[0001] 本发明涉及质谱检测技术领域，具体涉及一种Tau蛋白抗体‑CNBr复合物及其制备方法、检测方法、试剂盒和应用。

[0002] 阿尔茨海默症(Alzheimer’s Disease，AD)，又称原发性老年痴呆，是一种致命的神经退行性疾病，属于最为常见的痴呆症类型，约有50％‑70％的痴呆症属于此类型；主要症状为记忆力衰退、认知能力下降、行为能力下降、生活能力下降等，还可能引起抑郁症、焦虑症等多种并发症，危害很大。与其他中枢神经系统(CNS)退行性疾病一样，AD的特征在于扰乱蛋白质产生、积累和清除。在AD中，蛋白质淀粉样蛋白‑β(Aβ)的代谢失调表现为这种蛋白质在患有该疾病的患者脑中以淀粉样蛋白斑块的形式大量累积。此外，蛋白质Tau以Tau缠结的形式在大脑中累积。AD导致记忆丧失、认知功能丧失以及最终自主性丧失，并死亡。这种疾病对患者、家庭和社会造成沉重的个人和经济损失。由于人群中这种疾病的严重程度和日益普遍，迫切需要开发出更好的诊断和治疗。

[0003] 目前，AD的主要诊断手段是神经心理学量表、影像学检查、生物标志物检测等。神经心理学量表评估由于受试者教育程度及个人理解能力不同，测试结果浮动大；神经影像学检测主要有磁共振成像(MRI)、正电子发射(PET)、计算机断层扫描(CT)等，都也是AD诊断的有力证据，CT可以直接显示AD患者脑萎缩现象，但由于软组织分辨力不佳，使其价值有限，MRI和PET价格昂贵，不适合人群筛查。

[0004] 脑脊液(CSF)生物标志物是目前公认的AD标志物来源，脑脊液检查可用于排除罕见的、可逆的认知障碍疾病，也可帮助对AD进行积极的分子诊断。但是CSF隔离和侵入性操作，限制了这些生物标记物在早期AD的诊断中使用。目前，针对AD发病机制所涉及的血液生物标志物研究涉及多个标志物，包括Aβ、Tau蛋白、p‑Tau蛋白等；这些生物标志物也可以更快、更少地在血浆中进行测量，并可为阿尔茨海默症的早期诊断提供形成的重要依据。

[0005] 然而，现有技术中存在的针对阿尔茨海默症的检测试剂盒，往往存在以下问题：操作程序复杂，耗费昂贵、检测时间长、灵敏度低、精密度差、线性范围窄，不能实现自动化和批量测定，无法实现特异性检测，缺少对阿尔茨海默症的准确预测能力等问题。例如，Laia Montoliu‑Gaya等发表在《Nature Aging》volume 3,661–669(2023)上的文章，公开了一种p‑Tau 217蛋白的质谱检测方法，包括清洗、酸沉淀、酸清洗、固相萃取、消化孵育等十个步骤；其中，仅清洗步骤就包括三步，消化孵育时间长达18h，所需最低血浆量在1000μL；可见，上述方法非常繁琐，耗时长，灵敏度有限，完全不适用于临床诊断，临床应用意义非常有限。

[0006] 抗体微珠复合物作为免疫富集的核心主体，其极大程度上决定了免疫富集的效果。目前市售微珠主要包括琼脂糖凝胶微球和磁性微球，尽管其在自动化转化上有限，但由于琼脂糖珠直径较大且具有海绵状结构，因而比磁珠有更大的表面积和更大的结合能力，在无需抗体饱和的情况下，琼脂糖珠能很好的结合极大量目标蛋白。而且，当目标蛋白含量低，比如在AD早期，只有少量蛋白标志物能够从CSF穿越血脑屏障进入外周循环，其在血液中丰度极低(fM级)，需要通过提升样本量(>2ml)来提升灵敏度时，受限于磁性分离设备的低容量，琼脂糖凝胶在保证蛋白富集方面发挥着绝对的优势。从成本上，琼脂糖凝胶微珠的价格更低廉，琼脂糖凝胶微球在免疫富集中的地位不可或缺。但因其比表面积大和多孔结构，没有被抗体覆盖的琼脂糖珠的部分则可以自由地结合任何可粘附的物质，这种非特异性结合升高引起背景信号升高，这时，“高荷载量优势”会变成“高荷载量劣势”。因此，在免疫富集过程中，降低非特异性吸附、稳定应用于磷酸化Tau蛋白检测是目前亟须解决的问题。

