[0001] 本发明涉及中华绒螯蟹养殖技术领域，具体涉及L‑茶氨酸在提高中华绒螯蟹生长、抗氧化和免疫性能中的应用。

[0002] L‑茶氨酸(γ‑谷氨酰胺)是一种游离氨基酸，约占茶叶干重的1‑2％。在断奶仔猪中，L‑茶氨酸通过增强肠道屏障功能来改善免疫功能。此外，在奶牛中，L‑茶氨酸可以减少外周血中的脂多糖运输，并减轻热应激时的炎症反应。此外，在肉鸡饲粮中添加L‑茶氨酸可以提高肉鸡的生长性能，并对肠道细菌产生积极影响。同时，在鸭子中，L‑茶氨酸可能通过改善免疫功能、空肠形态和抗氧化能力来提高生长性能。在大鼠中，L‑茶氨酸可以减少氧化应激、炎症和细胞损伤。L‑茶氨酸对哺乳动物中的作用研究较多，但L‑茶氨酸在甲壳类动物中的作用研究缺很少。

[0003] 中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)是中国重要的经济蟹种，风味独特，营养价值高。中华绒螯蟹产量从2004年的42.5万吨大幅增加到2023年的888629万吨。近年来，大规模养殖在这些蟹的养殖方面遇到了严重的挑战，如缺氧胁迫和各种疾病。这些疾病在很大程度上限制了螃蟹养殖的发展。目前，提高螃蟹的免疫力是螃蟹养殖业可持续发展急需解决的问题。因此，通过营养调节增强养殖螃蟹的免疫系统，提高其品质，已引起了本发明人的研究关注。

[0004] 鉴于上述缺陷，本发明创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本发明。

[0021] 以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。

[0022] 实施例中使用的L‑茶氨酸(纯度>99％)由山东齐鲁生物科技有限公司从茶叶中提取。

[0023] 螃蟹采自安徽省农业科学院水产研究所自有养殖基地。共取135只螃蟹(16.2±2.6g)，随机分为9个水箱(40×50×60cm)，每组3个重复，每个重复15只螃蟹。饲喂基础饲料
1周，以适应培养环境。使用的基本饲料列于表1。基础饲粮饲喂1周以适应培养，然后进行如图1所示的培养。

[0024] 表1基本饲料的配方和组成

[0025] 成分 含量鱼粉 34.48
菜籽粉 13.79
豆粉 26.6
小麦粉 15.76
豆油 1.97
混合维生素 1.28
矿物混合物 0.98
磷酸二氢钙 1.48
引诱剂 1.97
抗氧化剂 0.19
L‑茶氨酸 1.50
常规成分  
水 8.16
粗蛋白 41.06
粗脂肪 7.81
粗灰分 12.16

[0026] 制备时，基础饲料粉碎筛分(80目)，加入1.5％l‑茶氨酸造粒。干燥至水分含量<8.0％后，将饲料‑20℃冷藏备用。

[0027] 在饲养过程中，在水箱中放置深色蜂窝状的巢，以提供遮蔽，防止蟹之间的争斗。以蟹体体重的4％饲喂颗粒化实验饲粮，每天两次，持续8周(09:00h饲喂40％，17:30h饲喂
60％)，池内温度保持在24℃～26℃之间，pH值在7.5～7.8，溶解氧>6.5mg/L。

[0028] 一、性能指标

[0029] 暴露8周后，螃蟹饥饿24小时后采集样本。每组随机抽取10只螃蟹，在冰上麻醉15分钟，然后用无菌注射器从第三条腿的底部抽取血淋巴。在无菌手术台上采集肝胰脏和肠道组织样本，在‑80℃下冷藏，以待进一步分析。将血淋巴在4℃的冰箱中放置过夜，然后在4℃下12,000g离心10min收集上清，最后在80℃下保存用于生化分析。

[0030] 解剖取肝胰脏、肌肉、性腺，称量，‑80℃保存，用于后期化学成分、生化参数、基因表达分析。饥饿24h后计算蟹的肌肉指数(MYI，％)、肝胰脏指数(HSI，％)和促性腺指数(GSI，％)，计算公式如下:

[0031] MYI,100％＝100×肌肉重(g)/全身体重(g)

[0032] HIS,100％＝100×肝胰腺重(g)/全身体重(g)

[0033] GSI,100％＝100×性腺重(g)/全身体重(g)

