[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体地说，是莪术烯醇在制备治疗三阴性乳腺癌及肺转移的药物中的应用。

[0002] 乳腺癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤。三阴性乳腺癌(Triple‑negative breast cancer，TNBC)是指雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人类表面生长因子受体2(HER2)表达阴性，好发于40岁左右女性，约占所有类型乳腺癌的15％～20％。与非三阴性乳腺癌相比，该类型乳腺癌病理特征多为浸润性导管癌，组织学分级多为III级，具有高复发转移、恶性程度高、预后差的特点。研究显示，转移性TNBC中位生存期仅13个月，5年生存率低于30％。现阶段，手术、放疗、化疗以及EGFR抑制剂为代表的靶向治疗虽在一定程度上改善临床症状，但易出现短期复发风险、化疗耐药及严重不良反应(胃肠道反应、骨髓功能抑制、脱发等)。

[0003] 中医药在三阴性乳腺癌患者辅助治疗中日益突显优势，可配合手术、放、化疗等治疗手段发挥调节机体免疫功能、减轻放化疗毒性、预防复发转移及延长带瘤生存期的效应。但莪术烯醇治疗乳腺癌及肺转移的相关研究未有报道。

[0032] 下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

[0033] 实施例1：莪术烯醇(Curcumenol)治疗三阴性乳腺癌的网络药理学研究[0034] 通过Swiss数据库、Super‑pred数据库，筛选莪术烯醇(Curcumenol)对应的作用靶蛋白，通过Uniprot数据库对靶蛋白进行基因名称的统一转化，共得到222个莪术烯醇(Curcumenol)的基因靶点。通过GeneCards数据库进行检索，筛选到三阴性乳腺癌相关基因6304个，交集靶点为141个(图1A)。

[0035] 通过STRING数据库对交集靶点进行蛋白互作分析，通过PPI网络中degree排名，得到互作力较强的靶点，包括与癌症发展关系密切的TP53基因、与细胞增殖、侵袭能力相关的EGFR、ERBB2基因及MMPs、MAPKs、JAKs家族，以及细胞凋亡能力相关的Caspase、CCNA、CDK基因(图1B‑C)。

[0036] 对莪术烯醇(Curcumenol)治疗三阴性乳腺癌的141个潜在作用靶点进行富集分析，结果提示其可能作用的信号通路包括与癌症发展、侵袭转移相关的PI3K‑Akt信号通路、MAPK信号通路、HIF‑1信号通路等(图1D‑E)。

[0037] 实施例2：莪术烯醇(Curcumenol)治疗三阴性乳腺癌的药效学观察

[0038] 根据以上结果，本发明初步判断莪术烯醇(Curcumenol)可以在抑制三阴性乳腺癌中发挥治疗作用，因此进行了实验研究进行药效学观察。

[0039] 2.1莪术烯醇(Curcumenol)对三阴性乳腺癌细胞增殖能力的影响

[0040] 取对数生长期的三阴性乳腺癌细胞4T1及MDA‑MB‑231，调整细胞密度至5×104/mL，接种于96孔细胞培养板中，每组6个复孔，设空白对照组、莪术烯醇(Curcumenol)不同浓度组，干预24、48h后，CCK8法检测药物干预后三阴性乳腺癌细胞增殖能力的变化。结果显示，与空白对照组比较，不同浓度莪术烯醇(Curcumenol)干预24、48h后均可显著降低4T1及MDA‑MB‑231细胞的存活率(*P<0.05，**P<0.01)，且存在剂量依赖性，表明该药可抑制两种三阴性乳腺癌细胞增殖能力(图2)。

[0041] 2.2莪术烯醇(Curcumenol)对三阴性乳腺癌细胞迁移能力的影响

[0042] 取对数生长期的小鼠乳腺癌细胞4T1、人乳腺癌细胞MDA‑MB‑231，分别接种到6孔细胞培养板中进行细胞划痕。细胞贴壁后分别加入基础培养基或25、50、100μM的莪术烯醇(Curcumenol)培养24h，倒置显微镜下拍照，计算划痕区域的愈合面积及迁移率。结果显示，与空白对照组比较，50、100μM的莪术烯醇(Curcumenol)干预24h后，可显著降低4T1及MDA‑MB‑231细胞的迁移率(**P<0.01，*P<0.05；图3)。表明莪术烯醇(Curcumenol)对不同来源的三阴性乳腺癌细胞的迁移能力均有明显的抑制作用。

[0043] 2.3莪术烯醇(Curcumenol)对三阴性乳腺癌细胞侵袭能力的影响

[0044] 取对数生长期的三阴性乳腺癌细胞4T1、MDA‑MB‑231分别接种于6孔细胞培养板中，设空白对照组、不同浓度的莪术烯醇(Curcumenol)(25、50、100μM)，干预24h。将Matrigel基质胶于冰上按照1：5比例加入无血清培养基稀释后每孔50μL加入Transwell小室的上室，待基质胶聚合成凝胶后，上下室分别加入无血清培养基过夜水化。将细胞密度调4
整至5×10/mL，每孔100μL接种于Transwell小室(8μm孔径)的上室，下室加入500μL含5％血清的培养液，孵育24h，每组3个复孔。滤膜固定、结晶紫染色，倒置显微镜下拍照，并计数移至膜下层的细胞，每个样本计数5个视野，取均值。