[0068] 现有技术中的阿尔茨海默症的标志物质谱检测前处理步骤繁琐，操作程序复杂，耗时长，灵敏度低。本发明的发明人经过潜心研究，对上述步骤进行了删简和优化，从而可以通过更简单的操作，实现更高检测精度和检出限的检测结果。具体地，作为本发明的第一个方面，提供了一种Tau蛋白抗体‑CNBr琼脂糖凝胶复合物(CNBr‑抗体复合物)的制备方法，包括以下步骤：

[0069] 1)微球泡发：将冻干微球和盐酸泡发，得到泡发后的微球；

[0070] 2)清洗1：将泡发后的微球用纯化水洗涤；

[0071] 3)清洗2：将泡发后的微球用偶联缓冲液洗涤；

[0072] 4)偶联：将清洗后的泡发微球和磷酸化Tau蛋白抗体混合，假如偶联缓冲液和NP 40偶联，得到磷酸化Tau蛋白抗体‑CNBr琼脂糖凝胶复合物；

[0073] 5)封闭1：将甘氨酸溶液与磷酸化Tau蛋白抗体‑CNBr琼脂糖凝胶复合物混合孵育，占据未结合抗体的CNBr活性位点；

[0074] 6)封闭2：将BSAPBS溶液加入经过封闭1处理步骤的磷酸化Tau蛋白抗体‑CNBr琼脂糖凝胶复合物混合孵育，以增加非特异性吸附和占据孔位，得到所述Tau蛋白抗体‑CNBr琼脂糖凝胶复合物。

[0075] 在一个优选的实施方式中，步骤1)中所述强酸是盐酸、硫酸或硝酸中的任意一种或至少两种的组合；和/或

[0076] 步骤1)中将冻干微球和强酸混合后室温旋转泡发，得到泡发后的微球；和/或[0077] 步骤2)中洗涤至少3次；和/或

[0078] 步骤3)中洗涤至少3次；和/或

[0079] 步骤3)所述偶联缓冲液的pH为8.0‑9.0，所述偶联缓冲液的配方包括0.5M的NaCl和0.1M的NaHCO3；和/或

[0080] 所述磷酸化Tau蛋白抗体为p‑Tau 217多克隆绵羊抗兔蛋白抗体和/或p‑Tau 181多克隆绵羊抗兔蛋白抗体；和/或

[0081] 步骤4)的偶联处理步骤具体为：将经两次清洗后的泡发微球和磷酸化Tau蛋白抗体混合，加入偶联缓冲液和NP 40，室温旋转偶联；之后离心，去上清，得到磷酸化Tau蛋白抗体‑CNBr琼脂糖凝胶复合物；和/或

[0082] 步骤5)的封闭1处理步骤具体为：将甘氨酸溶液与磷酸化Tau蛋白抗体‑CNBr琼脂糖凝胶复合物混合，2‑8℃下旋转孵育过夜，占据未结合抗体的CNBr活性位点；和/或[0083] 步骤6)的封闭2处理步骤具体为：将BSA PBS溶液加入经过封闭1的磷酸化Tau蛋白抗体‑CNBr琼脂糖凝胶复合物，室温旋转孵育至少4h，以增加非特异性吸附和占据孔位；和/或

[0084] 步骤7)所述保存液的pH为7.0‑7.5，所述保存液的配方包括：体积分数0.05％的ProClin 300，体积分数0.05％的牛血清白蛋白，和质量分数50％的甘氨酸。

[0085] 第二方面，本发明提供第一方面所述的制备方法制备而成的磷酸化Tau蛋白抗体‑CNBr琼脂糖凝胶复合物。

[0086] 第三方面，本发明提供一种磷酸化Tau蛋白检测试剂盒，所述试剂盒至少包括第一方面所述的Tau蛋白抗体‑CNBr琼脂糖凝胶复合物。

[0087] 在一个优选的实施方式中，所述试剂盒至少包括：

[0088] 1)预处理模块：至少包括样本稀释液，所述样本稀释液的配方如下：20‑80mM的Tirs‑HCl、30‑80mM的NaCl以及1‑10mM的EDTA(乙二胺四乙二酸)，以及质量分数0.02‑0.2％蛋白酶抑制剂和质量分数0.02‑0.2％磷酸酶抑制剂、质量分数0.1％‑1％的NP‑40(4‑壬基苯基‑聚乙二醇)和/或吐温20；

