[0001] 本发明涉及中药材检测技术领域，具体涉及一种鉴别冬虫夏草粉原料规格等级的方法。

[0002] 冬虫夏草(Cordycepssinensis)是我国传统名贵中药材，其主要生长于西藏、青海、四川等高海拔山区，具有补肾益肺、止血化痰的功效。传统市场冬虫夏草销售时按规格大小可分为不同的等级。而规格越大的冬虫夏草生长越为困难、资源更加稀缺，造成规格越大、价格越高的现状。关于冬虫夏草规格大小与其内在成分的关联性研究极少，前期有文献研究了不同等级冬虫夏草的核苷类成分，结果显示不同等级冬虫夏草中核苷类成分无显著差异。

[0003] 目前对于不同规格等级的冬虫夏草原药材，尚可通过每公斤冬虫夏草的条数或每根冬虫夏草的重量、感官检查等手段进行判断，但对于冬虫夏草粉的原药材规格等级，尚无鉴定手段。专利CN102890091 B采用了显微染色法鉴别纯冬虫夏草粉的真伪，专利申请CN103898236B公开了检测冬虫夏草超微粉中是否添加蜡蚧轮枝菌发酵粉的引物对、试剂盒和方法。这些技术主要解决冬虫夏草粉的真伪鉴别问题，但无法鉴别冬虫夏草粉的原料规格等级。

[0004] 因此，亟需一种鉴别冬虫夏草粉的原料规格等级的方法。

[0070] 为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例，对本发明作进一步的详细说明。

[0071] 本发明所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本发明所描述的方法制备而得。

[0072] 实施例1：冬虫夏草粉末原料规格等级判别方法的制定

[0073] 1、仪器和材料

[0074] 1.1仪器

[0075] Cary 60型紫外可见光分光光度计(美国Agilent公司)；1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；SEDEX 90型蒸发光散射检测器(法国SEDERE公司)；XPE205DR型十万分之一分析天平(瑞士METTLER公司)；HH‑ZK 8型电热恒温水浴锅(巩义予华仪器有限责任公司)；ST‑40型离心机(美国Thermo Fisher公司)；Milli‑Q超纯水系统(美国Merck公司)。

[0076] 1.2材料

[0077] 葡萄糖对照品购于中国食品药品检定研究院；葡聚糖对照品(分子量分别为：1kDa、12kDa、80kDa、150kDa、410kDa、670kDa)购于Sigma公司；浓硫酸、无水乙醇、氯仿、正丁醇均为分析级，购于成都科隆化学品有限公司；苯酚为分析级，乙酸铵为色谱级，购于阿拉丁上海有限公司。

[0078] 冬虫夏草样品(来源：宜昌山城水都冬虫夏草有限公司冬虫夏草繁育品)：取9批不同批次的大规格(约为2100～2700条/kg)冬虫夏草(简称大草)各约10g，编号分别为SD1～SD9，每条大规格冬虫夏草的重量为0.38g～0.47g；取9批不同批号的小规格(约为4800～5600条/kg)冬虫夏草(简称小草)各约10g，分别编号为SX1～SX9，每条小规格冬虫夏草的重量为0.18g～0.21g。

[0079] 2、实验方法

[0080] 2.1冬虫夏草多糖的提取

[0081] 将冬虫夏草粉碎，称取冬虫夏草粉0.5g，精密称定，精密加水20mL，称定重量，沸水浴回流提取4h，取下放冷，再次称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，转移至50mL离心管，离心(5 000r/min)20min。精密移取上清液5mL，加入无水乙醇20mL，密封，混匀，于4℃冰箱放置12h，取出后离心(5 000r/min)20min，弃去上清液，沉淀挥干至无醇味，精密加水10mL，置涡旋混合器上使沉淀溶解，制得冬虫夏草多糖提取液。

[0082] 2.2多糖含量的测定

[0083] 2.2.1葡萄糖对照品溶液制备

[0084] 取葡萄糖对照品适量，精密称定，用水制成浓度约为0.1mg/mL的葡萄糖对照品溶液。

[0085] 2.2.2测定

[0086] 空白对照：取2.0mL水，再加入5％苯酚溶液1mL及浓硫酸5mL，密塞，涡旋混匀，静置30min，作为空白对照。

[0087] 葡萄糖标准曲线的制作：分别精密量取0.1mg/mL葡萄糖对照品溶液0.4mL、0.7mL、1.0mL、1.3mL、1.6mL、2.0mL置于比色管，不足2.0mL的用水补足至2.0mL，再分别加入5％苯酚溶液1mL及浓硫酸5mL，密塞，涡旋混匀，静置30min。于490nm处测定吸光值，以葡萄糖质量浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度值(A490)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。

[0088] 供试品溶液的测定：精密量取冬虫夏草多糖提取液0.5mL，用水补足至2.0mL，再分别加入5％苯酚溶液1mL及浓硫酸5mL，密塞，涡旋混匀，静置30min。于490nm处测定吸光值，根据葡萄糖标准曲线方程，计算冬虫夏草中多糖含量(ω)。

[0089] 2.3多糖分子量分布的测定

[0090] 2.3.1葡聚糖对照品溶液的制备

[0091] 分别称取分子量为1kDa、12kDa、80kDa、150kDa、410kDa、670kDa的葡聚糖对照品各约10mg，置于20mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度约为0.5mg/mL的系列葡聚糖对照品溶液。

[0092] 2.3.2供试品溶液的制备

[0093] 取冬虫夏草多糖提取液适量，按其与Sevage溶液(氯仿‑正丁醇4:1，v:v)体积比为4:1的比例，剧烈震荡10min，静置，取上清液，用Sevage溶液重复萃取至除尽蛋白，上清液经
0.2μm滤膜过滤，制得供试品溶液。

