[0001] 本发明涉及食品检测技术领域，具体涉及一种牛奶中大肠杆菌O157:H7快速检测试剂盒及其检测方法。

[0002] 大肠杆菌(E.coli O157:H7)是一种常见的食源性病原体，是肠出血性大肠杆菌中最具代表的血清型，属革兰氏阴性菌；大肠杆菌(E.coli O157:H7)无芽孢、形状短小且两端钝圆，散在或成对存在，大多数菌株以周生鞭毛运动，不耐高温，具有较强的耐酸性，最适生长和繁殖温度为37℃，超过了45℃不能生长，此类菌株在世界范围内经常引起人类胃肠道疾病的流行性爆发，并伴有血性腹泻，最常通过粪口途径传播，通常与食用受污染的碎牛肉，饮用受污染的牛奶等有关。

[0004] 现有技术中，检测大肠杆菌(E.coli O157:H7)常用的方法有琼脂平板培养、聚合酶链式反应（PCR）、电化学发光法（ECL）、表面等离子体共振（SPR）等方法，但这些方法都存在着一定的弊端，例如，琼脂平板培养费时费力，可能会延误患者治疗、聚合酶链式反应（PCR）需要裂解病原体以释放核酸进行扩增、电化学发光法（ECL）和表面等离子体共振（SPR）因其昂贵的仪器及其难以满足现场快速检测的要求使其难以推广应用，因此，亟需建立一种快速有效的检测大肠杆菌(E.coli O157:H7)的方法。

[0019] 实施例1梯度稀释的菌液的制备方法如下：
S1：培养基的配制：
液体培养基（g/L）：酵母提取粉5.0 g，胰蛋白胨10 g，氯化钠10 g，依次加入到装有适量去离子水的1 L试剂瓶中，溶解充分后用2 wt% NaOH溶液调节pH至7.00 ± 0.02，加入去离子水定容到刻度1000 mL，摇匀后将盖子拧松，放入高温灭菌锅中，在120℃条件下灭菌处理20 min；
琼脂培养基（g/L）：酵母提取粉5.0 g，胰蛋白胨10 g，氯化钠10 g，依次加入到装有适量去离子水的1 L试剂瓶中，溶解充分后用2 wt%的氢氧化钠溶液调节pH至7.00 ± 
0.02，加入去离子水定容到刻度1000 mL，摇匀后静置，再称取15 g琼脂添加到试剂瓶中，将盖子拧松，放入高温灭菌锅中，在120℃条件下灭菌处理20 min。

[0020] S2：倒板：将生物安全柜的台面用酒精棉擦拭干净，然后将一次性培养皿放入生物安全柜中，开启紫外灯杀菌30 min，通风15 min。待灭菌锅温度降低到90℃时取出琼脂培养基，准备铺板，在生物安全柜中提前将一次性培养皿依次摆放整齐，然后将琼脂培养基趁热倒入培养皿中，倒入量为培养皿体积的二分之一左右，待全部倒完后，盖盖时首先将酒精灯点上，盖子过火，将盖子盖到培养皿的三分之二，完成该操作后，紫外30 min，再通风5 min。待培养皿中培养基全部凝固后合盖，在4‑7℃条件下储存备用。