[0089] 2)免疫富集模块：至少包括磷酸化Tau蛋白抗体‑CNBr琼脂糖凝胶复合物；

[0090] 3)清洗模块：至少包括10‑50mM的Tris‑HCl、100‑300mM的NaCl和0.5‑2mM的EDTA；

[0091] 4)消化模块：至少包括25‑200mM的NH4HCO3、胰蛋白酶和质量分数5‑20％的甲酸水溶液；

[0092] 5)除盐模块：至少包括甲醇、体积分数50‑80％的乙腈水溶液、体积分数0.5‑1％的甲酸水溶液；

[0093] 6)干燥和进样模块：至少包括体积分数0.05‑0.1％的甲酸水，以及如Seq No.1所示的同位素肽段和/或如Seq No.2所示的同位素肽段。

[0094] 第四方面，本发明提供一种磷酸化Tau(p‑Tau)蛋白或其片段的检测方法，至少包括以下步骤：

[0095] 1)样本预处理：在样本中加入样本稀释液，得到溶液A；

[0096] 2)免疫富集：先后将第二方面所述的Tau蛋白抗体‑CNBr琼脂糖凝胶复合物加入溶液A中，室温旋转孵育，得到免疫富集后的复合物；

[0097] 3)清洗：将免疫富集后的复合物分别用Tris‑HCl、NaCl和EDTA清洗，再用NH4HCO3清洗，得到清洗后的复合物；

[0098] 4)将清洗后的复合物加入NH4HCO3复溶，再进行消化和终止；

[0099] 5)除盐、真空浓缩和质谱进样；

[0100] 6)用质谱进行检测，输出结果。

[0101] 在一个优选的实施方式中，所述磷酸化Tau蛋白可以是p‑Tau 217和/或p‑Tau 181；和/或

[0102] 步骤1)中样本稀释液包括：20‑80mM的Tirs‑HCl、30‑80mM的NaCl、1‑10mM的EDTA(乙二胺四乙二酸)，质量分0.02％‑0.2％蛋白酶抑制剂、0.02％‑0.2％磷酸酶抑制剂、质量分数0.1％‑1％的NP‑40和/或吐温20；和/或

[0103] 所述样本为CSF、血液或血浆样本；和/或

[0104] 步骤2)包括：将10‑40μL的CNBr活化琼脂糖凝胶抗体复合物(CNBr‑抗体)加入溶液A中，室温旋转孵育至少2h；和/或

[0105] 步骤3)中清洗液包括：10‑50mM Tris‑HCl、100‑300mM NaCl、0.5‑2mM EDTA，将免疫富集后的复合物分别用清洗液清洗至少三遍；清洗的作用在于维持理想的蛋白质相互作用，除去CNBr‑微球复合物表面的非特异性吸附；和/或

[0106] 步骤4)包括：将清洗后的复合物用25‑200mM的NH4HCO3清洗至少两遍，进行溶剂替换；加入25‑200mM的NH4HCO3复溶，再加入胰蛋白酶振荡消化，加入甲酸水溶液予以终止；消化液的主要作用是提供碱性的水解环境，确保胰蛋白酶(Typsin)的活力最高(最适宜pH为8‑9)，将磷酸化Tau蛋白分解成可用于质谱检测的特异性肽段；和/或

[0107] 步骤5)中的除盐包括：

[0108] ①将C18离心柱加入200μL甲醇2500rpm离心5min，弃滤液；

[0109] ②加入200μL 80％乙腈水溶液2500rpm离心5min，弃滤液；

[0110] ③加入200μL 1％甲酸水溶液2500rpm离心5min，弃滤液；

[0111] ④将酸化后的样本加入C18离心柱1800rpm离心10min，弃滤液；

[0112] ⑤加入80μL 80％乙腈水溶液2500rpm离心5min，收集滤出液；和/或[0113] 步骤5)中的真空浓缩和质谱进样包括：将除盐后的样本用真空浓缩离心机干燥；和/或

