[0001] 本发明涉及生物芯片以及细胞检测技术领域，具体涉及液晶光流控芯片、光学成像装置及应用。

[0002] 外泌体含量的测定对于患者癌症早期诊断和治疗有着广泛的应用：在已完成临床试验的研究中，外泌体应用领域有：癌症及子痫早期诊断、帕金森病、血小板功能及凝血、肿瘤疫苗；正在招募的临床试验中，外泌体应用领域有：癌症的早期诊断、肿瘤预后监测、免疫治疗、多囊卵巢综合症疾病诊断、组织修复等。因此外泌体的研究及检测一直受到人们的广泛关注。

[0003] 已报道的用于检测外泌体的方法，其中包括透射电子显微镜观察法(TEM)、流式细胞术(FCM)、Western Blot检测、化纳米颗粒示踪技术(NTA)等。综合分析以上方法，我们发现这些检测方法在进行生物样品中外泌体的检测时存在一定的缺陷，比如：流式细胞术(FCM)对外泌体的检测限范围较差，需要对外泌体进行富集，提高浓度后才能检测，并显示出一般的灵敏度。此外，还有一些方法比如透射电子显微镜观察法(TEM)、化纳米颗粒示踪技术(NTA)显示出理想的分析性能，但通常需要精密仪器与较为严格的人为操作。并且目前的方法均存在测试周期长、劳动密集、仪器复杂、不适合快速、灵敏、选择性的检测外泌体。

[0004] 液晶生物传感器是利用液晶分子作为生物传感器的信号转化元件，将生物分子间的特异性识别结合事件转化为放大的光学信号输出。其检测原理是液晶分子在功能化传感界面上的排列取向会随着特定目标分子的加入而发生变化，从而引起液晶对光线折射方向的改变，进一步放大为液晶在偏光显微镜下的光学图像形貌的改变。由于其操作简单、反应灵敏等优势而在小分子药品控制、蛋白质检测中有了一定的应用。本发明试图探索能够用于生物体如外泌体检测的液晶生物传感器。

[0051] 本发明实施例中的4‑氰基‑4'‑戊基联苯(5CB)，购自东京仁成工业株式会社。此外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

[0052] 下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

[0053] 下文中使用的核酸适配体序列为CD63 aptamer(SEQ ID NO.1所示)：5′‑CACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTATTTTTTTTTTTTTTT‑3′‑FAM。

[0054] 还可以使用的核酸适配体有：CD63‑2 aptamer(SEQ ID NO.2所示)：5′‑TAACCACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTAATTCCAA‑3′；

[0055] CD9‑26aptamer(SEQ ID NO.3所示)：

[0056] 5′‑ATAGTCCCTTGGCGTGCTTCACAACCTTGAACTTGACGCAGGATCGTTCAGTGCGCA CTAGAGCAGGTACGGTGTCA‑3′。

[0057] 实施例中PBS缓冲液组分如下：137mol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，4.3mmmol/LNa2HPO4，1.4mmol/L KH2PO4，溶剂为水，稀盐酸调节pH至7.4。

[0058] 实施例1

[0059] 本实施例提供一种液晶光流控芯片，其结构如图1‑5所示，包括PDMS柔性基底1，所述基底1上具有封闭的微结构，所述微结构包括数量相同且一一对应的若干个样品池2和若干个光学池3，每个所述样品池2和与所述样品池2相对应的一个光学池3通过微混合通道相通。每个所述样品池2均设有进出口管道一4，每个所述光学池3均设有进出口管道二5；所述微混合通道包括彼此相通的第一通道6和第二通道7，其中，所述第一通道6设有进样管道8。样品池2和光学池3的数量没有特殊要求，可以根据通量需求指定，比如8个、9个、10个、20个、30个、50个、100个，等等，因此，本发明的液晶光流控芯片可以实现高通量、且不同浓度的生物样品测量。在本发明的所有实施例中，采用的是8个样品池2、8个光学池3组成的微结构。