[0045] 结果显示，与空白对照组比较，25、50、100μM的莪术烯醇(Curcumenol)干预24h后，可显著减少透过小室的4T1及MDA‑MB‑231细胞数目(**P<0.01；图4)。综上所述，莪术烯醇(Curcumenol)可显著抑制不同来源三阴性乳腺癌细胞的侵袭能力。

[0046] 2.4莪术烯醇(Curcumenol)对三阴性乳腺癌细胞集落能力的影响

[0047] 取对数生长期的三阴性乳腺癌细胞4T1、MDA‑MB‑231分别接种于6孔细胞培养板中，设空白对照组、不同浓度的莪术烯醇(Curcumenol)(25、50、100μM)，干预24h。然后将各组细胞消化、离心、计数，每个6孔板铺入1000个细胞，隔日换液，14天后各组细胞形成不同的集落状态。PBS清洗2次后，多聚甲醛固定5min，结晶紫染色20min，拍照记录各组集落数目，取均值。

[0048] 结果显示，与空白对照组比较，药物干预24h后，莪术烯醇(Curcumenol)不同浓度组可抑制4T1及MDA‑MB‑231细胞的集落能力(**P<0.01，*P<0.05；图5)。综上所述，莪术烯醇(Curcumenol)可显著抑制不同来源三阴性乳腺癌细胞的集落能力。

[0049] 2.5莪术烯醇(Curcumenol)对三阴性乳腺癌细胞EMT和凋亡相关蛋白表达的影响[0050] 取对数生长期的三阴性乳腺癌细胞4T1、MDA‑MB‑231，分别接种到6孔板中，加入不同浓度的莪术烯醇(Curcumenol)(25、50、100μM)干预24h后，提取蛋白，Western‑blot检测EMT上皮及间质表型及凋亡相关蛋白的表达水平。

[0051] 结果显示，随着剂量的增加，莪术烯醇(Curcumenol)对两种乳腺癌细胞的EMT及凋亡标志蛋白的调控作用逐渐增强。对于4T1细胞，100μM浓度的莪术烯醇(Curcumenol)能明显下调间质表型N‑cadherin、抗凋亡蛋白BCL‑2表达；50、100μM浓度的莪术烯醇(Curcumenol)干预能明显下调细胞增殖侵袭相关波形蛋白Vimentin的表达水平、上调上皮表型E‑cadherin、促凋亡蛋白BAX、C‑caspase 3、C‑caspase 9的表达水平(**P<0.01，*P<0.05；图6A‑D)。

[0052] 对于MDA‑MB‑231细胞，25、50、100μM浓度的莪术烯醇(Curcumenol)可降低细胞增殖侵袭相关波形蛋白Vimentin的表达水平；50、100μM浓度的莪术烯醇(Curcumenol)干预能明显下调间质表型N‑cadherin、抗凋亡蛋白BCL‑2表达、上调上皮表型E‑cadherin、促凋亡蛋白C‑caspase 3的表达水平。100μM浓度的莪术烯醇(Curcumenol)可上调促凋亡蛋白BAX、C‑caspase 9的表达水平(**P<0.01，*P<0.05；图6E‑H)。

[0053] 综上所述，莪术烯醇(Curcumenol)可能通过下调间质表型N‑cadherin蛋白及抗凋亡蛋白BCL‑2表达，上调上皮表型E‑cadherin蛋白、促凋亡蛋白BAX、C‑caspase 3、C‑caspase 9表达水平，对两种三阴性乳腺癌细胞的恶性生物学行为发挥抑制作用。

[0054] 2.6莪术烯醇(Curcumenol)对三阴性乳腺癌模型小鼠的抗肿瘤效应

[0055] 选用6‑8周龄雌性BALB/c小鼠，在其第2对乳腺的左侧脂肪垫中注射4T1三阴性乳5
腺癌细胞悬液，细胞密度2×10 /mL，每只0.1mL，建立三阴性乳腺癌小鼠模型。所有造模动物分层随机分为：模型对照组(i.p，生理盐水，隔日1次)、莪术烯醇(Curcumenol)低剂量组(i.p，5mg/kg，隔日1次)、莪术烯醇(Curcumenol)高剂量组(i.p，10mg/kg，隔日1次)，PTX阳
3
性药组(i.p，10mg/kg，每周1次)。肿瘤体积达到100mm以上时开始给药，在治疗期间，观察小鼠的生长状态，记录瘤体体积及小鼠体重变化，用游标卡尺测量瘤体的长、短径，瘤体体积＝(长径×短径×短径)/2。给药3周后，解剖小鼠，完整剥离瘤体称重、拍照(图7A)。