[0114] 步骤5)中的质谱进样包括：将干燥后的样本用体积分数0.1％的甲酸水复溶，振荡离心后进样；和/或

[0115] 步骤6)在质谱进样时加入如Seq No.1所示的同位素肽段：Seq No.2所示的同位素肽段。和/或

[0116] 本发明所用质谱为轨道离子阱质谱。

[0117] 第五方面，一种如第二方面所述的磷酸化Tau蛋白抗体‑CNBr琼脂糖凝胶复合物在阿尔茨海默症早期诊断中的应用。

[0118] 第六方面，本发明提供如第三方面所述的磷酸化Tau蛋白或其片段的检测试剂盒在阿尔茨海默症早期诊断中的应用。

[0119] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

[0120] 血浆样本的采集：从安徽省某市级医院血库中收集阿尔茨海默症患者和健康者的外周血，每例外周血样本提取血浆后，‑80℃保存备用。

[0121] 在本发明具体实施方式中所用的重要试剂，如表1所示。质谱采用Exploris 480(Thermofisher scientific)轨道离子阱质谱，仪器参数如下：Isolation window(隔离窗口)：0.7；HCD：30％；Orbitrap Resolution(轨道阱分辨率)：45000；scan range(扫描范围):120‑1500；RF lens(射频透镜)：50％；AGC(自动增益控制)：100％；Maximun injection Time(最大进样时间)：110；色谱分析时间：30min；进样量：0.5μL。

[0122] 表1本发明具体实施方式中所用试剂

[0123]

[0124]

[0125] 实施例1

[0126] 本例以正常人的血浆样本为研究对象，采用CNBr活化琼脂糖凝胶抗体复合物对样品进行磷酸化Tau蛋白进行免疫富集检测。

[0127] (1)磷酸化Tau蛋白抗体‑CNBr琼脂糖凝胶复合物及其制备

[0128] 1)微球泡发：称取0.01‑0.1g干微球至15mL康宁离心管，再加入5‑15mL浓度3mM的盐酸(pH＝2.5)室温旋转泡发60min；

[0129] 2)清洗1：5‑15mL纯化水洗涤3次，每次5‑15mL(旋转洗涤3min，离心3000rpm，3min)；

[0130] 3)清洗2：5mL偶联缓冲液(0.5M NaCl，0.1M NaHCO3，pH8.3)洗涤3次，每次5‑15mL(旋转洗涤3min，离心3000rpm，3min)；

[0131] 4)偶联：取5‑50μL磷酸化Tau抗体和10‑100μL微球置于1.5mLEP管中，再加入250μL偶联缓冲液和2μL NP40，室温旋转偶联(至少2h)；偶联结束后，置于28℃条件下2500rpm离心5min，去除上清，得到微珠抗体复合物；

[0132] 5)封闭1：将0.5‑5mL浓度0.5M的甘氨酸溶液加入到微珠抗体复合物中，2‑8℃旋转孵育过夜(>12h)，占据未结合抗体的CNBr活性位点；

[0133] 6)封闭2：将0.5‑5mL0.1％BSA的PBS溶液加入到经过封闭1的微珠抗体复合物，室温下旋转孵育4h，以增加非特异性吸附和占据孔位；

[0134] 7)储存：将封闭好的微珠抗体复合物经过1ml PBS清洗3次后，添加至保存液中，保存液配方为：0.05％(v/v)ProClin 300+0.05％(v/v)牛血清白蛋白(BSA)+50％(w/v)甘氨酸(Gly)pH＝7.3，置于2‑8度保存2周。

[0135] (2)磷酸化Tau(p‑Tau)蛋白或其片段的检测方法

[0136] 1)样本预处理：在4mL样本中按照1:1的比例加入样本稀释液，得到溶液A；稀释液包括：0.5％ NP40+50mM Tris‑HCl+60mM NaCl+0.1％蛋白酶抑制剂+0.1％磷酸酶抑制剂混合溶液；

[0137] 2)免疫富集：将20μL免疫微珠(CNBr‑抗体)加入溶液A中，室温旋转孵育至少2h，得到免疫富集后的蛋白‑抗体‑微球复合物；

[0138] 3)清洗：将免疫富集后的复合物分别用1mL 25mM Tris‑HCl+150mM NaCl+1mM EDTA清洗三遍，得到清洗后的复合物；

[0139] 4)将清洗后的复合物用1mL 50mM NH4HCO3各清洗两遍，进行溶剂替换。将清洗后的复合物加入100μL 50mM NH4HCO3复溶，再加入1μL胰酶37℃1000rpm振荡消化8h，加入10μL 10％甲酸水溶液予以终止；

