首页 / L-茶氨酸在促进中华绒螯蟹生长、抗氧化和提高免疫性能中的应用

L-茶氨酸在促进中华绒螯蟹生长、抗氧化和提高免疫性能中的应用实质审查 发明

技术领域

[0001] 本发明涉及中华绒螯蟹养殖技术领域,具体涉及L‑茶氨酸在提高中华绒螯蟹生长、抗氧化和免疫性能中的应用。

相关背景技术

[0002] L‑茶氨酸(γ‑谷氨酰胺)是一种游离氨基酸,约占茶叶干重的1‑2%。在断奶仔猪中,L‑茶氨酸通过增强肠道屏障功能来改善免疫功能。此外,在奶牛中,L‑茶氨酸可以减少外周血中的脂多糖运输,并减轻热应激时的炎症反应。此外,在肉鸡饲粮中添加L‑茶氨酸可以提高肉鸡的生长性能,并对肠道细菌产生积极影响。同时,在鸭子中,L‑茶氨酸可能通过改善免疫功能、空肠形态和抗氧化能力来提高生长性能。在大鼠中,L‑茶氨酸可以减少氧化应激、炎症和细胞损伤。L‑茶氨酸对哺乳动物中的作用研究较多,但L‑茶氨酸在甲壳类动物中的作用研究缺很少。
[0003] 中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)是中国重要的经济蟹种,风味独特,营养价值高。中华绒螯蟹产量从2004年的42.5万吨大幅增加到2023年的888629万吨。近年来,大规模养殖在这些蟹的养殖方面遇到了严重的挑战,如缺氧胁迫和各种疾病。这些疾病在很大程度上限制了螃蟹养殖的发展。目前,提高螃蟹的免疫力是螃蟹养殖业可持续发展急需解决的问题。因此,通过营养调节增强养殖螃蟹的免疫系统,提高其品质,已引起了本发明人的研究关注。
[0004] 鉴于上述缺陷,本发明创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本发明。