[0056] 结果显示，接种4T1三阴性乳腺癌细胞3天后，部分小鼠左侧第2对脂肪垫部位即可触摸到绿豆大小的硬块，7～10天全部成瘤。模型对照组小鼠肿瘤体积随着时间的延长逐渐增大，而莪术烯醇(Curcumenol)低、高剂量组小鼠肿瘤体积在不同时间点增长趋势均显著减小，与模型对照组相比具有显著性差异(*P<0.05，**P<0.01；图7B‑D)。免疫组化显示，莪术烯醇(Curcumenol)的干预可以降低肿瘤组织的增殖能力，促进肿瘤组织凋亡(**P<0.01；图7E‑H)。综上所述，莪术烯醇(Curcumenol)低、高剂量对三阴性乳腺癌小鼠具有明显的抗肿瘤生长效应。

[0057] 2.7莪术烯醇(Curcumenol)对三阴性乳腺癌模型小鼠EMT及凋亡标志蛋白表达的影响

[0058] 将各组肿瘤组织加入蛋白裂解液匀浆，提取蛋白，Western‑blot检测EMT上皮及间质表型及凋亡相关蛋白的表达水平，评价莪术烯醇(Curcumenol)对三阴性乳腺癌小鼠肿瘤上皮与间质表型及凋亡水平的影响。

[0059] 结果显示，与模型对照组比较，莪术烯醇(Curcumenol)低、高剂量对肿瘤中抗凋亡蛋白Bcl‑2、间质表型marker蛋白N‑cadherin、增殖与侵袭转移相关蛋白Vimentin均有明显的下调作用；且均可上调上皮表型E‑cadherin的表达水平；莪术烯醇(Curcumenol)高剂量可以上调促凋亡蛋白BAX、C‑caspase 9、C‑caspase 3的表达水平(*P<0.05，**P<0.01；图8)。综上所述，莪术烯醇(Curcumenol)对三阴性乳腺癌模型小鼠的肿瘤组织中EMT及凋亡标志蛋白具有显著的调控作用。

[0060] 2.8莪术烯醇(Curcumenol)对三阴性乳腺癌模型小鼠的抗肺转移效应

[0061] 造模、给药、分组同上，药物干预3周后，处死小鼠，分离转移性肺组织，苦味酸浸泡48h，计数肺结节；石蜡包埋、切片，苏木精&伊红(H&E)染色观察肺转移组织病理学变化。

[0062] 结果显示，与模型对照组比较，莪术烯醇(Curcumenol)各剂量组及紫杉醇组小鼠肺转移结节数显著减少(*P<0.05，**P<0.01；图9A‑B)。HE染色结果显示，模型对照组肺转移灶面积几乎占据整个观察视野(肺泡结构、炎症浸润严重)，莪术烯醇(Curcumenol)高剂量组(10mg/kg)及PTX阳性药组肺转移灶面积较小，治疗效果相对较好(图9C)。免疫组化显示，与模型对照组比较，莪术烯醇(Curcumenol)可上调肺组织中上皮表型E‑cadherin的表达水平，对增殖与侵袭转移相关蛋白Vimentin有明显的下调作用(**P<0.01；图9D‑G)。综上所述，莪术烯醇(Curcumenol)显著抑制三阴性乳腺癌模型小鼠肺转移进展。

[0063] 2.9莪术烯醇(Curcumenol)下调NF‑κB/TGF‑β通路抑制三阴性乳腺癌[0064] 通过转录组测序进一步探究莪术烯醇(Curcumenol)抑制三阴性乳腺癌的深层机制，结果发现，相较于模型组，莪术烯醇(Curcumenol)可上调200个基因的表达(包括IL7、HCAR2以及NF‑κB的抑制印子NF‑κBID)，下调289个基因的表达(包括APLNR、SLC7A11以及与侵袭转移密切相关的TGF‑β)(图10A‑B)。对这些差异基因进行富集分析，发现莪术烯醇(Curcumenol)可能通过调控NF‑κB/TGF‑β等信号通路发挥作用。RT‑PCR及Western‑Blot进行实验验证发现，莪术烯醇(Curcumenol)干预后，肿瘤组织中p‑NF‑κB及TGF‑β被显著抑制。综上所述，莪术烯醇(Curcumenol)通过下调NF‑κB/TGF‑β通路抑制三阴性乳腺癌。

[0065] 实施例3：莪术烯醇(Curcumenol)治疗三阴性乳腺癌的安全性评价

[0066] 为了考察莪术烯醇(Curcumenol)的安全性，对各组小鼠的肝、肾脾、心、进行病理学检测发现，与腹腔注射生理盐水的模型对照组比较，莪术烯醇(Curcumenol)低、高剂量组对各主要脏器无明显的病理损伤，结果如图11所示，表明莪术烯醇(Curcumenol)在有效抑制肿瘤的同时不会引起明显的毒副作用。

[0067] 综上所述，本发明所选取的中药化合物安全无毒副作用，且具有效果显著的优点。

[0068] 以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。