[0140] 5)除盐，包括：

[0141] ①将C18离心柱加入200μL甲醇2500rpm离心5min，弃滤液；

[0142] ②加入200μL 80％乙腈水溶液2500rpm离心5min，弃滤液；

[0143] ③加入200μL 1％甲酸水溶液2500rpm离心5min，弃滤液；

[0144] ④将酸化后的样本加入C18离心柱1800rpm离心10min，弃滤液；

[0145] ⑤加入80μL 80％乙腈水溶液2500rpm离心5min，收集滤出液；

[0146] 6)真空浓缩和质谱进样，包括：将除盐后的样本用真空浓缩离心机干燥；

[0147] 7)质谱进样，包括：将干燥后的样本用10μL含如Seq No.1所示的同位素肽段和如Seq No.2所示的同位素肽段的0.1％甲酸水复溶，涡旋混匀3min，瞬离10s后进样；

[0148] 本实施例中，针对上述CNBr琼脂糖凝胶‑磷酸化Tau蛋白抗体复合物应用于血浆中磷酸化Tau进行检测的性能进行了考察，考察项目包括线性、重复性、准确性，考察结果如下：

[0149] 1)线性验证：向1mL空白基质中分别加入终浓度为1pg/mL、5pg/mL、10pg/mL和20pg/mL重组磷酸化Tau 181蛋白和0.15pg/mL、1pg/mL、2pg/mL和10pg/mL重组磷酸化Tau 
217蛋白，制备成校准曲线，按照实施例1的样本处理过程进行处理和检测。以目标蛋白所对应肽段的信号强度与同位素肽段的的信号强度的比值(峰面积比值)作为纵坐标，以目标蛋白的浓度作为横坐标，进行线性拟合。得到图1所示的校准曲线，由图可以看出，p‑Tau 181
2
线性相关系数R＝0.9977，说明p‑Tau 181在1‑20pg/ml浓度范围内线性良好；p‑Tau 217线
2
性相关系数R＝0.9986，说明p‑Tau 217在0.15‑10pg/ml浓度范围内线性良好。

[0150] 2)重复性验证：向血浆中分别加入终浓度为0.25pg/mL和1pg/mL的p‑Tau 217；4pg/mL和16pg/mL的p‑Tau 181重组磷酸化Tau蛋白，按照实施例1的处理过程进行处理，并将峰面积比值带入到校准曲线方程中，计算出实际样本的浓度，结果如表2所示，可以看出，实施例1中测定结果的精密度CV<15％。

[0151] 表2实施例1重复性验证数据

[0152]

[0153] 3)准确度验证：向血浆中分别加入终浓度为p‑Tau 217:0.25pg/mL和1pg/mL；p‑Tau 181:4pg/mL和16pg/mL的重组磷酸化Tau蛋白，血浆本底和加标后的血浆按照实施例1的处理过程进行处理，并将峰面积比值带入到校准曲线方程中，计算出实际样本的浓度，按照准确度＝(加标后检测结果‑本底浓度)/理论浓度*100％。结果如表3所示，可以看出，实施例1的准确度>80％。

[0154] 表3实施例1准确度验证数据

[0155]

[0156] 实施例2

[0157] 与实施例1区别在于CNBr‑抗体复合物制备过程中的浓度，封闭液中0.5M甘氨酸的体积，0.5、2.5、5mL。本实施例中，针对上述CNBr琼脂糖凝胶‑磷酸化Tau蛋白抗体复合物应用于血浆中磷酸化Tau进行检测的性能进行了考察，考察项目为线性、重复性、准确性、定量2
限附近样本信噪比(S/N)，考察结果如表4所示：两个磷酸化Tau蛋白的线性相关系数R >
0.992，p‑Tau271的CV,％<15％，p‑Tau181的CV,％<8.49％，两者的准确度均>79％，定量限附近浓度的样本信噪比(S/N)>15，结果表明本方案封闭液甘氨酸的体积在0.5‑2mL均能满足检测要求。

[0158] 表4实施例2性能指标验证结果统计表

[0159]

[0160]

[0161] 实施例3

[0162] 与实施例1区别在于清洗液中NaCl的浓度，分别为100mM、200mM、300mM。本实施例中，针对上述CNBr琼脂糖凝胶‑磷酸化Tau蛋白抗体复合物应用于血浆中磷酸化Tau进行检测的性能进行了考察，考察项目为线性、重复性、准确性、定量限附近样本信噪比(S/N)，考2
察结果如表5所示：两个磷酸化Tau蛋白的线性相关系数R>0.992，p‑Tau271的CV,％<12％，p‑Tau 181的CV,％<10％,两者的准确度均>75％，定量限附近浓度的样本信噪比(S/N)>20，结果表明本方案清洗液中NaCl的浓度在100‑300mM均能满足检测要求。

