[0001] 本发明属于生物医药领域。具体地，本发明涉及硫酸软骨素在制备用于预防和/或治疗骨骼生长障碍及其相关疾病的药物中的用途。

[0002] 儿童和青少年身材矮小（Short Stature，SS）对许多临床医生来说仍然是一个重大挑战，因为目前可以选择的治疗方法非常有限。用重组人生长激素（rhGH）治疗已被证明可以提高生长速度，并在不同程度上提高最终成人身高（1.2至2.8英寸）。尽管迄今为止这种治疗的安全记录良好，但其高昂的费用给许多家庭带来了巨大的经济压力。此外，SS病例中病因明确的患者比例较低，每年只有少数患者得到合理的治疗，这给临床医生制定除生长激素外的准确治疗策略带来了相当大的困难。因此，对SS的根本原因进行更全面和具体的研究是非常有必要的，也是势在必行的。

[0003] 硫酸软骨素是一类糖胺聚糖，其共价连接在蛋白质上形成蛋白聚糖。硫酸软骨素广泛分布于动物组织的细胞外基质和细胞表面，糖链由交替的葡萄糖醛酸和N‑乙酰半乳糖胺聚合而成，通过一个似糖链接区连接到核心蛋白的丝氨酸残基上。在医学上主要的应用途径是作为治疗关节疾病的药品，与氨基葡萄糖配合使用，具有止痛，促进软骨再生的功效。

[0004] 身材矮小的特点是严重的身高不足。尽管发病率很高，但目前缺乏对骨骼生长发育致病因素的全面了解，而且目前没有任何含硫化合物与身高和骨骼发育的相关性的报道以及临床解决方案。

[0034] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

[0035] 以下实施例中所用的动物品种为广西巴马小型猪，其购自第三军医大学，并在中国科学院动物研究所北方大动物研究基地繁育。

[0036] 阿尔新蓝（Sigma，A5268）；茜素红S（Sigma，A5533）；anti‑CS‑56（Abcam，ab11570）；anti‑SOST（Huayun，HY‑ab242695‑50μl）。

[0037] 实施例1 硫酸软骨素（CS）对实验动物身高、体长和体重的影响

[0038] 通过对广西巴马小型猪进行ENU（N‑乙基‑N‑亚硝基脲）化学诱变试验，本发明人获得了由于骨骼发育延迟而表现出身材矮小的突变体。

[0039] 然后，本发明人对来自突变家系的随机的21个样本进行全基因组连锁分析，以揭示与突变表型分离的染色体区域。在chr18: 21‑30 Mb区域发现了一个非常显著的连锁峰。随后，本发明人选择随机的3个突变样本进行全基因组测序，发现了12个候选突变位点。通过进一步的基因功能预测分析，本发明人在12个候选基因中发现SLC13A1基因中的突变（c.139 T > A，p.W48R）为有害的错义突变（以上过程详见本发明人前期专利CN114181944B的实施例1至4）。

[0040] 之后，本发明人将以上过程获得的带有SLC13A1基因突变的小型猪作为突变组（W48R），将同品种的野生型小型猪作为野生组（WT）进行硫酸软骨素给药实验，具体过程如下：

[0041] 突变组分为突变给药组和突变对照组，分别记为CS‑W48R和VH‑W48R；野生组分为野生给药组和野生对照组，分别记为CS‑WT和VH‑WT。在1月龄CS‑W48R及CS‑WT的饲料中添加CS至6月龄，VH‑W48R和VH‑WT饲喂不添加CS的饲料。处理期覆盖了整个骨骼快速生长周期，对应于猪生长板软骨调节纵向骨生长的主要时期。本发明人测量并记录了CS‑W48R和VH‑W48R以及CS‑WT和VH‑WT的身高、体长和体重，具体实验结果如图1至3所示。

[0042] 如图1的结果所示，在突变组中，突变个体从给药的第3个月开始出现身高增加的趋势，在给药的第4个月出现了显著的身高增加。到给药的第5个月，突变给药组的身高比突变对照组增加了18.5%（**p<0.01，n=3）。令人惊讶的是，在野生组中，野生给药组的身高也比野生对照组显著增加，在给药的第5个月观察到其身高增加了12.6%（**p<0.01，n=3）。