[0021] S3：菌液的制备（1）活化菌种：确保生物安全柜中的使用物品全部无菌，包括琼脂培养板和移液枪枪头，开启紫外灯紫外灭菌30 min，通风15 min。从‑80℃的超低温冰箱中快速取出菌种，用无菌接种环从保菌管中挑取微量大肠杆菌O157:H7菌液在固体培养板上划线，然后迅速将保菌管封好放入冰箱中，将划线过的培养板倒置在37℃的恒温培养箱中恒温培养12 h；
（2）扩大培养：高温灭菌锅的液体培养基放入生物安全柜中紫外灭菌，等其降温降至室温，取出10 mL已灭菌摇菌管，量取5 mL灭菌后的液体培养基于10 mL的离心管中，再用接种环挑取一个单菌落放入上述离心管中，然后将其放入37℃的恒温摇床里，以200 rpm/min的速度振荡培养12 h，取200 μL上述大肠杆菌O157:H7菌液加到20 mL的液体培养基中，继续在37℃的摇床中振荡培养3.5 h左右。将所得的菌液密封放入5℃的冰箱中冷藏备用；
（3）逐级稀释：首先，准备若干个已灭过菌的1.5 mL的离心管，吸取900 μL的灭菌超纯水加入其中，将扩大培养的菌液摇晃均匀后用移液枪从原菌液中吸取100 μL的菌液加入到上述1.5 mL的离心管中，用移液枪反复吸吹20‑25次，将菌液和灭菌超纯水混合均匀，从此离心管中继续吸取100 μL菌液，加入到下一个含有900 μL灭菌超纯水溶液的1.5 mL离心管中，继续重复上述操作7次，依次得到梯度稀释的菌液。

[0022] 实施例2DNA链的活化处理：单链发夹结构HP1、发夹结构HP2是标记有巯基（‑SH）基团，核酸适配体aptamer是一段长链DNA高级结构，可以特异性识别靶标菌，使用前，需要对它们进行变性‑复性反应的活化处理，将发夹结构HP1、发夹结构HP2和核酸适配体aptamer分别用超纯水稀释到一定浓度，放入95℃高温水浴锅，5 min之后拿出来进行自然降温1 h之后进行使用。

[0023] 实施例3磁珠MBs的预处理：将250uL 20mg/mL的磁珠DMSO溶液，用500 uL偶联液（0.1M PBS缓冲液，1mM EDTA，pH=8.5）和淋洗液（0.1%吐温‑20，pH=7.4）分别交替淋洗，磁液分离，重复三次，然后加入500 uL偶联液重悬，随后转移至低吸附离心管内，4℃冷藏备用。

[0024] 实施例4靶标菌特异性识别元件MBs‑T‑apt溶液制备：
靶标菌特异性识别元件MBs‑T‑ap溶液的制备原理（图1）：向预处理后的磁珠MBs（500 uL，10 mg/mL）中加入核酸引物链Trigger (1 uL，100 uM )，将低吸附离心管放入恒温摇床中，恒温25℃ 250 rpm/min震荡孵育12h，保持磁珠MBs分散，防止磁珠MBs沉淀或者挂壁，得到磁珠‑核酸引物链MBs‑T。将磁珠‑核酸引物链MBs‑T分别用1 mL偶联液（0.1M PBS缓冲液，1mM EDTA，pH=8.5）和淋洗液（0.1%吐温‑20，pH=7.4）交替淋洗，磁性分离，重复此过程两次，以去除磁珠MBs表面的非特异性结合和非共价键结合的引物链和自由游离的引物链，然后加入500 uL pH=7.4的PBS缓冲液重悬；向处理好的磁珠‑核酸引物链MBs‑T中按摩尔比1:1加入活化的核酸适配体aptamer（1 uL，100 uM），恒温25℃ 250 rpm/min震荡孵育2 h，孵育结束后，重复上述淋洗操作，制得靶标菌特异性识别元件MBs‑T‑apt溶液，4℃冷藏备用。

[0025] 实施例5铂纳米粒子Pt NPs溶液的制备：在25℃恒温水浴中，向盛有38 mL超纯水的圆底烧瓶中加入1 mL 16 mM的氯铂酸溶液和1 mL 40 mM的柠檬酸钠溶液，搅拌30 min，再用注射器逐滴加入0.2 mL新鲜配制的50 mM的硼氢化钠，搅拌1 h，制备完成后，样品封口避光保存于4℃冰箱中待用。