具体实施方式

[0021] 以下结合附图,对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。
[0022] 实施例中使用的L‑茶氨酸(纯度>99%)由山东齐鲁生物科技有限公司从茶叶中提取。
[0023] 螃蟹采自安徽省农业科学院水产研究所自有养殖基地。共取135只螃蟹(16.2±2.6g),随机分为9个水箱(40×50×60cm),每组3个重复,每个重复15只螃蟹。饲喂基础饲料
1周,以适应培养环境。使用的基本饲料列于表1。基础饲粮饲喂1周以适应培养,然后进行如图1所示的培养。
[0024] 表1基本饲料的配方和组成
[0025] 成分 含量鱼粉 34.48
菜籽粉 13.79
豆粉 26.6
小麦粉 15.76
豆油 1.97
混合维生素 1.28
矿物混合物 0.98
磷酸二氢钙 1.48
引诱剂 1.97
抗氧化剂 0.19
L‑茶氨酸 1.50
常规成分  
水 8.16
粗蛋白 41.06
粗脂肪 7.81
粗灰分 12.16
[0026] 制备时,基础饲料粉碎筛分(80目),加入1.5%l‑茶氨酸造粒。干燥至水分含量<8.0%后,将饲料‑20℃冷藏备用。
[0027] 在饲养过程中,在水箱中放置深色蜂窝状的巢,以提供遮蔽,防止蟹之间的争斗。以蟹体体重的4%饲喂颗粒化实验饲粮,每天两次,持续8周(09:00h饲喂40%,17:30h饲喂
60%),池内温度保持在24℃~26℃之间,pH值在7.5~7.8,溶解氧>6.5mg/L。
[0028] 一、性能指标
[0029] 暴露8周后,螃蟹饥饿24小时后采集样本。每组随机抽取10只螃蟹,在冰上麻醉15分钟,然后用无菌注射器从第三条腿的底部抽取血淋巴。在无菌手术台上采集肝胰脏和肠道组织样本,在‑80℃下冷藏,以待进一步分析。将血淋巴在4℃的冰箱中放置过夜,然后在4℃下12,000g离心10min收集上清,最后在80℃下保存用于生化分析。
[0030] 解剖取肝胰脏、肌肉、性腺,称量,‑80℃保存,用于后期化学成分、生化参数、基因表达分析。饥饿24h后计算蟹的肌肉指数(MYI,%)、肝胰脏指数(HSI,%)和促性腺指数(GSI,%),计算公式如下:
[0031] MYI,100%=100×肌肉重(g)/全身体重(g)
[0032] HIS,100%=100×肝胰腺重(g)/全身体重(g)
[0033] GSI,100%=100×性腺重(g)/全身体重(g)
[0034] 以下对比均与L0组进行对比。随着L‑茶氨酸添加时间的延长,L8组的末重(TBW)显著升高(P<0.05),L4组无显著差异(P>0.05,表2)。饲粮中添加l‑茶氨酸显著提高了MYI(L4和L8:P<0.05)、HIS(L4:P<0.05;L8:P<0.01)和GSI(L8:P<0.05)。
[0035] 表2 1.5% L‑茶氨酸对中华绒螯蟹生长性能的影响
[0036]项目 TBW(g) MYI(%) HIS(%) GSI(%)
a a a a
L0(0周) 85.11±6.69 24.96±2.09 8.33±0.85 2.98±1.35
a b b a
L4(4周) 87.26±6.04 27.83±3.06 9.67±1.51 3.85±1.61
b b c b
L8(8周) 90.70±6.82 28.55±1.69 10.72±0.63 4.13±2.06
[0037] 二、生化参数
[0038] 取肝胰脏样品,在0.85%生理盐水(10:1v/w)中匀浆,4℃,1500rpm离心30min,80℃保存,用于生化分析。所有指标均使用诊断试剂盒(Jiancheng Co.,Ltd.)进行分析。南京,中国)按照生产厂家说明书进行。测定肝胰腺和血清中丙二醛(MDA)含量、总抗氧化能力(T‑AOC)、总超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH‑Px)、碱性磷酸酶(ALP)和酸性磷酸酶(ACP)活性水平。
[0039] 在肝胰腺中,添加L‑茶氨酸4周后SOD和T‑AOC活性显著升高(P<0.05),8周时极显著升高(P<0.01)。GSH‑Px活性在4周时差异不显著,在8周时差异显著(P<0.05)。ACP活性在4周和8周显著升高(P<0.05),MDA活性在4周和8周显著降低(P<0.05,图2),ALP活性无显著差异(P>0.05)。
[0040] 添加L‑茶氨酸4周后,血清中SOD、ACP、T‑AOC和GSH‑Px活性水平无显著差异,8周时差异显著(P<0.05)。第4、8周ALP活性显著升高(P<0.05);然而,MDA活性没有明显变化(图3)。
[0041] 三、转录组测序与分析
[0042] 每组检测4个重复,L0、L4、L8共18个肝胰腺样本。采用Trizol萃取法从样品中提取总RNA,使用Agilent 2100生物分析仪、NanoDrop 2000c分光光度计和Qubit 2.0评估RNA质量和浓度。然后制备cDNA文库,在Illumina HiSeq 2000平台上进行转录组测序(Krasnov et al.,2021)。使用Hisat2(v2.2.1.0)和中华绒螯蟹基因组序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCF_024679095.1/)获得高质量数据。对来自基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库的功能基因注释进行汇总,并对涉及的功能分类和生物学途径进行分析和预测。
[0043] 根据制造商的方案,使用Trizol试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)提取总RNA。测序在每个文库中产生5,557,610,700‑6,947,301,600个原始reads。这些reads的质量控制产生了5,492,994,892‑6,881,177,009个有效reads,有效比>96%。经质量控制后,数据质量良好,Q20>96%,Q30>92%(表3)。随机选取的7个基因通过RT‑qPCR确认表达水平,其结果与测序结果一致,说明转录组数据准确可靠(图4)。