[0043] 另外，如图2的结果所示，本发明人观察到突变给药组的体长从给药的第2个月开始有增加的趋势，在给药的第5个月与突变对照组相比显著增加了29.1%（**p<0.01，n=3）。在野生给药组和野生对照组中没有观察到类似的趋势（p>0.05，n=3）。

[0044] 此外，如图3的结果所示，本发明人没有发现突变给药组相比于突变对照组以及野生给药组相比于野生对照组的体重显著增加（p>0.05，n=3）。

[0045] 实施例2 骨骼脱钙

[0046] 在6个月给药结束后（猪6个月性成熟），对实验动物进行骨骼脱钙，以研究CS对实验动物肢骨的影响。骨组织中含有大量的钙，常规石蜡、冷冻包埋均无法正常得到切片，因此组织学上得到并展示骨组织异常的前提是良好的脱钙。脱钙过程时对时间和温度具有严格的要求，缓慢、温和的脱钙条件可以使抗原保持良好，适用于免疫组化、荧光等后续检测。该实施例的脱钙的方式为温和脱钙，具体步骤如下：

[0047] a）分别将三只突变给药组和三只突变对照组的小型猪进行深度麻醉致死，取相应部位的骨骼，放入固定液中约24小时。

[0048] b）取出骨骼放入10%（体积/体积）的EDTA（乙二胺四乙酸）脱钙液（提前于4℃冰箱预冷）中并置于4℃环境下进行脱钙，每4‑5天更换一次脱钙液。

[0049] c）每天观察骨骼，以大头针试探可轻松刺入骨骼为脱钙终点。

[0050] d）从脱钙液中取出脱钙完毕的骨骼，蒸馏水冲洗后可进行脱水。

[0051] 在脱水后对给药和未给药的突变猪的骨骼进行测量，以直接地反应骨骼的生长状况。实验结果如图4和5所示。结果显示，在CS处理的突变组中，分离后的肢骨，包括股骨、肱骨、胫骨、腓骨和桡骨的长度显著增加。

[0052] 实施例3 组织脱水、切片及染色

[0053] 1、组织脱水

[0054] 在骨骼脱钙环节完成后迅速用蒸馏水冲洗干净脱钙液，及时进行组织修块，首先通过肉眼观察定位到骨骺端生长板软骨区域，组织块以生长板位置居中最佳，大小可根据2
组织具体情况进行优化，大概1 cm左右。将组织块水平放置在包埋盒中，盖好盖子，标记清楚样品的具体信息，立即将包埋盒泡在体积分数70%的乙醇中，避免组织在空气中长时间放置而导致干燥。检查和更换组织脱水机中的各种试剂。组织脱水机的脱水的程序如下：

[0055] 1）体积分数70%的乙醇：30 min；

[0056] 2）体积分数70%的乙醇：1 h；

[0057] 3）体积分数80%的乙醇：1.5 h；

[0058] 4）体积分数95%的乙醇：1.5 h；

[0059] 5）体积分数95%的乙醇：1.5 h；

[0060] 6）体积分数100%的乙醇：2 h；

[0061] 7）体积分数100%的乙醇：2 h；

[0062] 8）体积分数50%的无水乙醇+体积分数50%的二甲苯：30 min；

[0063] 9）二甲苯：30 min；

[0064] 10）体积分数50%的二甲苯+体积分数50%的石蜡：30 min；

[0065] 11）石蜡：2.5 h；

[0066] 12）石蜡：2.5 h。

[0067] 2、组织包埋

[0068] 因组织包埋机和冷台（KD‑BL）在使用时均需设定标准温度，所以脱水结束前1 h打开上述仪器备用。包埋时使用镊子辅助摆放好组织的位置和方向，使骨骼生长板的切面正对底部，以使后期切片时能切到完整的生长板切面。石蜡温度设定为55‑60℃，包埋后缓慢移动放置在冷台上使其凝固。凝固后的蜡块置于冰箱保存。

[0069] 3、切片、摊片和烤片

[0070] a）切片前提前30 min打开冷台和摊片机（KD‑P）。

[0071] b）彻底凝固的蜡块脱去包埋盒置于提前预冷的冷台上，以防室温影响蜡块的稳定性，导致切片完整性受损。

[0072] c）使用徕卡切片机进行切片，切片过程中保持稳定匀速，设置切片厚度为5 μm，切片后用镊子协助转移至水温41℃的摊片机中展片，完全展开后用多聚赖氨酸包被的载玻片贴片，捞片后置于干净干燥处晾干水分。