[0060] 进一步地，如图2所示，所述样品池内设有若干个小分子过滤孔16，所述小分子过滤孔16位于所述样品池2与所述微混合通道相连的一侧。在本实施例中，小分子过滤孔6是通过在样品池内设置多个方柱17，方柱17之间形成所述小分子过滤孔16。并且在本实施例中，小分子过滤孔16的尺寸设置在1um以下，小分子检测物(图2中球状颗粒表示小分子检测物，片状且中心球状表示细胞培养物)通常为纳米级别，比如外泌体等分泌物为100～150nm级别，小分子过滤孔允许小分子通过，而保留大分子细胞，大分子细胞是指尺寸在10um以上的细胞。小分子过滤孔16的尺寸可以根据样品中待检测成分的大小进行灵活调整。此外，样品池的尺寸没有特殊要求，在本实施例中，样品池2长1.7cm，宽3mm，高度100um。

[0061] 如图3、5所示，所述光学池3内设有用于若干个装载光学成分的孔槽15；孔槽横截面可以设计为矩形(方体)、正六边形(正六棱柱)、正三角形(正三棱柱)、圆形结构，对应的，不同孔槽结构为方体、正六棱柱、正三棱柱、圆柱结构，并且在偏光显微镜下所形成的光学图像分别为矩形、正六边形、正三角形、圆形。在本实施例中，采用正方形孔槽结构，图3～图6中每个孔槽形成的光学图像因此为正方形。此外，孔槽排列成规则形状所形成的光学图像较为均匀，便于观察，因此，将本实施例的孔槽排列形成正方形矩阵。此外，光学池的尺寸没有特殊要求，在本实施例中，光学池3长1.6cm，宽3mm，高度100um。正方形孔槽边长80μm，高
25μm。

[0062] 进一步地，如图4所示，所述第一通道6为层级式树状通道，该层级数量≥2，层级数量控制在2～5之间较优，可以控制进样的均匀和效率。在本发明的所有实施例中，采用的是3层级树状通道，第一层级设有进样管道8和2个分流口一12，第二层级设有4个分流口二13，第三层级设有8个分流口三14，分流口三14与第二通道7的第三通道9连通。需要引入的成分从进样管道8进入后通过分流口一12进入第二层级，再经过分流口二13分流进入第三层级，再经过分流口三14进入第二通道7。

[0063] 所述第二通道7包括若干个第三通道9，每个所述第三通道9均与其中一个样品池2和与所述样品池2相对应的一个光学池3分别连通，即第三通道9与样品池2和光学池3的数量相同。在本发明的所有实施例中，采用的是8条第三通道9。第三通道9两端与所述样品池2和所述光学池3分别通过管道10，11连通。在本实施例中，每个所述第三通道9的结构为‘口字形’通道与螺旋形通道相连，其中，‘口字形’通道与分流口三14一一对应且相连，口字形’通道位于样品池2一侧，螺旋形通道位于光学池3一侧。

[0064] 为了更好的保护该液晶光流控芯片，还可以设置壳体，壳体可以和芯片为一体结构，也可以为可拆卸结构。当壳体和芯片为一体结构时，壳体最好设置为透明结构。壳体的作用是防止液晶光流控芯片发生污染或受损，图1中显示的是未附带壳体的结构。

[0065] 本实施例的液晶光流控芯片可以实现不同组分在微混合通道中均匀混合，将多步骤，复杂的实验拆分成类流水线结构，准确控制注入溶液体积，快速完成混合，解决人工混合带来的体积误差问题与操作繁琐等问题。然后将混合物汇集到光学区，光学区可以同时加入液晶等光学成分，从而利用不同光学现象来对组分中的物质进行检测、鉴别和区分。该芯片可以同时进行多组实验，同时观察多组实验现象，方便快捷高效。

[0066] 实施例2

[0067] 实施例1的液晶光流控芯片的制备方法以及光学成像装置组装，具体如下：

[0068] (1)采用AutoCAD软件绘制带有不同尺寸和形状的几何图案，定制成尺寸为5寸×5寸×2.3mm的掩模版，图4示出微结构的掩模版设计图，黑色表示不透光部分，白色表示透光部分。