[0026] 铂纳米粒子Pt NPs纯化与浓缩：将制备的铂纳米粒子Pt NPs溶液用0.22 μm滤膜过滤，然后将滤液加入到10 kDa的超滤管中，5900 rpm/min超滤20 min，再转移至30 kDa的超滤管中4000 rpm/min超滤7 min，将超滤管中溶液倒入低吸附离心管中备用。用紫外可见分光光度计测铂纳米粒子Pt NPs的紫外可见吸收光谱，得到其在550nm处的吸光度，再根据公式（ln(Ɛ) = kln(D) + b，Ɛ是摩尔消光系数，D是铂纳米粒子Pt NPs样品的平均粒径，单位为纳米（nm），k和b是常数，k=‑0.16，b=1.77）计算出准确的铂纳米粒子Pt NPs浓度。

[0027] 实施例6Pt‑HPs溶液的制备：向1.7 mg/mL的Pt‑HPs溶液中加入活化的发夹结构HP1、HP2（40 μL，1282 nM），恒温25℃1200 rpm/min孵育2 h，然后使用超纯水在30 KDa超滤管中（4000 rpm/min、7min）超滤，再用PBS缓冲液（pH=7.4）置换两次，最后用pH=7.4的PBS缓冲液重悬，4℃冷藏保存。

[0028] 实施例7（1）磁珠MBs和磁珠‑核酸引物链MBs‑T的磁性分离性能表征：
磁珠MBs在水溶液中具有良好的分散性，溶液呈橙红色，外磁场作用下磁珠MBs在
10 s内即可实现完全分离，磁珠‑核酸引物链MBs‑T在10‑15 s内可实现完全分离，具有良好的磁分离性能，如图2A所示。

[0029] （2）磁珠MBs和磁珠‑核酸引物链MBs‑T的Zeta电位、FT‑IR和水合粒径表征：Zeta电位能够表征粒子表面的带电情况，如图2B所示，核酸引物链Trigger修饰前与修饰后的磁珠MBs分散在去离子水中的Zeta电势从‑18.61 mV降低到‑25.42 mV，这是由于DNA分子上的磷酸残基带负电，表明了核酸引物链Trigger成功修饰在磁珠MBs粒子表面。

[0030] FT‑IR图谱（图2C）在566 cm‑1、469 cm‑1处的特征峰与Fe‑O键的振动峰有关，‑1 ‑1 2‑ ‑12923cm 、2850cm 为次甲基（‑CH）和亚甲基（‑CH ）伸缩振动峰，1610 cm 为苯环骨架的特‑1
征吸收峰，证明了磁珠MBs由一层聚苯乙烯包覆，保证了其化学性质的稳定；在957 cm 的特‑1
征峰与环氧基团有关，磁珠‑核酸引物链MBs‑T在957cm 处没有明显的环氧基特征峰，表明了核酸引物链Trigger 5‘端修饰的胺基与环氧基发生开环反应，形成稳定的化学键，表明核酸引物链Trigger成功修饰到MBs纳米粒子表面。

[0031] 从DLS测试（图2D）结果可以看出磁珠‑核酸引物链MBs‑T的水合粒径比磁珠MBs大，这也表明了核酸引物链Trigger成功修饰在MBs纳米粒子表面。

[0032] （3）铂纳米粒子Pt NPs的表征：使用氯铂酸通过水热法合成的铂纳米粒子Pt NPs粒径越大，颜色越深，本发明所合成的铂纳米粒子Pt NPs溶液呈淡淡的棕褐色，颜色较深，如图3A所示；采用TEM分析了铂纳米粒子Pt NPs的粒径、形貌及表面形态特征，如图3B所示，图3B的TEM图中观察到铂纳米粒子Pt NPs的形状呈现为球状，粒径大小在3‑5 nm之间，这是因为反应所加入的NaBH4强还原性使铂纳米粒子Pt NPs成核过程十分迅速，这也是各向异性生长几率非常小的原因，以上表征说明了铂纳米粒子Pt NPs的成功合成。

[0033] 使用紫外‑可见分光光度计（UV‑vis）在200‑800 nm范围内扫描铂纳米粒子Pt NPs谱图，如图3C所示，随着波长的减小吸光度不断增大，曲线呈平滑上升趋势，符合传统的铂纳米粒子Pt NPs吸收光谱，得到其在550nm处的吸光度，根据公式（ln(Ɛ) = kln(D) + b，Ɛ是摩尔消光系数，D是铂纳米粒子Pt NPs样品的平均粒径，单位为纳米，k和b是常数，k=‑0.16，b=1.77）计算出准确的铂纳米粒子Pt NPs浓度。

