柱高5cm，干法上样，上样量5mL)，用500mL正己烷洗脱，流速1mL/min，收集洗脱液，减压浓缩，得到甘草种子油，浅橘黄色。

[0041] 实施例2理化性质测定

[0042] 1、样品制备

[0043] 无水硫酸钠使用前在100℃的温度下烘2h，按照每10g甘草种子油(实施例1制备)加入2g的比例加入无水硫酸钠，并充分搅拌混合吸附脱水，然后用滤纸过滤，取过滤后的澄清液体油脂作为试样。

[0044] 2、甘草种子油酸值测定

[0045] 准确称取20g试样于锥形瓶溶解到50mL乙醚‑异丙酸混合溶剂中，加入4滴酚酞溶液，溶液和试样混合并摇匀，然后用0.1mol/L的氢氧化钾标准溶液，一边滴定一边用力摇
动，直到溶剂变为微红色，且15秒内不褪色，为滴定的终点。停止滴定，记录氢氧化钾溶液消耗的毫升数。对同一试样进行三次测定，按照如下公式计算酸值。

[0046] X1＝[(V‑V0)×c×56.1)]/m

[0047] 式中：X1─酸值，单位为毫克每克(mg/g)；V─所用氢氧化钾标准溶液的体积，单位为毫升(mL)；V0─空白测定所消耗的氢氧化钾标准溶液的体积，单位为毫升(mL)；c─所用氢氧化钾标准溶液的浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；m─试样的质量，单位为克(g)；56.1─氯氧化钾摩尔质量(g/mol)。

[0048] 3、甘草种子油过氧化值测定

[0049] 准确称取2g试样放于锥形瓶中，加入50mL的乙酸‑异辛烷混合溶液，盖上塞子用力摇动，直至试样完全溶解。加入0.5mL的饱和碘化钾溶液，盖上塞子使其反应，反应时间为1min，在反应期间最少摇动锥形瓶三次，使其反应完全，然后立即加入30mL的蒸馏水。用
0.1mol/L的硫代硫酸钠标准液滴定至碘的黄色消失，加入0.5mL的淀粉溶液，用0.01mol/L
的硫代硫酸钠标准液滴定，期间伴随有力的摇动，逐滴添加滴定液至蓝色消失，即为测量终点。对同一试样进行三次测定，并做空白实验，按照如下公式计算过氧化值。

[0050] P＝[1000(V－V0)c]/m

[0051] 式中：V─用于测定所消耗的硫代硫酸钠标准溶液的体积，单位为毫升(mL)；V0─用于空白试验所消耗的硫代硫酸钠标准溶液的体积，单位为毫升(mL)；c─硫代硫酸钠标准溶液的浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；m─试样的质量，单位为克(g)。

[0052] 4、甘草种子油碘值测定

[0053] 准确称取1.5g试样于500mL锥形瓶中，加入20mL的环己烷‑冰乙酸溶液溶解，准确加入25mL韦氏试剂，盖好塞子，摇匀后将锥形瓶置暗处，反应1h。到达规定的反应时间后，先加入20mL的碘化钾溶液，再加入150mL水，用0.1mol/L的硫代硫酸钠标准液滴定至碘的黄色消失，最后加入0.5mL的淀粉溶液后，用0.1mol/L的硫代硫酸钠标准液滴定，一边滴定一边用力摇动锥形瓶，直到蓝色刚好消失为止。对同一试样进行三次测定，并做空白试验，按照如下公式计算碘值。

[0054] W1＝[12.69×c×(V1－V2)]/m

[0055] 式中：W1─试样的碘值，用每100g油脂吸收碘的克数表示(g/100g)；c─硫代硫酸钠标准溶液的浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；V1─用于空白试验所消耗的硫代硫酸钠标准溶液的体积，单位为毫升(mL)；V2─用于样品试验所消耗的硫代硫酸钠标准溶液的体积，单位为毫升(mL)；m─试样的质量，单位为克(g)。

[0056] 5、甘草种子油皂化值测定

[0057] 分别准确称取20g试样于锥形瓶中，用移液管加入25mL氢氧化钾‑乙醇溶解，连接回流冷凝管与锥形瓶，将锥形瓶放加热装置，95℃水浴加热并维持沸腾状态1h，期间不时摇动。加入0.5mL酚酞指示剂于热溶液中，并用盐酸标准溶液滴定到指示剂的粉色刚好消失。
对同一试样进行三次测定。同时，不加样品，用25mL氢氧化钾‑乙醇溶液做空白试验，按照如下公式计算皂化值。