[0163] 表5实施例3性能指标验证结果统计表

[0164]

[0165] 实施例4

[0166] 与实施例1区别在于清洗液中EDTA的浓度，分别为0.5mM、2mM。本实施例中，针对上述CNBr琼脂糖凝胶‑磷酸化Tau蛋白抗体复合物应用于血浆中磷酸化Tau进行检测的性能进行了考察，线性、重复性、准确性、定量限附近样本信噪比(S/N)，考察结果如表6所示：两个2
磷酸化Tau蛋白的线性相关系数R>0.990，p‑Tau271的CV,％<9％,p‑Tau181的CV,％<12％，两者的准确度均>79％，定量限附近浓度的样本信噪比(S/N)>10，结果表明本方案清洗液中EDTA的浓度在0.5‑2mM均能满足检测要求。

[0167] 表6实施例4的性能指标验证结果统计表

[0168]

[0169] 实施例5

[0170] 实施例5与实施例1区别在于清洗液中Tris‑HCl的浓度，分别为10、25、40mM。本实施例中，针对上述CNBr琼脂糖凝胶‑磷酸化Tau蛋白抗体复合物应用于血浆中磷酸化Tau进行检测的性能进行了考察，线性、重复性、准确性、定量限附近样本信噪比(S/N)，考察结果2
如表7所示：两个磷酸化Tau蛋白的线性相关系数R >0.991，p‑Tau271的CV,％<9％，p‑Tau181的CV,％<9％，两者的准确度均>80％，定量限附近浓度的样本信噪比(S/N)>14，结果表明本方案清洗液中Tris‑HCl的浓度在10‑40mM均能满足检测要求。

[0171] 表7实施例5性能指标验证结果统计表

[0172]

[0173] 对比例1

[0174] 与实施例1区别在于不进行二次封闭。本对比例中，针对上述CNBr琼脂糖凝胶‑磷酸化Tau蛋白抗体复合物应用于血浆中磷酸化Tau进行检测的性能进行了考察，考察项目为线性、重复性、准确性、定量限附近样本信噪比(S/N)，考察结果如下：

[0175] (1)线性验证及灵敏度测试：向1mL空白基质中分别加入终浓度为1pg/mL、5pg/mL、10pg/mL和20pg/mL重组磷酸化Tau181蛋白和0.15pg/mL、1pg/mL、2pg/mL和10pg/mL重组磷酸化Tau217蛋白，制备成校准曲线，按照实施例1的样本处理过程进行处理和检测。以目标蛋白所对应肽段的信号强度与同位素肽段的的信号强度的比值(峰面积比值)作为纵坐标，以目标蛋白的浓度作为横坐标，进行线性拟合。得到图2所示的校准曲线，由图可以看出，p‑
2
Tau181线性相关系数R ＝0.9958，说明p‑Tau181在1～20pg/ml浓度范围内，线性良好；p‑
2
Tau217线性相关系数R ＝0.9781，说明p‑Tau217在0.15～10pg/ml浓度范围内，线性不佳。
另外，由对比例1中定量限附近样本中p‑Tau181和p‑Tau217的色谱图显示，p‑Tau217在
0.15pg/mL的信噪比较低，无法满足准确定量的要求。

[0176] (2)重复性验证：向血浆中分别加入终浓度为p‑Tau 217:0.25pg/mL和1pg/mL；p‑Tau 181:4pg/mL和16pg/mL的重组磷酸化Tau蛋白，按照实施例1的处理过程进行处理，并将峰面积比值带入到校准曲线方程中，计算出实际样本的浓度，结果如表8所示，可以看出，对比例1中低浓度p‑Tau217的CV,％为15.35％，低浓度p‑Tau181的CV,％为13.71％，在不进行二次封闭时，活性位点和表面孔径未充分占据，在进行免疫沉淀时，目标蛋白和杂蛋白相互竞争且竞争随机，导致样本间的重复性不佳。

[0177] 表8对比例1重复性结果数据

[0178]