[0069] (2)光刻微结构流程：涂胶：在硅片上采用SU8‑3000系列光刻胶进行旋涂，旋涂分‑1为两步，第一步为：速度500rpm，加速度500rpm·s ，时间5s；旋涂第二步为：速度1800‑‑1
2500rpm，加速度1800‑2500rpm·s ，时间60s，旋涂厚度约为20‑60μm；之后进行分步前烘，自然冷却至室温；在光刻机内将掩模版与涂胶完毕的硅片对齐进行紫外曝光，紫外曝光参‑2
数为：曝光时间25s，紫外强度126μM·cm ；再进行分步后烘；显影：采用PGMEA显影剂显影，时间4‑10min；显影完成后用异丙醇清洗，氮气吹干硅片后显微镜观察光刻情况；坚膜：将光刻好的硅片放120℃热板上保持30min，后自然冷却至室温。

[0070] 在上述过程中，分步前烘包括：第一步室温加热至50±5℃，保持10～15min；第二步加热至65±5℃，保持10～15min；第三步加热至95±5℃，保持10～15min；第四步，95℃冷却至室温。

[0071] 分步后烘包括：第一步室温加热至50±5℃，50±5℃保持10min；第二步50±5℃加热至65±5℃，65±5℃保持10min；第三步65±5℃加热至80±5℃，80±5℃保持10min；第四步，80±5℃冷却至室温。

[0072] (3)PDMS倒模：将PDMS和固化剂按照质量比为10:1充分搅拌混合后真空消除气泡，获得液态PDMS；后将液态PDMS均匀倒在硅片上，进行热固化，固化参数包括：温度90℃，时间30min，自然冷却至室温；固化结束后将PDMS从硅片上剥离，切割成两片PDMS，将两片PDMS柔性基底进行键合，具体为粘合，其中，具有微结构中的样品池、光学池、第一通道的PDMS柔性基底位于下层，具有微结构中的第二通道的PDMS柔性基底位于上层，同时对PDMS柔性基底上非微通道部分进行清洗，仪器采用等离子体清洗机，其中等离子气体为空气，时间为
6min。等离体清洗过程用3M胶带对微结构进行遮蔽。粘合过程需要移除上下基板的遮蔽材料。

[0073] 键合后，用外径为1.25mm的打孔器设置连接进出口管道一、进出口管道二、进样管道的口，以及样品池与微混合通道、微混合通道与光学池的连接管道的口。获得液晶光流控芯片，备用。本实施例并未对该液晶光流控芯片加载壳体。

[0074] 光学成像装置组装：将进出口管道一、进出口管道二、进样管道采用内径为0.5mm，外径为1.5mm硅胶软管，并且进出口管道一、进出口管道二还连接注射装置，注射装置为注射泵与注射针组成的流体输送装置。再加入偏光显微镜，液晶光流控芯片的光学区置于偏光显微镜下，偏光显微镜两线性偏振片为垂直交叉，由液晶光流控芯片的光学池的一侧接受检测光束，根据另一侧经过光学池的光束变化实现检测，用CCD电子元件接收液晶光流控芯片的光学图像。