[0034] 以下对比均与L0组进行对比。随着L‑茶氨酸添加时间的延长，L8组的末重(TBW)显著升高(P<0.05)，L4组无显著差异(P>0.05，表2)。饲粮中添加l‑茶氨酸显著提高了MYI(L4和L8:P<0.05)、HIS(L4:P<0.05；L8:P<0.01)和GSI(L8:P<0.05)。

[0035] 表2 1.5％ L‑茶氨酸对中华绒螯蟹生长性能的影响

[0036]项目 TBW(g) MYI(％) HIS(％) GSI(％)
a a a a
L0(0周) 85.11±6.69 24.96±2.09 8.33±0.85 2.98±1.35
a b b a
L4(4周) 87.26±6.04 27.83±3.06 9.67±1.51 3.85±1.61
b b c b
L8(8周) 90.70±6.82 28.55±1.69 10.72±0.63 4.13±2.06

[0037] 二、生化参数

[0038] 取肝胰脏样品，在0.85％生理盐水(10:1v/w)中匀浆，4℃，1500rpm离心30min,80℃保存，用于生化分析。所有指标均使用诊断试剂盒(Jiancheng Co.，Ltd.)进行分析。南京，中国)按照生产厂家说明书进行。测定肝胰腺和血清中丙二醛(MDA)含量、总抗氧化能力(T‑AOC)、总超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH‑Px)、碱性磷酸酶(ALP)和酸性磷酸酶(ACP)活性水平。

[0039] 在肝胰腺中，添加L‑茶氨酸4周后SOD和T‑AOC活性显著升高(P<0.05)，8周时极显著升高(P<0.01)。GSH‑Px活性在4周时差异不显著，在8周时差异显著(P<0.05)。ACP活性在4周和8周显著升高(P<0.05)，MDA活性在4周和8周显著降低(P<0.05，图2)，ALP活性无显著差异(P>0.05)。

[0040] 添加L‑茶氨酸4周后，血清中SOD、ACP、T‑AOC和GSH‑Px活性水平无显著差异，8周时差异显著(P<0.05)。第4、8周ALP活性显著升高(P<0.05)；然而，MDA活性没有明显变化(图3)。

[0041] 三、转录组测序与分析

[0042] 每组检测4个重复，L0、L4、L8共18个肝胰腺样本。采用Trizol萃取法从样品中提取总RNA，使用Agilent 2100生物分析仪、NanoDrop 2000c分光光度计和Qubit 2.0评估RNA质量和浓度。然后制备cDNA文库，在Illumina HiSeq 2000平台上进行转录组测序(Krasnov et al.，2021)。使用Hisat2(v2.2.1.0)和中华绒螯蟹基因组序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCF_024679095.1/)获得高质量数据。对来自基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库的功能基因注释进行汇总，并对涉及的功能分类和生物学途径进行分析和预测。

[0043] 根据制造商的方案，使用Trizol试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)提取总RNA。测序在每个文库中产生5,557,610,700‑6,947,301,600个原始reads。这些reads的质量控制产生了5,492,994,892‑6,881,177,009个有效reads，有效比>96％。经质量控制后，数据质量良好，Q20>96％，Q30>92％(表3)。随机选取的7个基因通过RT‑qPCR确认表达水平，其结果与测序结果一致，说明转录组数据准确可靠(图4)。

[0044] 表3 12个中华绒螯蟹肝胰腺文库的序列特征

[0045]

[0046]

[0047] a，对照组；L4，L‑茶氨酸添加到饲料中4周；L8，L‑茶氨酸添加到饲料中8周；b Q20，读取基数错误率<1％；

[0048] c Q30，读取基数错误率<0.1％；

[0049] d GC，鸟嘌呤胞嘧啶含量。

[0050] 此外，根据鉴定的DEGs进行差异分析。结果显示，共有121个DEGs(L0‑vs‑L4:101个上调，20个下调)和5174个DEGs(L0‑vs‑L8:5073个上调，203个下调)(|logFC|≥1,P≤0.05)(图5A、B、C)。此外，共有50个DEGs,L0‑vs‑L4组和L0‑vs‑L8组分别有71个和5226个DEGs(图5D)。

[0051] GO分类是由分子功能、细胞成分和生物过程三个本体组成的综合性基因功能分类系统。在这种情况下，相关的生物学过程包括细胞过程、代谢过程、定位、对刺激的反应等代谢过程(图6)。同时，L0‑vs‑L4组与L0‑vs‑L8组在功能上存在显著差异，后者的亚类更多；L0‑vs‑L4组有20个亚类，L0‑vs‑L8组有22个亚类。