[0044] 表3 12个中华绒螯蟹肝胰腺文库的序列特征
[0045]
[0046]
[0047] a,对照组;L4,L‑茶氨酸添加到饲料中4周;L8,L‑茶氨酸添加到饲料中8周;b Q20,读取基数错误率<1%;
[0048] c Q30,读取基数错误率<0.1%;
[0049] d GC,鸟嘌呤胞嘧啶含量。
[0050] 此外,根据鉴定的DEGs进行差异分析。结果显示,共有121个DEGs(L0‑vs‑L4:101个上调,20个下调)和5174个DEGs(L0‑vs‑L8:5073个上调,203个下调)(|logFC|≥1,P≤0.05)(图5A、B、C)。此外,共有50个DEGs,L0‑vs‑L4组和L0‑vs‑L8组分别有71个和5226个DEGs(图5D)。
[0051] GO分类是由分子功能、细胞成分和生物过程三个本体组成的综合性基因功能分类系统。在这种情况下,相关的生物学过程包括细胞过程、代谢过程、定位、对刺激的反应等代谢过程(图6)。同时,L0‑vs‑L4组与L0‑vs‑L8组在功能上存在显著差异,后者的亚类更多;L0‑vs‑L4组有20个亚类,L0‑vs‑L8组有22个亚类。
[0052] KEGG富集分析表明,DEG富集功能在L0‑vs‑L4和L0‑vs‑L8中的分布是一致的(图7)。两组的DEG集中在代谢、人类疾病、有机体系统、遗传信息处理、细胞过程和环境信息处理6个KEGG类别中;其中大部分集中在global map、overview map,以及碳水化合物、脂质、氨基酸、辅因子、维生素等氨基酸代谢,以及聚糖的生物合成与代谢。L0‑vs‑L4组显著富集的前20条信号通路有4类注释(代谢、机体系统和人类疾病)(图8A)。其中,代谢途径(ko01100)、抗坏血酸和醛酸盐代谢途径(ko00053)、酪氨酸代谢途径(ko00350)和类固醇激素生物合成途径(ko00140)富集最为显著。相比之下,在L0‑vs‑L8组中,Top20显著富集的信号通路被更多种类的细胞过程和遗传信息加工注释(图8B)。
[0053] 四、肠道微生物分析
[0054] 使用HiPure StoolDNA试剂盒(D3141,广州,明治,中国)按照制造商的说明书提取中华乳杆菌的肠道微生物DNA。用1%琼脂糖凝胶测定DNA的纯度和浓度,稀释至1μg/μL。随后,利用引物341F(5'‑CCT AYG GGR BGC ASC G‑3')和806R(5'‑GGA CTA CNN GGG TAT CTA AT‑3')扩增细菌16S rRNA基因的V3‑V4高变区,其中包括条形码。广州Genedenovo生物技术有限公司采用Illumina Nova Seq平台和300bp对端reads靶向细菌16S rRNA基因V3‑V4高变区。
[0055] PCoAβ‑多样性分析显示,三组(L0,L4和L8)之间存在显著差异,根据单因素方差分析(OUT:R=0.5056,P=0.001;物种:R=0.4809,P=0.001;图9A,B),表明微生物区系组成差异显著。相比之下,α多样性指数没有差异(Sobs:P=0.4797;Simpson:P=0.05678;香农:P=0.05022;Chao:P=0.6545;图8C,D,E和F),表明微生物群丰度没有显著差异。维恩图显示,雌性中华绒螯蟹肠道菌群的otu分别为627、619和598个。其中otu 318例,占51.73%(图
9)。
[0056] 在补充l‑茶氨酸4周和8周后,雌中华赤霉素在门(图10A)和属(图10B)水平上的肠道菌群结构和组成发生了显著变化。丰度最高的8个门分别是厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、梭菌门、放线菌门、弯曲菌门、Patescibacteria门和氯氟菌门。丰度最高的8个属分别是Candidatus_Hepatoplasma、Candidatus_Bacilloplasma、Fusobacterium、Acinetobacter、Bacteroides、Paracoccus、ZOR0006和Citrobacter。在属水平上,随着l‑茶氨酸添加时间的延长,Candidatus_Hepatoplasma和ZOR0006的细菌群落丰度显著降低,而不动杆菌、柠檬酸杆菌、乳球菌、大球菌、希瓦氏菌和myroide细菌的丰度显著增加(图10C)。PICRUSt2功能预测结果显示,丰度较高的细菌的功能类别为:代谢途径、次生代谢物生物合成、不同环境下的微生物代谢、氨基酸生物合成和碳代谢(图10D)。
[0057] 五、定量PCR
[0058] 采用TRIzol法提取肝胰脏样品的总RNA。随机选取7个DEGs,用qPCR方法验证其相对表达量。7个DEGs(SLC37A4、Tret1、phc‑2、Bhmt、Agmo、Ahcy13、Gale)的引物序列见表4。采‑ΔΔCt用2 法计算相对表达量,以β‑actin作为内源性内控。
[0059] 表4qPCR中使用的引物序列
[0060]
[0061]
[0062] 综上所述,L‑茶氨酸对生物体的作用不仅与其剂量有关,而且与暴露时间有关,本发明中,中华绒螯蟹增重呈增加趋势,且呈L‑茶氨酸时间依赖性(4周:P>0.05;8周:P<0.05),饲粮中添加L‑茶氨酸提高了中华绒螯蟹的MYI(4周和8周)、HIS(4周和8周)和GSI(8周),由此可见,饲粮中添加L‑茶氨酸具有时间依赖性的正累积效应,饲粮中添加适量的L‑茶氨酸对中华绒螯蟹的生长性能有积极影响。
[0063] 以上所述仅为本发明的较佳实施例,对本发明而言仅仅是说明性的,而非限制性的。本专业技术人员理解,在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变,修改,甚至等效,但都将落入本发明的保护范围内。

当前第1页 第1页 第2页 第3页
相关技术
中华绒相关技术
促进中华相关技术
杨敏发明人的其他相关专利技术