[0073] d）蜡块全部切完后，将切片放置于37℃烘箱中烤片过夜。

[0074] 4、H&E染色

[0075] 将烘烤后的切片进行H&E染色。H&E染色使用两种染料的组合，即苏木精和伊红。苏木精染液呈碱性，能够将细胞核内染色质与胞浆内的核酸染成蓝色或紫色，而伊红染液呈酸性，能够将细胞质、细胞外基质中的蛋白质等染成红色或粉红色，染色操作步骤如下：

[0076] a）将切片置于载玻片上，依次在以下试剂中进行脱蜡复水处理，具体步骤如下：

[0077] 二甲苯I：10 min；

[0078] 二甲苯II：10 min；

[0079] 二甲苯III：10 min；

[0080] 体积分数100%的乙醇I：5 min；

[0081] 体积分数100%的乙醇II：5 min；

[0082] 体积分数100%的乙醇III：5 min；

[0083] 体积分数95%的乙醇I：5 min；

[0084] 体积分数95%的乙醇II：5 min；

[0085] 体积分数85%的乙醇：5 min；

[0086] 体积分数75%的乙醇：5 min；

[0087] 体积分数50%的乙醇：5 min。

[0088] b）使用1×PBS缓冲液洗涤载玻片3次，每次5 min。

[0089] c）在苏木素染液中染色10 min，水洗1 min，终止染色。

[0090] d）在分化液中10 s，水洗1 min。

[0091] e）在返蓝液中1 min，水洗1 min。

[0092] f）在伊红染液中染色2 min，水洗5 min。

[0093] g）然后依次在以下试剂中进行透明处理，具体步骤如下：

[0094] 体积分数75%的乙醇：1 min；

[0095] 体积分数85%的乙醇：1 min；

[0096] 体积分数95%的乙醇I：1 min；

[0097] 体积分数95%的乙醇II：1 min；

[0098] 二甲苯I：3 min；

[0099] 二甲苯II：3 min；

[0100] 二甲苯III：3 min。

[0101] h）从二甲苯中取出载玻片，滴加20 μl中性树胶，轻轻盖上盖玻片，避免气泡的产生，完成封片。

[0102] i）观察切片，进行拍照。

[0103] 5、组织免疫荧光染色

[0104] 1）取出备用的石蜡切片，在60℃烘箱中烘烤20 min，以防染色过程中脱片，然后室温放置10 min，接下来进行脱蜡复水，程序如上所述；

[0105] 2）配制抗原修复液（1×柠檬酸）40 ml，将步骤1）处理后的石蜡切片置于抗原修复液中，在微波炉内高火7 min至沸腾，转低火15 min，然后取出，开盖晾至室温；

[0106] 3）采用PBS洗涤4遍，每次5 min；

[0107] 4）甩净水后用纸擦干净切片上的水，用组化笔画圈，滴加50 μl封闭液（5% BSA）封闭1h。

[0108] 5）封闭结束后按照与稀释液体积比为1: 200配制一抗CS‑56稀释液及SOST稀释液，擦干净封闭液，每块组织滴加50 μl一抗，在4℃下湿盒孵育过夜；

[0109] 6）第二天从冰箱拿出复温20 min，采用PBS洗涤4次，每次5 min；

[0110] 7）然后按照与稀释液体积比为1: 200准备荧光二抗稀释液，擦干切片上的水，每块组织滴加100 μl二抗，湿盒避光孵育1h；

[0111] 8）加入按照与稀释液体积比为1: 1000配制的Hoechst 33342稀释液染核，每块组织滴加50 μl，避光染色5 min；

[0112] 9）采用PBS洗涤4次，每次5 min；然后滴加防淬灭剂封片液，小心盖上盖玻片，避光晾1‑2 h；采用Zeiss LSM780激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）下观察拍照，切片避光保存。

[0113] 6、骨骼阿尔新蓝‑茜素红S染色

[0114] 阿尔新蓝通常与软骨组织内的多阴离子基团（如酸性粘多糖的羧基和硫酸盐基）形成不溶性复合物，能够通过显现蓝色来确定硫酸化情况。

[0115] 1）软骨染色液和硬骨染色液：

[0116] 软骨染色液由阿尔新蓝、乙酸和乙醇组成，阿尔新蓝的含量为0.3%（g/mL），乙酸和乙醇的体积比为1: 4；硬骨染色液由茜素红S和氢氧化钾的水溶液组成，茜素红S的含量为0.15%（体积/体积），氢氧化钾水溶液的浓度为1%（g/mL）。