[0094] 2.3.3色谱条件

[0095] 色谱柱：TSK gel Super Multipore PW‑H，150mm×6.0mm，8μm；

[0096] 流动相：0.1mol/L乙酸铵水溶液；

[0097] 洗脱方式：等度洗脱；

[0098] 流速：0.4mL/min；

[0099] 柱温：35℃；

[0100] 进样量：20μL；

[0101] ELSD检测器：载气为氮气；

[0102] 载气压力：3.5Bar；

[0103] 漂移管温度：60℃；

[0104] 增益值：6。

[0105] 2.3.4测定

[0106] 取2.3.1的不同分子量的葡聚糖对照品系列溶液、2.3.2的供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。

[0107] 2.3.5数据处理

[0108] 采用Agilent GPC CIRRUS(A.02.01)数据分析系统。以保留时间(Time)为横坐标X，葡聚糖系列对照品分子量的对数值(lg Mw)为纵坐标Y，绘制标准曲线，得分子量校正曲线。根据样品溶液中各色谱峰的保留时间，由校正曲线求得各峰的分子量，并用“重均分子5 6 3 7
量为5×10 Da＜MW＜3×10Da的多糖组分的峰面积除以1×10 Da～1×10 Da的多糖组分的
5 6 3 7
总峰面积”表示重均分子量为5×10Da＜MW＜3×10Da的多糖组分在1×10 Da～1×10Da的多糖组分中的占比(P)。

[0109] 2.4计算公式

[0110] A＝ω×P

[0111] A——冬虫夏草中重均分子量为5×105Da＜MW＜3×106Da的多糖组分在冬虫夏草中的含量，g/100g；

[0112] ω——冬虫夏草中多糖的含量，g/100g；

[0113] P——冬虫夏草中重均分子量为5×105Da＜MW＜3×106Da的多糖组分的峰面积在13 7
×10Da～1×10Da的多糖组分总峰面积中的占比。

[0114] 3、实验结果

[0115] 色谱图结果如图1所示，结果表明大规格草和小规格草多糖提取液色谱图中均含7
有5个主要色谱峰，组分1的重均分子量为1×10 Da以上，组分2、3、4的重均分子量在1×
3 7 3
10Da～1×10Da，组分5的重均分子量小于1×10 Da，为样品制备过程中残留的小分子化合物。由图1可知，大规格草和小规格草的多糖组分2的差异最明显。比较发现，多糖组分2的重
5 6
均分子量的范围为5×10 Da＜MW＜3×10 Da，大规格草多糖组分2的含量为2.17g/100g～
4.23g/100g，均值为(2.9±0.6)g/100g；小规格草多糖组分2的含量为0.48g/100g～1.52g/
100g，均值为(1.1±0.4)g/100g。两者的含量有明显的差异，可作为区分点。结果如表1和图
2所示。

[0116] 4、判定规则

[0117] 根据多糖组分2的含量结果判定冬虫夏草粉中原料的规格为大草还是小草：当冬虫夏草多糖组分2在冬虫夏草粉中的含量不低于2.1g/100g，所述冬虫夏草粉的冬虫夏草原料为大规格冬虫夏草(每公斤2700条及以下)；当冬虫夏草多糖组分2在冬虫夏草粉中的含量低于2.1g/100g，所述冬虫夏草粉的冬虫夏草原料为小规格冬虫夏草(每公斤4800条及以上)。

[0118] 表1：不同规格冬虫夏草多糖组分2的重均分子量(Mw)、峰面积占比及含量[0119]

[0120] 实施例2：不同冬虫夏草粉末的原料规格验证

[0121] 1、仪器和材料

[0122] 随机选取11批冬虫夏草(宜昌山城水都冬虫夏草有限公司冬虫夏草繁育品5批，标记为C1～C5；四川甘孜野生冬虫夏草2批，标记为C6～C7；四川康定野生冬虫夏草1批，标记为C8；青海海东野生冬虫夏草1批，标记为C9；西藏加查野生冬虫夏草2批，标记为C10～C11)，每批2～5g，称量各批次每根冬虫夏草的质量，如表2所示。

[0123] 其余仪器和材料同实施例1。

[0124] 表2：11批冬虫夏草的单根重量及相应规格

[0125]

[0126]

[0127] 2、实验方法

[0128] 按实施例1中“2、实验方法”项下方法提取和分析样品，并按实施例1中“4、判定规则”进行判断。

[0129] 3、实验结果

[0130] 根据实施例1的判定规则，推测11批冬虫夏草粉末的原料规格，结果如表3所示。推测结果与称量法划分的规格比较，结果一致。说明冬虫夏草多糖组分2在冬虫夏草粉中的含量可用于区分大规格和小规格冬虫夏草，根据该结果制定的冬虫夏草粉末原料规格等级判别方法是可行的。

[0131] 表3：11批冬虫夏草粉末规格验证

[0132]

[0133]

[0134] 4、实验结论

[0135] 由以上结果可知，根据冬虫夏草中重均分子量为5×105Da＜MW＜3×106Da的多糖组分在冬虫夏草中的含量，可以区分冬虫夏草的规格。通过数据统计分析，当冬虫夏草中该多糖组分含量不低于2.1g/100g时，可判定其为大规格草(每公斤2700条及以下)；当冬虫夏草中该多糖组分含量低于2.1g/100g时，可判定其为小规格草(每公斤4800条及以上)。

[0136] 本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。