[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种以一步法制备的羧基磁珠及其制备方法。

[0002] 磁性微球是一类直径在纳米或微米级的球形复合材料。磁性微球的核芯由四氧化三铁或三氧化二铁等超顺磁性材料构成，外围包覆高分子材料。该核芯具有超顺磁性，使磁珠可以在外加磁场作用下向磁场方向移动，达到分离的目的。外围高分子材料可以通过物理或化学方法活化产生氨基(NH2—)、羧基(COOH—)或环氧基(—CH(O))等基团，可以与蛋白等生物活性分子偶联。偶联后的磁珠广泛应用于生物标记、生物分子的分离、蛋白的纯化、抗体纯化、分子诊断等领域。

[0003] 例如公开号为CN106215821A，公开日为2016年12月14日，名称为“一种磁微粒化学发光免疫分析试剂用羧基磁珠的制备方法”的中国专利文献公开了一种羧基磁珠的制备方法。在该专利文献所公开的技术方案中，其包括以下步骤：S1、制备Fe3O4纳米磁性微球；S2、二氧化硅磁性微球的制备；S3、磁性微球的氨基化；S4、羧基磁珠制备；S5、对制备好的羧基磁珠进行磁场响应筛选。

[0004] 再例如公开号为CN116643042A，公开日为2023年8月25日，名称为“血栓调节蛋白化学发光检测试剂盒”的中国专利文献公开了一种测试试剂盒。在该测试试剂盒的制备方法中其采用了将可溶性三价铁离子盐制成纳米微粒内核，内核用二氧化硅包被后与羧基化硅烷反应，磁分离后得到羧基磁珠。

[0005] 由上述专利文献可以看出，现有技术在制备羧基磁珠的制备方法中其主要是将Fe3O4磁性纳米粒子以二氧化硅包被后与羧基化硅烷反应，经磁分离后得到。然而该工艺流程操作步骤多，设备复杂，结果重复性较差。

[0030] 下面将结合具体实例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0031] 实施例1磁珠制备

[0032] 在本实施方式中，所述羧基磁珠采用以下方法制备获得：

[0033] 步骤S1：混合制备获得甲基丙烯酸(MAA)与Fe2+、Fe3+配位复合体；

[0034] 步骤S2：基于甲基丙烯酸与Fe2+、Fe3+配位复合体制备获得Fe3O4磁性纳米粒子；

[0035] 步骤S3：基于Fe3O4磁性纳米粒子制备得到Fe3O4羧基磁珠。

[0036] 此外，在本实施例中提供了甲基丙烯酸(MAA)与Fe2+、Fe3+配位复合体的制备方法，具体操作如下：

[0037] 将400μl 1mol/L FeSO4，34μl MAA，800μl mol/L FeCl3依次加入2ml EP管，混匀，2+ 3+
形成甲基丙烯酸与Fe 、Fe 配位复合体。

[0038] 需要说明的是，在一些其他的实施方式中，也可以通过其他方式制备获得甲基丙2+ 3+
烯酸与Fe 、Fe 配位复合体，其仅需要形成不饱和配合物即可。

[0039] 另外，在本实施例中提供了Fe3O4磁性纳米粒子的具体合成方法如下：在甲基丙烯2+ 3+
酸与Fe 、Fe 配位复合体中加入400μl 8mol/L NaOH，迅速混匀，生成黑色的Fe3O4磁性纳米粒子。

[0040] 磁珠制备原理和反应式如下：

[0041] Fe2++2Fe3++8OH‑→Fe3O4+4H2O。

[0042] 在一些其他的实施方式中，在步骤S3中，还可以采用以下方法进行制备：

[0043] 短时离心磁珠，取2μl上清液滴加到精密pH试纸，测pH值。加入适量NaOH溶液，调pH值至7.0～8.5范围内。如果调整后pH值大于8.5，可以加入步骤(1)所得的甲基丙烯酸(MAA)2+ 3+
与Fe 、Fe 配位复合体混匀液用于降低pH值，使pH值处于7.0～8.5范围内。将产物在75℃水浴中孵育45分钟，使得功能单体甲基丙烯酸结合到Fe3O4表面，获得羧基磁珠。

[0044] 需要说明的是，所制得的羧基磁珠保存在2～8℃冰箱。

[0045] 应用例1将实施例1制备的磁珠以及购买的天根公司以及硕世公司的磁珠应用到天根公司植物DNA快速提取试剂盒中，检测该磁珠的应用效果。

[0046] 检测结果可得实施例1的磁珠应用于大豆DNA提取时，DNA的OD 260/280为1.81，DNA的OD 260/230为1.63，由此说明了采用本案的羧基磁珠在提取DNA时，DNA纯度较好。

[0047] 此外，此次提取率达到了227.7μg/g，证明采用了本案所制备获得的羧基磁珠DNA提取率较高。

[0048] 表1为实施例1制备得到的羧基磁珠对大豆DNA提取率检测结果。

[0049] 表1.

[0050]

[0051] 应用例2将实施例1制备的磁珠应用于提取自行配置的试剂提取大豆粉末DNA中，验证该磁珠的应用效果。

[0052] 测试方法如下：3组实验组所用磁珠浓度分别为69.5、70.3、68.5ng/μl，提取出的大豆DNA OD 260/280分别为1.87、1.85、1.81，OD 260/230分别为1.44、1.57、1.49。

[0053] 有结果可以看出，本案实施例1的磁珠质量稳定，用于DNA提取实验时实验可重复性高。

[0054] 表2为实施例1制备得到的羧基磁珠对大豆DNA提取率重复检测结果。

[0055] 表2.

[0056]

[0057] 需要说明的是，所述自配试剂仅用于验证磁珠的应用效果，而不涉及本案的改进，其可以采用其他提取试剂进行替换，例如应用例1的天根试剂。

[0058] 以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。