[0117] 2）大动物骨骼染色步骤如下：

[0118] a）在6个月给药结束后，将突变给药组和突变对照组的小型猪进行深度麻醉致死，然后置于65‑70℃的水中煮20‑30秒以去除皮肤、内脏组织和肌肉组织，然后用体积分数95%的乙醇清洗进一步去除皮肤、内脏组织和肌肉组织后的肢体，然后浸泡于4%（g/mL）的多聚甲醛溶液中固定72‑96 h；动物样本用双蒸水清洗6‑8 h，每次2‑3小时，以去除固定液；

[0119] b）将骨骼进行脱脂处理：将步骤a）处理后的动物样本置于4℃的丙酮中，在室温下浸泡48‑72 h；

[0120] c）将脱脂处理后的骨骼置于软骨染色液中，浸泡72‑120 h，浸泡至肉眼看出软骨区域有蓝色着色；

[0121] d）将动物样本置于体积分数为70‑75%的乙醇中6‑8 h，每2‑3 h换一次乙醇水溶液，一共进行3‑4次，以洗去浮色；然后将骨骼置于体积分数为95%的乙醇水溶液中12‑36 h以稳定着色，再将骨骼置于1%（g/mL）的KOH水溶液中72 h；

[0122] e）将骨骼置于硬骨染色液中染色，染色时间不少于48 h，染色进行至肉眼可见骨质部分染为红色，得到染色的骨骼；得到的染色的样本放置于含1重量% KOH的20%（体积/体积）甘油的溶液中浸泡72‑120 h，然后更换溶液继续浸泡，直至染色的骨骼肌肉组织呈现透明果冻状形态，以能够清晰地看到骨骼及软骨组织的着色情况；

[0123] f）将得到的骨骼放置于保存液中，保存液包含等体积的甘油和无水乙醇。

[0124] 7、番红O（Safranin O）‑固绿软骨染色

[0125] Safranin O是一种阳离子染料，可与多阴离子结合，从而显示基于阳离子染料与阴离子基团（硫酸软骨素或硫酸角蛋白）相互作用的软骨组织分布。Safranin O染色与阴离子浓度近似成正比，可间接反映基质中蛋白聚糖的含量和分布。

[0126] 染色步骤：将该实施例第3部分“切片、摊片和烤片”处理后的切片置于新鲜配制的苏木精染液中染色3‑5 min。接着采用酸性乙醇分化液分化15 s，蒸馏水洗1 min。之后在固绿染色液内浸染5 min，蒸馏水洗1 min；然后采用Safranin O染色液染色1‑2 min，蒸馏水洗1min。接着用乙酸溶液洗涤切片1‑2 min，以便去除残留的固绿，蒸馏水洗1min。接着分别用体积分数95%的乙醇、无水乙醇脱水。最后采用二甲苯透明，光学树脂封固。

[0127] 通过染色检测突变组CS处理后的变化，本发明人通过HE染色结果发现（参见图6），CS处理的突变猪生长板内的软骨细胞相对于突变对照组显著增加，特别是在静息区和增殖区。阿尔新蓝染色和番红O染色数据显示（参见图9和图10，染色越深表示硫酸化修饰越高），CS处理增加了突变猪生长板软骨的硫酸化修饰。再加上CS‑56的表达升高（参见图7，CS‑W48R组荧光强度较深），这些结果表明CS处理可以有效逆转异常的硫酸化修饰过程。此外，本发明人还发现，作为成骨过程关键标志物的SOST的表达在治疗后显著升高（参见图8，CS‑W48R组荧光强度较深）。这些数据表明，CS可以挽救由硫酸盐转运异常引起的SS，同时对正常儿童骨骼生长也有一定的促进作用。

[0128] 以上所述仅是本发明的几个示例性实施例，并非对本发明做任何形式的限制。虽然本发明以较佳的实施例揭示如上，然而其并非用以限制本发明。任何熟悉本专业的技术人员在不脱离本发明技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰获得的等同或等效实施例均属于本发明的范围。