[0075] 实施例3

[0076] 液晶光流控芯片的功能测试：

[0077] 采用实施例2的光学成像装置，先通过进出口管道二将液晶注入到液晶光流控芯片的光学池中，加入量为每个光学池约2μL；

[0078] 配制溴化十六烷基三甲铵溶液，将溴化十六烷基三甲铵溶解于PBS缓冲液中，超声波溶解时间为30min，配制成浓度分别为0.02mM、0.0225mM、0.025mM、0.03mM、0.04mM的溴化十六烷基三甲铵溶液，将上述不同浓度的溴化十六烷基三甲铵溶液分别通过不同的进出口管道二加入液晶光流控芯片的光学池，每个光学池的加入体积为110μL，使用偏光显微镜进行观察，结果如图6所示，当溴化十六烷基三甲铵溶液的浓度＜0.025mM时，5分钟内液晶呈现明亮的形貌；当溴化十六烷基三甲铵溶液的浓度≥0.025mM时，5分钟内液晶呈现黑暗的形貌。因此，溴化十六烷基三甲铵溶液的浓度控制在＜0.025mM，优选为0.02mM。溴化十六烷基三甲铵为一种阳离子表面活性剂，本发明还可以选择十二烷基二甲基苄基溴化铵、十八烷基三甲基氯化铵、甲基二牛脂酰乙基‑2‑羟乙基硫酸甲酯铵这几种阳离子表面活性剂。

[0079] 在上述过程中，液晶的滴加量没有具体限定，只要使得制备后的液晶生物传感器在偏光显微镜下是均匀的暗场即可。

[0080] 本发明利用光学成像装置进行外泌体的检测原理如图7所示：当液晶光流控芯片的光学池中不存在外泌体与适配体时，界面处的溴化十六烷基三甲铵单层膜依然维持液晶分子的垂直排列，偏光显微镜下液晶图像呈现黑暗的光学形貌(图7中A图)；当加入适配体时，降低溴化十六烷基三甲铵在界面的浓度从而破坏原先形成的溴化十六烷基三甲铵单层膜，导致液晶分子由垂直排列转变为平行/倾斜排列，偏光显微镜下液晶图像呈现明亮的光学形貌(图7中B图)；当加入适配体与外泌体混合溶液时，由于外泌体与适配体特异性结合，界面处的溴化十六烷基三甲铵单层膜依然维持液晶分子的垂直排列，偏光显微镜下液晶图像呈现黑暗的光学形貌(图7中C图)。基于以上原理，结合实施例5的灰度‑浓度标准曲线，就可以获得外泌体的定性定量检测过程。

[0081] 此外，样品池还可根据需要用作细胞培养单元，光学池中用于装载光学成分的孔槽也可以根据不同要求进行调整，从而改变所形成的液晶图像中栅格形状大小。

[0082] 实施例4

[0083] 核酸适配体浓度的确定：

[0084] 采用实施例2的光学成像装置，先通过进出口管道二将液晶注入到液晶光流控芯片的光学池中，加入量为每个光学池约2μL；

[0085] CD63核酸适配体冻干粉末溶解于PBS缓冲液中，涡旋混匀，配制成浓度分别为50nmol/L、40nmol/L、20nmol/L、10nmol/L的核酸适配体溶液，将上述不同浓度的核酸适配体溶液分别与0.02mM的溴化十六烷基三甲铵溶液(配制方法同实施例3)涡旋混匀，37℃条件下孵育反应30min后加入液晶生物传感器的阵列光学池，每个光学池的滴加体积为110μL，使用偏光显微镜进行观察，结果如图8所示，当核酸适配体溶液的浓度≥50nmol/L时，液晶为全部明亮的形貌；当溶液的核酸适配体浓度从50nmol/L逐渐降低到10nmol/L时，液晶的形貌由全部明亮逐渐转化为全部黑暗，明亮的区域范围逐渐减少。因此，核酸适配体溶液的浓度控制在45～50nmol/L适宜，优选为50nmol/L。

[0086] 实施例5

[0087] 外泌体灰度‑浓度标准曲线的获得：

[0088] 采用实施例2的光学成像装置，先通过进出口管道二将液晶注入到液晶光流控芯片的光学池中，加入量为每个光学池约2μL；

[0089] 外泌体的提取：选择状态良好的第3‑4代人源脐带间充质干细胞(MSC)，当MSC融合至75％左右时更换新鲜无血清培养基，培养48h后收集上清液。将上清液置于离心管中，4℃、2000g离心30min，除去细胞碎片，保留的上清液经无菌滤膜(0.45μm)过滤后置入超速离心管中，4℃、1000g离心70min后得到外泌体浓缩液。将浓缩液移至新的超速离心管中，4℃、100000g离心70min。用PBS稀释沉淀，再次4℃、100000g离心70min。获得的外泌体浓缩液经无菌滤膜(0.22μm)过滤，少量体积PBS重悬后于‑80℃冷藏用于后续实验，得到实验室自制外泌体标准品。