[0179] (3)准确度验证：向血浆中分别加入终浓度为p‑Tau 217:0.25pg/mL和1pg/mL；p‑Tau 181:4pg/mL和16pg/mL的重组磷酸化Tau蛋白，血浆本底和加标后的血浆按照实施例1的处理过程进行处理，并将峰面积比值带入到校准曲线方程中，计算出实际样本的浓度，按照准确度＝(加标后检测结果‑本底浓度)/理论浓度*100％。结果如表9所示，可以看出，对比例1中的p‑Tau217的准确度仅为68.8％，其远低于实施例1，在不进行二次封闭时，活性位点和表面孔径未充分占据，在进行免疫沉淀时，目标蛋白和杂蛋白相互竞争且竞争随机，导致目标蛋白捕获效率下降。

[0180] 表9对比例1准确性验证结果数据

[0181]

[0182] 对比例2

[0183] 与实施例1的区别在于清洗液的配方为：体积分数1％的NP40的PBS溶液。本对比例中，针对上述CNBr琼脂糖凝胶‑磷酸化Tau蛋白抗体复合物应用于血浆中磷酸化Tau进行检测的性能进行了考察，考察项目为线性、重复性、准确性、定量限附近样本信噪比(S/N)，考察结果如下：

[0184] (1)线性验证：向1mL空白基质中分别加入终浓度为1pg/mL、5pg/mL、10pg/mL和20pg/mL重组磷酸化Tau181蛋白和0.15pg/mL、1pg/mL、2pg/mL和10pg/mL重组磷酸化Tau217蛋白，制备成校准曲线，按照实施例1的样本处理过程进行处理和检测。以目标蛋白所对应肽段的信号强度与同位素肽段的的信号强度的比值(峰面积比值)作为纵坐标，以目标蛋白的浓度作为横坐标，进行线性拟合。得到图3所示的校准曲线，由图可以看出，p‑Tau181线性相关系数R2＝0.9909，说明p‑Tau181在1～20pg/mL浓度范围内，线性良好；p‑Tau217线性相关系数R2＝0.9906，说明p‑Tau217在0.15～10pg/ml浓度范围内，线性良好。另外，由对比例
2中定量限附近样本中p‑Tau181和p‑Tau217的色谱图显示，p‑Tau217在0.15pg/mL的信噪比约在10左右，基本满足定量的要求。

[0185] (2)重复性验证：向血浆中分别加入终浓度为p‑Tau 217：0.25pg/mL和1pg/mL；p‑Tau 181：4pg/mL和16pg/mL的重组磷酸化Tau蛋白，按照实施例1的处理过程进行处理，并将峰面积比值带入到校准曲线方程中，计算出实际样本的浓度，结果如表10所示，可以看出，对比例2中p‑Tau217测定结果的精密度CV分别未19.42％和20.40％，CV,％＞15％。与上述实施例相比，在更换清洗液的配方时，p‑Tau 217的重复性下降。

[0186] 表10对比例2重复性结果数据

[0187]

[0188] (3)准确度验证：向血浆中分别加入终浓度为p‑Tau 217：0.25pg/mL和1pg/mL；p‑Tau 181：4pg/mL和16pg/mL的重组磷酸化Tau蛋白，血浆本底和加标后的血浆按照实施例1的处理过程进行处理，并将峰面积比值带入到校准曲线方程中，计算出实际样本的浓度，按照准确度＝(加标后检测结果‑本底浓度)/理论浓度*100％。结果如表11所示，可以看出，对比例2的准确度有所下降，基本在70％左右。

[0189] 表11对比例2准确性验证结果数据

[0190]

[0191] 综上所述，本发明提供的磷酸化Tau蛋白或其片段的检测方法步骤简单，灵敏度高，精密度好，检测结果可信度高，只需要5个步骤就可完成质谱检测前处理，所需样本量降低了约75％，其中将清洗步骤简化，省略了现有技术中的酸沉淀、酸清洗和固相萃取步骤，另外，还大幅缩短了消化孵育的时间。本发明可用于阿尔茨海默症的早期诊断标志物的分析检测，有效提升磷酸化Tau蛋白的捕获效率，提高阿尔茨海默症早期诊断和筛查的特异性及灵敏度。本发明解决了现存的阿尔茨海默症检测试剂盒操作复杂，成本高，灵敏度低，精密度差，缺少对阿尔茨海默症准确预测能力等问题，具有重要的应用价值和意义。

[0192] 以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。