[0034] 同时，为了定性表征DNA成功修饰了铂纳米粒子Pt NPs，采用动态光散射仪对DNA修饰前后铂纳米粒子Pt NPs水合粒径的变化进行了测定，如图3D所示，经DNA修饰的铂纳米粒子Pt NPs相较于未被修饰的铂纳米粒子Pt NPs粒径均发生了明显的增大，水合粒径的增大证明了DNA已成功地修饰了铂纳米粒子Pt NPs。

[0035] 实施例8大肠杆菌O157:H7检测原理：如图4A所示，当检测体系中存在靶标菌E. coil 
O157:H7时，靶标菌特异性识别元件MBs‑T‑apt中的适配体apt会迅速与O157:H7表面的膜蛋白特异性结合，发生自我折叠，从而释放出磁珠‑核酸引物链MBs‑T，接着通过磁铁分离，弃掉上清液。加入铂纳米粒子标记的DNA发夹Pt‑HP1、Pt‑HP2溶液，则磁珠‑核酸引物链MBs‑T会迅速使得发夹Pt‑HP1链打开并与Pt‑HP1的粘性末端结合并发生分支迁移，Pt‑HP1新暴露的结构域将充当另一个引物链作用，使得发夹Pt‑HP2链打开并与其粘性末端相互作用配对，然后Pt‑HP2新暴露的结构域启动又将使得发夹Pt‑HP1打开，如此循环发生DNA发夹的打开和配对，即发生典型的杂交链式反应（HCR），形成了富集有催化活性铂纳米粒子Pt NPs DNA聚合物，然后向检测体系中注射H2O2，其则被铂纳米粒子Pt NPs催化产生氧气，从而在密闭体系中产生气压；并且，随着检测体系中的大肠杆菌O157:H7含量越多，释放的磁珠‑核酸引物链MBs‑T越多，体系中因HCR反应产生的富集有催化活性铂纳米粒子Pt NPs DNA聚合物越多，从而催化产生的氧气越多，产生的气压信号值越大，因而根据大肠杆菌O157:H7浓度与气压信号值强度变化值之间的关系可以实现大肠杆菌O157:H7的定量检测。

[0036] 大肠杆菌O157:H7检测具体方法为：步骤1：准备若干个已灭菌的1.5 mL离心管，加入900 μL灭菌超纯水，再将扩大培养的大肠杆菌O157:H7菌液摇晃均匀后吸取100 μL加入到上述1.5 mL的离心管中，用移液枪反复吸吹20‑25次，将大肠杆菌O157:H7菌液和灭菌超纯水混合均匀，以此操作逐级稀释，得到系列浓度菌标准溶液（详细方法可参照实施例1）。取50 uL不同浓度的大肠杆菌O157:
0 1 2 3 4 5 6 7
H7（10 、10 、10 、10 、10 、10、10 、10 CFU/mL）、50 uL靶标菌特异性识别元件MBs‑T‑apt（200 nM）、200 uL pH=7.4的灭菌PBS缓冲液混合，同时以加入50 uL PBS缓冲液代替大肠杆菌O157:H7菌液的样品作为对照，恒温37℃、230 rpm/min恒温水浴摇床内震荡孵育45 min。

