[0001] 本发明属于功能性材料领域，特别涉及一种具有内质网靶向功能的硒掺杂碳量子点及其制备方法和应用。

[0002] 在正常的细胞环境中，细胞内氧(ROS)由氧化还原酶和非酶抗氧化系统调节并保持平衡。适量生成的ROS对信号转导、细胞介导免疫和细胞氧化还原反应平衡等生理过程具有重要的意义。然而，在某些情况下，如贫血、长期紫外线照射或过量摄入食品添加剂等，可能使得ROS过度生产，从而导致氧化应激及器官受损，甚至发生严重的疾病。因此，为了保持机体正常的生理功能，需要建立可靠和有效的方法来清除过度产生的ROS。

[0003] 目前为止，许多基于纳米材料的抗氧化剂，包括二氧化铈纳米粒子、聚多巴胺纳米粒子、石墨炔纳米粒子、铱纳米粒子、生物大分子、金属‑有机框架、氮化碳纳米片和碳纳米粒子等，已被尝试用于治疗ROS相关的损伤及疾病。其中，碳量子点是一种新型的荧光碳纳米材料，近年来因其优异的生物及光学特性而备受关注，并被广泛应用于生物感应、生物成像、药物输送及抗氧化剂等领域。例如，Zhang等人开发了一种氮和硫元素共掺杂的CDs用于减轻ROS对细胞造成的氧化应激反应(ACSAppl.Nano Mater.,2018,1,2699‑2708)。Rosenkrans等人合成了Se掺杂的CDs，证明了其抗氧化特性并将其用于肾损伤的特异性治疗(Adv.Sci.,2020,7,2000420)。Chen等人制备了碲掺杂的CDs用于消耗细胞内的ROS，并保护细胞免受H2O2侵害(Sci.Bull.,2020,65,1580‑1586)。但是这些工作中合成的CDs并没有靶向功能，不能特异性清除各细胞器中的ROS。这些工作表明CDs可减轻由ROS引起的氧化损伤，对开发基于CDs的抗氧化剂并实际应用于生物医学领域具有很好的指导作用。此外，由于ROS具有极高的反应活性和很短的半衰期，因此需要在产生ROS的区域及时清除ROS，即原位清除ROS，以减少ROS带来的伤害。基于这些原因，开发具有靶向功能的抗氧化剂就显得尤为重要。

[0004] 内质网(ER)是蛋白质合成、加工和运输以及维持体内Ca2+平衡的细胞器，也是细胞中最大的细胞器，对细胞内部环境的失衡非常敏感。当ER中过量生成ROS时，会引发ER应激反应，这种应激反应与许多代谢类疾病如糖尿病、肥胖症和胰岛素抵抗等密切相关。因此，为了保持ER的正常状态和功能，设计具有ER靶向能力的抗氧化剂，以精确清除ER区域中生产的过量ROS具有重要的生理意义。但是，目前ER靶向的抗氧化剂还未见报道。

[0005] 因此，目前急需一种对ROS有优异的清除能力的，低细胞毒性的，以及出色的ER靶向能力的探针分子。

[0034] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

[0035] 实施例1

[0036] 本实施例1提供了具有内质网靶向功能的硒掺杂碳量子点的制备。

[0037] S1、将0.1g硒代胱胺加入到40mL二次蒸馏水中并快速搅拌，待完全溶解后，将上述溶液转移至内衬为聚四氟乙烯的高压反应釜中，在200℃下加热反应2h，得到硒掺杂碳量子点。

[0038] S2、在100mL圆底烧瓶中加入20mL四氢呋喃和5mL饱和碳酸氢钠溶液，并将N‑(2‑氨基乙基)‑4‑甲基苯磺酰胺(1.0g,4.7mmol)和丙二酸甲酯酰氯(0.7g,5.1mmol)溶解于其中。将混合溶液在0℃下反应1h后，注入LiOH溶液(2M,5mL)，并在室温下再反应12h。随后通过减压蒸馏除去溶剂，得到MOA分子。其核磁氢谱及核磁碳谱如图1和图2所示。

[0039] S3、将2mg硒掺杂碳量子点加入到MOA溶液中(1.0mL,1.5mM)，随后加入50mg EDC和50mgNHS，在室温下反应12h。反应完成后，用透析法除去多余的MOA，冷冻干燥后得到MOA修饰的Se‑CDs。

[0040] 得到的MOA修饰硒掺杂碳量子点的TEM图如图3所示，量子点尺寸大小在2.4‑3.2nm之间，平均尺寸约为2.8nm。

[0041] 未改性硒掺杂碳量子点，MOA分子，以及MOA分子改性的硒掺杂碳量子点红外光谱图如图4所示，表明MOA分子成功接枝到碳量子点。

[0042] 实施例2

[0043] 本实施例2提供了验证具有内质网靶向功能的硒掺杂碳量子点的自由基清除能力和靶向能力。

[0044] 当Fe2+/H2O2加入到5,5‑二甲基‑1‑吡咯啉‑N‑氧化物(DMPO)溶液中后，检测到具有DMPO‑OH加成物的特征电子顺磁共振(EPR)信号峰，表明高浓度氢氧根自由基(·OH)的存在。用改性量子点处理后，混合物的EPR信号强度减弱，且加入改性量子点的量越多，信号减弱程度越明显，表明探针对·OH具有很好的清除效果(图5)。

[0045] 采用改性碳量子点和商业化的内质网染料ER‑Tracker Red同时对细胞处理后进行共聚焦实验来验证改性碳量子点的内质网靶向功能。如图6所示，图6A中蓝色信号对应于改性碳量子点的荧光信号，图6B中红色信号对应于ER‑Tracker Red的荧光信号，图6C为二者的叠加图。从图6C中可以看出蓝色信号和红色信号高度重合，相应的皮尔森系数为0.87(图6E)，表明改性碳量子点对内质网有很好的靶向性。图6F同样表明ER‑Se‑CDs与ER‑Tracker Red的荧光信号几乎重叠。该组荧光成像实验表明，改性碳量子点有选择地定位到ER区域。

[0046] 实施例3

[0047] 本实施例提供了改性碳量子点对小鼠体内活性氧的清除及验证的消除作用。利用佛波醇12‑十四酸酯13‑乙酸酯(PMA)对小鼠右耳表皮进行处理以诱发小鼠耳部炎症。如图7A所示，对照组小鼠的右耳(仅以2’7’‑二氯荧光素二乙酸盐(DCFH‑DA)处理)未发现明显的荧光，表明正常小鼠内ROS水平较低。当同时用DCFH‑DA和PMA处理后，小鼠右耳处产生了强烈的荧光信号，表明此过程中ROS水平的升高(图7B)。使用改性碳量子点进行皮下治疗后，发炎的耳朵的荧光信号强度急剧下降(图7C和图7D)，表明体内ROS水平的降低。该实验验证了改性碳量子点对活体体内ROS的清除能力以及消炎作用。