[0058] IS＝[(V0－V1)×c×56.1]/m

[0059] 式中：IS─皂化值(以KOH计)，单位为毫克每克(mg/g)；V0─空白试验所消耗的盐酸标准溶液的体积，单位为毫升(mL)；V1─试验所消耗的盐酸标准溶液的体积，单位为毫升(mL)；c─所用盐酸标准溶液的浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；m─试样的质量，单位为克(g)。

[0060] 本发明实施例1制备的甘草种子油理化性质的测定结果见表1。

[0061] 表1甘草种子油的理化性质

[0062]项目 指标
酸值(KOH)/(mg/g) 0.066±0.003
过氧化值(g/100g) 7.267±0.023
碘值(g/100g) 37.231±0.016
皂化值(KOH)/(mg/g) 186.823±1.818

[0063] 实施例3微量元素含量测定

[0064] 1、样品处理与检测样品前处理

[0065] 精密称量实施例1制备的甘草种子油0.3g，置于聚四氟乙烯(PTFE)消解罐中。

[0066] 加入10mL硝酸，将样品置于赶酸器上110℃预消解30min，加盖密封，按照表2所示的工作条件消解，待消解完成后，将样品置于赶酸板上，设置130℃赶酸至溶液剩余0.5mL，消解液冷却至60℃以下，取出消解罐，放冷，将消解液转至25mL量瓶中，用少量水洗涤消解罐三次，洗液合并于量瓶中，并用水定容、摇匀，即得样品测试溶液。

[0067] 参照以上方法配制空白对照溶液。

[0068] 表2微波消解条件

[0069]功率(W) 时间(min) 温度(℃) 保持时间(min)
800 10 120 5
800 5 150 5
1600 5 180 20

[0070] 2、溶液的配制

[0071] (1)标准工作储备液的配制

[0072] 称取混合元素的混合标准溶液、Al元素和Ba元素的单元素标准品各0.1g，用2％的硝酸定容到10mL，稀释成含有不同金属元素的混合标准储备液(1000ng/mL)。

[0073] (2)系列标准储备液的配制

[0074] 称取上述标准工作储备液适量，用2％的硝酸稀释成每1mL含0.2ng、1ng、5ng、10ng、50ng、100ng、500ng各元素的标准系列混合液。

[0075] (3)内标工作溶液的配制

[0076] 称取混合内标溶液适量，用2％的硝酸稀释成50ng/mL，即得。

[0077] 3、线性范围考察

[0078] ICP‑MS仪器条件见表3。

[0079] 表3ICP‑MS仪器条件

[0080] 项目 工作条件射频功率 1.50KW
冷却气流量(氩气) 15L/min
辅助气流量(氩气) 1.0L/min
雾化气体流量(氩气) 1.0L/min
重复次数 3
撞池模式 KED
蠕动泵转速 0.3rps

[0081] 在上述仪器条件下依次测定浓度由小至大的系列标准工作溶液，以测定元素与内标元素响应强度之比为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制得到标准曲线，求得回归方程。各元素的回归方程、相关系数见表4。

[0082] 表4回归方程、相关系数(R)

[0083]元素 回归方程 R
V y＝0.9989x+0.7856 0.9998
Cr y＝0.9982x+1.2271 0.9997
Mn y＝0.9984x+1.1245 0.9998
Fe y＝0.9985x+1.0445 0.9999
Co y＝0.9983x+1.1886 0.9998
Ni y＝0.998x+1.4199 0.9998
Cu y＝0.9974x+1.8173 0.9997
Zn y＝0.998x+1.4088 0.9997
As y＝0.9988x+0.8514 0.9997
Se y＝0.9988x+0.8512 0.9998
Mo y＝0.9998x+0.1126 0.9999

[0084] 将配制好的样品测试溶液在上述仪器条件下进行检测，并利用绘制的标准曲线确定各种微量元素含量。本发明实施例1制备的甘草种子油中11种微量元素的含量测试结果
见表5。

[0085] 表5甘草种子油中11种微量元素的含量

[0086] 元素种类 各元素含量(μg/g)V 0.025
Cr 0.299
Mn 0.369
Fe 5.520
Co 0.025
Ni 0.191
Cu 0.316
Zn 6.434
As 0.024
Se 0.012
Mo 0.015