[0052] KEGG富集分析表明，DEG富集功能在L0‑vs‑L4和L0‑vs‑L8中的分布是一致的(图7)。两组的DEG集中在代谢、人类疾病、有机体系统、遗传信息处理、细胞过程和环境信息处理6个KEGG类别中；其中大部分集中在global map、overview map，以及碳水化合物、脂质、氨基酸、辅因子、维生素等氨基酸代谢，以及聚糖的生物合成与代谢。L0‑vs‑L4组显著富集的前20条信号通路有4类注释(代谢、机体系统和人类疾病)(图8A)。其中，代谢途径(ko01100)、抗坏血酸和醛酸盐代谢途径(ko00053)、酪氨酸代谢途径(ko00350)和类固醇激素生物合成途径(ko00140)富集最为显著。相比之下，在L0‑vs‑L8组中，Top20显著富集的信号通路被更多种类的细胞过程和遗传信息加工注释(图8B)。

[0053] 四、肠道微生物分析

[0054] 使用HiPure StoolDNA试剂盒(D3141，广州，明治，中国)按照制造商的说明书提取中华乳杆菌的肠道微生物DNA。用1％琼脂糖凝胶测定DNA的纯度和浓度，稀释至1μg/μL。随后，利用引物341F(5'‑CCT AYG GGR BGC ASC G‑3')和806R(5'‑GGA CTA CNN GGG TAT CTA AT‑3')扩增细菌16S rRNA基因的V3‑V4高变区，其中包括条形码。广州Genedenovo生物技术有限公司采用Illumina Nova Seq平台和300bp对端reads靶向细菌16S rRNA基因V3‑V4高变区。

[0055] PCoAβ‑多样性分析显示，三组(L0,L4和L8)之间存在显著差异，根据单因素方差分析(OUT:R＝0.5056,P＝0.001；物种:R＝0.4809,P＝0.001；图9A,B)，表明微生物区系组成差异显著。相比之下，α多样性指数没有差异(Sobs:P＝0.4797；Simpson:P＝0.05678；香农:P＝0.05022；Chao:P＝0.6545；图8C,D,E和F)，表明微生物群丰度没有显著差异。维恩图显示，雌性中华绒螯蟹肠道菌群的otu分别为627、619和598个。其中otu 318例，占51.73％(图
9)。

[0056] 在补充l‑茶氨酸4周和8周后，雌中华赤霉素在门(图10A)和属(图10B)水平上的肠道菌群结构和组成发生了显著变化。丰度最高的8个门分别是厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、梭菌门、放线菌门、弯曲菌门、Patescibacteria门和氯氟菌门。丰度最高的8个属分别是Candidatus_Hepatoplasma、Candidatus_Bacilloplasma、Fusobacterium、Acinetobacter、Bacteroides、Paracoccus、ZOR0006和Citrobacter。在属水平上，随着l‑茶氨酸添加时间的延长，Candidatus_Hepatoplasma和ZOR0006的细菌群落丰度显著降低，而不动杆菌、柠檬酸杆菌、乳球菌、大球菌、希瓦氏菌和myroide细菌的丰度显著增加(图10C)。PICRUSt2功能预测结果显示，丰度较高的细菌的功能类别为：代谢途径、次生代谢物生物合成、不同环境下的微生物代谢、氨基酸生物合成和碳代谢(图10D)。

[0057] 五、定量PCR

[0058] 采用TRIzol法提取肝胰脏样品的总RNA。随机选取7个DEGs，用qPCR方法验证其相对表达量。7个DEGs(SLC37A4、Tret1、phc‑2、Bhmt、Agmo、Ahcy13、Gale)的引物序列见表4。采‑ΔΔCt用2 法计算相对表达量，以β‑actin作为内源性内控。

[0059] 表4qPCR中使用的引物序列

[0060]

[0061]

[0062] 综上所述，L‑茶氨酸对生物体的作用不仅与其剂量有关，而且与暴露时间有关，本发明中，中华绒螯蟹增重呈增加趋势，且呈L‑茶氨酸时间依赖性(4周:P>0.05；8周:P<0.05)，饲粮中添加L‑茶氨酸提高了中华绒螯蟹的MYI(4周和8周)、HIS(4周和8周)和GSI(8周)，由此可见，饲粮中添加L‑茶氨酸具有时间依赖性的正累积效应，饲粮中添加适量的L‑茶氨酸对中华绒螯蟹的生长性能有积极影响。

[0063] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。