[0037] 步骤2：孵育结束后磁分离，弃上清液，加入300 uL PBS缓冲液并置于涡旋仪上震荡并进行磁分离，重复三次后加入200 uL PBS缓冲液重悬。

[0038] 步骤3：向步骤二产物中加入40 uL Pt‑HPs溶液（1282 nM），恒温37℃、250 rpm/min摇床孵育1 h，孵育结束后，将样品转移至螺纹口反应瓶中，磁分离，弃掉上清液，使用注射器将100 uL 30% H2O2加入瓶内，迅速拧紧盖子并插入压差计，读数并记录反应10 min时所产生的气压信号值，通过得到的气压信号值大小与菌液浓度关系，建立标准曲线，计算检测限，每种菌液浓度做三次平行实验。结果见图5，图5A显示在体系中加入不同浓度大肠杆菌O157:H7后气压值信号强度随着大肠杆菌O157:H7浓度逐渐增强，检测线性相关性如图5B1 7
所示，大肠杆菌O157:H7浓度在10‑10CFU/mL浓度范围内呈良好的线性关系，线性方程为：y
2
=20.80151x‑8.38177，R=0.98957；根据公式：LOD=Mean+3×SD（Mean是阴性样本所对应的
1
气压平均值，SD是阴性样本12次重复的标准偏差）计算出该检测方法的检出限为2.1×10 CFU/mL。

[0039] 实施例9利用实施例8的检测方法对大肠杆菌O157:H7进行检测，以Escherichia coli 
O157:H7作为靶标细菌大肠杆菌O157:H7，以Staphylococcus aureus金黄色葡萄球菌、Salmonella typhimurium鼠伤寒沙门氏菌、Pseudomonas aeruginosa铜绿假单胞菌作为其余竞争细菌，以PBS缓冲液，作为对照组。

[0040] 大肠杆菌O157:H7的浓度是106 CFU/mL、其余竞争细菌的浓度均为106 CFU/mL,如6
图6所示，10 CFU/mL大肠杆菌O157:H7可以使气压信号值显著增强，相比对照组（PBS缓冲液）增强约10倍，而其它竞争细菌与对照组相比，均未引起明显的气压信号值变化，这是因为大肠杆菌O157:H7适配体只对大肠杆菌O157:H7具有高特异性和亲和力，对其他致病菌亲和力非常弱，因此其它致病菌无法使大肠杆菌O157:H7适配体与其互补打开，从而不能发生HCR反应，进而不能产生铂催化H2O2反应引发的压强增强。

[0041] 实施例10为了验证本发明提供的检测方法在实际牛奶样品检测中的可行性和准确性，选择超市购买的灭菌的牛奶作为实际样品，采用标准加入一定量的大肠杆菌O157:H7模拟被大肠杆菌O157:H7污染的牛奶样品，然后采用发明提供的检测方法进行检测，具体实验步骤为：取一定量大肠杆菌O157:H7菌液进行平板计数，然后用超市购买的无菌纯牛奶将菌液进
2 3 4
行梯度稀释，得到模拟的菌污染牛奶样品（菌浓度是5.6×10 、5.6×10 、5.6×10 CFU/mL），取50 μL进行上述检测实验，每种菌浓度做三次平行实验，同时用50 μL无菌纯牛奶作为阴性样本对照，测量各样品的气压信号值，并代入实施例8的线性拟合公式y=20.80151x‑
2
8.38177，R =0.98957，计算出牛奶样品中加标菌的检测含量值，计算加标回收率，评价实际样品检测准确度，检测结果如表1所示。

[0042] 表1牛奶样品中检测大肠杆菌O157:H7的回收率（n=3）

[0043] 从表1可以看出，牛奶的加标回收率在91.1%‑114.2%之间，变异系数CV值为2.34%‑5.39%，以上结果表明，构建的MBs‑T‑apt可用于特异性准确检测牛奶样品中的大肠杆菌O157:H7。

[0044] 综上所述，本发明所述的大肠杆菌O157:H7检测方法，能够满足生产现场的快速检测目标，检测过程不需要复杂昂贵的仪器设备及较高的专业技术人员操作。同时具有高特1
异性、高灵敏度的特点，检测限达2.1×10 CFU/mL，回收率在91.1％‑114.2％，检测结果准确，特别是无需样品前处理直接进行大肠杆菌O157:H7的检测。相比其他同类型检测方法，本方法操作简便，设备便携，陈本地，检测时间短，完成样品的检测数据判读只需10 min。