[0087] 如表5所示，本发明实施例1制备的甘草种子油中含有丰富的人体必需的微量元素，已被确认与人体健康和生命有关的必需微量元素有11种，即钒、铬、锰、铁、钴、镍、铜、锌、砷、硒、钼。

[0088] 实施例4总黄酮含量测定

[0089] 1、样品处理与标准曲线绘制

[0090] (1)提取液制备

[0091] 称取2g实施例1制备的甘草种子油于离心管中，加入3mL甲醇(60％)和3mL正己烷，涡旋2min，3800r/min离心8min，分离上层油相和下层清液，取出下层清液，上层油相继续用甲醇提取二次，合并三次提取液，待测。

[0092] (2)标准曲线的绘制

[0093] 称取芦丁标准品0.0100g，加70％乙醇溶解于100mL棕色容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，即得0.10mg/mL的芦丁标准溶液。用蒸馏水稀释成浓度分别为0.0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/mL的标准储备液。取1.0mL上述标准液，加入0.7mL 5％亚硝酸钠溶液，摇匀放置6min，接着加入0.7mL10％硝酸铝溶液，摇匀放置6min，然后再加入5mL 4％氢氧化钠溶
液，摇匀放置15min。以0.0mL试剂为空白，在510nm处测定其吸光度值。所有试验平行测定三
2
次。芦丁标准曲线如图1所示(标准曲线为：y＝1.4149x‑0.0039，R＝0.9956)。

[0094] 2、黄酮含量测定

[0095] 取1mL极性伴随物(指步骤1的提取液)，加入0.7mL 5％亚硝酸钠溶液，摇匀放置6min，接着加入0.7mL 10％硝酸铝溶液，摇匀放置6min，然后再加入5mL 4％氢氧化钠溶液，摇匀放置15min。以0.0mL试剂为空白，在510nm处测定其吸光度值。根据回归方程计算样品总黄酮含量。

[0096] 按照如下公式计算甘草种子油中总黄酮含量。

[0097] M＝a×c×V/W

[0098] 式中：M为甘草种子油中总黄酮含量(mg/g)，a为稀释倍数，c为黄酮含量(mg/mL)，V为提取液体积(mL)，W为甘草种子油的质量(g)。

[0099] 测定本发明实施例1制备的甘草种子油中总黄酮含量见表6。

[0100] 表6甘草种子油种总黄酮的含量

[0101]

[0102] 如表6所示，本发明实施例1制备的甘草种子油中含有大量的黄酮类化合物，其含量高达2.41mg/g。

[0103] 实施例5体外抗肿瘤活性测试

[0104] 采用CCK‑8法对实施例1获得的甘草种子油进行体外抗肿瘤活性测试，主要研究其对肺腺癌细胞株(A549)和宫颈癌细胞株(Hela)的体外抑制活性。具体的测试过程以肺腺癌
细胞株(A549)的测试过程为例进行阐述。

[0105] 1、测试样品浓度配制

[0106] 将如上所述的甘草种子油用DMEM连续稀释成五种不同浓度(分别为100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL和6.25mg/mL)，用于细胞实验。

[0107] 实验将设置3个分组，A(空白组)：具有DMEM和CCK‑8；B(对照组)：具有DMEM、CCK‑8和细胞；C(实验组)：具有DMEM、CCK‑8、细胞和不同浓度的甘草种子油溶液。

[0108] 2、肺腺癌细胞株(A549)的培养及抑制活性测试

[0109] 将肺癌A549细胞(1×106cells/mL)按照每个孔100μL接种到96孔板中，在37℃的培养箱(95％空气，5％二氧化碳)中培养12h；从每个孔中取出培养基，向A组和B组的每个孔中加入100μL DEME，对C组的每个孔中加入100μL不同浓度的甘草种子油溶液(每个浓度重复5次)，并在37℃下培养24h；除培养基，在A组、B组和C组的每个孔中加入10μL CCK‑8，在37℃下避光再培养1h；用酶标仪测定450nm处的吸光度(OD值)。用各组检测的OD值来计算细胞存活率＝[(A实验组‑A空白组)/(A对照组－A空白组)]×100％。