[0090] 将外泌体标准品涡旋溶解于PBS缓冲液中，配制成浓度为3.9×10^7/mL、1.95×10^7/mL、9.8×10^6/mL的外泌体标准溶液；上述不同浓度的外泌体标准溶液中添加CD63核酸适配体溶液，混合均匀，核酸适配体和外泌体标准溶液的体积比为1:1，核酸适配体在混合溶液中的终浓度为100nmol/L，4℃反应60min，得反应液①，将上述反应液①与溴化十六烷基三甲铵溶液，混合均匀，溴化十六烷基三甲铵溶液和反应液①的体积比为1:1，溴化十六烷基三甲铵在混合溶液中的终浓度为0.02mM，37℃反应30min，得反应液②。将反应液②加入光学池，每个光学池的滴加体积为110μL，使用偏光显微镜进行观察，结果如图9所示，当外泌体标准溶液的浓度≥3.9×10^7/mL时，液晶呈现出黑暗的形貌；当外泌体标准溶液的浓度≤9.8×10^6/mL时，液晶呈现出光亮的形貌；当外泌体标准溶液的浓度由3.9×10^7/mL到9.8×10^6/mL逐渐降低时，液晶的形貌由全部黑暗逐渐光亮。用MATLAB(version 9.6.0，R2019a)软件对采集的光学图像进行像素分析，得到液晶图像的平均灰度值并用OriginPro9.1软件作图。外泌体在9.8×10^6/mL至3.9×10^7/mL的浓度范围，其液晶图片的灰度值与外泌体浓度具有良好的线性关系，相关系数为：0.9996(图9中D图)。液晶生物传感器能够检测外泌体的检测限为1.86×10^6/ml。

[0091] 实施例6

[0092] 采用实施例2的光学成像装置检测外泌体样品：

[0093] 先通过进出口管道二将液晶注入到液晶光流控芯片的光学池中，加入量为每个光学池约2μL，形成一定厚度的液晶薄膜的同时锚定液晶薄膜上界面液晶分子呈垂直排列。如图10中A图所示，为液晶垂直锚定微结构的POM图。

[0094] 然后将0.01mM的溴化十六烷基三甲铵溶液加入至注射针一中，固定在注射泵一里，注射体积为30μL。

[0095] 参照实施例5提取外泌体的方法获得外泌体，并用PBS重悬使得外泌体浓度为3.9×10^7/mL，加入至注射针二中，固定在注射泵二里，注射体积为30μL。

[0096] 将CD63适配体用PBS缓冲液配制成浓度为40nmol/L的溶液的注射针固定在注射泵里，注射体积为60μL。

[0097] 上述3种液体分别注入到光学池、样品池、微混合通道中的流速分别是25μL·min‑1、150μL·min‑1、80μL·min‑1，最后在光学池混合，采用偏光显微镜观察的结果如图10中B图和C图所示，用MATLAB(version 9.6.0，R2019a)软件对采集的光学图像进行像素分析，结合外泌体灰度‑浓度标准曲线图，计算得到的外泌体浓度也为3.9×10^7/mL。进一步将外泌体配制成如下浓度的溶液：4.5×10^7/mL、5.0×10^7/mL、5.5×10^7/mL、6.0×10^7/mL，重复前述实验过程，进行结果的重复验证，计算结果均和目标浓度一致，实施例结果证明此液晶传感器用于外泌体检测准确性高。

[0098] 此结果表明，本申请的液晶生物传感器组件能够有效地检测液体样品中的外泌体，利用本发明的方法能够快速、灵敏、简便、阵列化地对微量外泌体进行有效检测，整个检测过程耗时约为10min。

[0099] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。