[0110] 宫颈癌细胞株(Hela)的培养及抑制活性测试与肺腺癌细胞株(A549)的培养及抑制活性测试过程一致。

[0111] 本发明实施例1制备的甘草种子油对肺腺癌细胞株(A549)以及宫颈癌细胞株(Hela)的抑制率见表7。

[0112] 表7甘草种子油对两种肿瘤细胞株的影响

[0113]

[0114] 如表7所示，本发明实施例1制备的甘草种子油在100mg/mL的浓度下对肺腺癌细胞株和宫颈癌细胞株都具有一定的抑制率，分别为39％和44％，证明甘草种子油具有一定的
抗肿瘤/抗癌活性，在制备抗肿瘤或抗癌药物中具备一定潜力，如可以作为原料或辅料使
用。

[0115] 实施例6抗炎活性测试

[0116] 二甲苯致小鼠耳肿胀实验：

[0117] 实验小鼠适应性饲养3d以后，取小鼠50只随机分为5组，分别为空白对照组(2％吐温‑80，10只)，阳性对照组(地塞米松5mg/kg，10只)，甘草种子油高剂量组(3g/kg，10只)、甘草种子油中剂量组(0.75g/kg，10只)、甘草种子油低剂量组(0.1875g/kg，10只)，甘草种子油由实施例1制备得到。

[0118] 灌胃给药，每天1次，给药体积为10mL/kg，连续3d。末次给药1h后，40μL二甲苯均匀涂抹于小鼠右耳正反两面，致炎30min后脱颈椎处死小鼠，沿耳根部剪下两耳，用直径6mm打孔器在两耳相同部位等面积打下圆耳片，用电子天平称重，按照公式“耳肿胀度(mg)＝右耳(mg)‑左耳(mg)，肿胀抑制率(％)＝(空白组‑给药组)/空白组×100％”分别计算耳肿胀度和肿胀抑制率，实验结果见表8。

[0119] 表8甘草种子油对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响

[0120] 组别 耳肿胀度(mg) 肿胀抑制率(％)空白组 6.28±1.70 ‑
*
阳性对照组 3.53±0.38 43.79
*
高剂量组 3.30±0.4 47.45
中剂量组 4.92±2.28 21.66
低剂量组 5.48±1.90 12.74

[0121] 注：与空白组比较*P＜0.05，**P＜0.01

[0122] 如表8所示，在高剂量(3g/kg)下，本发明实施例1制备的甘草种子油比阳性药相对更强的抗炎活性，在制备具有抗炎活性的保健食品或药品中具有很大潜力，如可以作为原
料、添加剂或辅料使用。

[0123] 实施例7抗氧化活性测试

[0124] 1、DPPH储备液的制备

[0125] 称取0.0394g DPPH，用无水乙醇溶液定容至100mL容量瓶中，得到浓度为1mmoL/L的DPPH母液，摇匀后置于4℃冷藏，避光保存。

[0126] 2、DPPH应用液的制备

[0127] 用无水乙醇将DPPH母液浓度稀释为0.2mmoL/L，充分振摇，配制成DPPH应用液，避光保存。

[0128] 3、吸光度测量

[0129] (1)分别取2mL不同浓度(10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、65mg/mL、70mg/mL、75mg/mL、80mg/mL)的甘草种子油‑乙醇溶液(实施例1制备的甘草种子油)，依次加入10支10mL试管中，接着每支试管中加入2mL的DPPH‑乙醇溶液，充分混匀后静置30min后，在517nm波长下分别测定其吸光度值(Ai)，每个浓度平行三次。

[0130] (2)取2mL乙醇代替样品溶液，在相同的波长下测定其吸光度值(A0)，平行测定三次。

[0131] (3)取2mL乙醇代替DPPH溶液，在相同波长下测定其吸光度值(Aj)，平行测定三次。

[0132] 4、DPPH清除率计算

[0133] 按照如下公式计算其DPPH清除率。

[0134] DPPH清除率(％)＝[1–(Ai–Aj)/A0]×100％

[0135] 实施例1所制备的甘草种子油在不同浓度下的DPPH清除率见表9。

[0136] 表9甘草种子油在不同浓度下对DPPH的清除率

[0137]

[0138]

[0139] 如表9所示，本发明实施例1制备的甘草种子油在75mg/mL浓度下对DPPH自由基清除率≥94％，具有很好的抗氧化活性，在制备具有抗氧化活性的保健食品或药物中具备很
大潜力，如可以作为原料、添加剂或辅料使用。

[0140] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或
变动仍处于本发明创造的保护范围之中。