[0001] 本发明属于医学美容技术领域，具体涉及一种液态组合物，其可以用于减轻和/或改善皮肤的衰老老化现象，如干燥，粗糙，色素沉着，细纹等老化现象，具有抗衰老等用途。

[0002] 皮肤的衰老可以分为内在因素引起的内源性衰老和外在因素导致的外源性衰老；紫外线辐照、环境污染、烟雾、生活压力等是可导致皮肤严重老化的外部因素，特别是其中的紫外线辐射，当皮肤受到紫外线辐射后，细胞内会产生过量的活性氧，引起衰老相关基因表达，诱发炎症级联反应并降低弹力蛋白和胶原蛋白的表达量导致皮肤出现松弛、皱纹等光老化现象；光老化主要发生真皮层。基底膜处于真皮层与表皮层的交界处，其结构状态影响表皮层和真皮层，是维持皮肤外观的健康年轻状态的“桥梁”。

[0003] 弹性纤维和胶原蛋白是皮肤真皮层中重要的生物大分子，Ⅳ型胶原是基底膜网状结构的主要组成成分，ⅩⅦ型胶原蛋白是基底膜中的一种跨膜蛋白，具有维持表皮真皮之间的紧密连接，以促进表皮更替、稳固基底膜的功能；这些蛋白都在维持皮肤年轻健康状态中发挥着重要的作用。

[0004] 随着年龄和/或环境的变化，人体的皮肤等器官或组织会发生衰老，表现出皮肤干燥、粗糙、细纹、色素沉着等现象或状态。随着社会发展，人们生活水平提高，对美的追求也随之提升，因此，抗衰老，提升皮肤健康状态，特别是消除、减少皮肤色素沉着，促蛋白再生，减少细纹或阻止细纹形成等抗衰老途径，是追求美丽健康抗衰老的直接快速的方式。

[0005] 本申请的发明人在先研究了一种抗衰老的试剂盒，其中包括液态部分和固体部分。为了提供更好功效的产品，有必要对在先产品进行更深入研究，促使产品性能更优。

[0080] 术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。

[0081] 本发明中，任选表示可以有也可以没有。

[0082] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“一些实施方式”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

[0083] 本发明中，室温为环境温度，在20℃‑30℃，或者22℃‑28℃，或者25℃。

[0084] 为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例，对本发明作进一步的详细说明。

[0085] 实施例1：

[0086] 配方：

[0087]

[0088]

[0089] 制备方法：按照配方，

[0090] 1)将1,2‑己二醇，约总量一半的1,3‑丁二醇，以及对羟基苯乙酮，混合，搅拌，在65℃‑70℃条件下溶解，得到混合液，备用；

[0091] 2)将余下的1,3‑丁二醇，烟酰胺，和透明质酸钠，混合，搅拌均匀，得到混合液，备用；

[0092] 3)将水加入容器中，15rpm‑20rpm(转/分钟)搅拌并开启加热，加入步骤2所得的混合液；待温度升至85℃‑90℃，1200rpm‑1800rpm均质2min‑3min，然后保温搅拌10min‑15min；再降温至60℃‑65℃，加入步骤1所得混合液，15rpm‑20rpm搅拌分散均匀；然后降温至35℃‑40℃，加入余下的其他的物料，

[0093] 15rpm‑20rpm搅拌分散均匀；

[0094] 4)用400目‑500目的滤布过滤出料，灌装，得到液态组合物。

[0095] 将各配方所得液态组合物，进行初步测试：直接涂抹于手背，发现都可吸收；其中，对照配方轻薄，流动较快，配方3的组合物相对略粘稠，配方2的组合物相对略稀，配方1相对更为舒适和吸收快。

[0096] 人参根提取物的冻干粉制备方法：

[0097] 原料人参(PANAX GINSENG)根提取物和虾青素的混合物中，虾青素质量分数为0.3％；

[0098]原料/组分 质量分数(％)
甘露醇 5
海藻糖 1
人参(PANAXGINSENG)根提取物和虾青素的混合物 0.2
水 加至100

[0099] 按照配方，将甘露醇，海藻糖用水溶解，经过121℃，0.1mPa，30分钟湿热灭菌，然后降温至室温；加入人参根提取物和虾青素的混合物，混合均匀，灌入容器，得到灌装半成品；将所得灌装半成品置入冻干机，预冻至‑40℃，保温1小时；然后抽真空至30Pa，加热至‑30℃，在温度‑30℃保温8小时；升温至‑5℃，保温5小时；升温至10℃，保温13小时；升温至25℃，保温10小时；然后取出；得到人参根提取物的冻干粉。

[0100] 分别取所得冻干粉21mg，所得液态组合物1mL，混合，摇动30秒，观察发现：都可混合均匀；配方3的组合物混合溶解略慢，配方2的组合物溶解相对较快。

[0101] 实施例2：美白功效测试

[0102] 样品配制方法：取实施例1中配方1所得液态组合物10mL和冻干粉187.5mg，混合，溶解，得到混合液；然后取1mL混合液，加水稀释至200mL，得到浓度为0.5％的样品。

[0103] 采用斑马鱼试验方法，使用斑马鱼测试样品是否可以抑制酪氨酸激酶活性及抑制率情况；使用野生型AB品系斑马鱼，鱼龄：受精后6小时(6hpf)；按照实验室标准饲养和繁殖方法，符合国际AAALAC认证的要求，饲养和繁殖成鱼。

[0104] 随机选取斑马鱼于6孔板中，每孔15尾；按照设定浓度(体积比)，将测试样品用水溶解，同时设置正常对照组(不加测试样品)，每孔容量为3mL，并且三次生物学重复；28℃条件下避光孵育45h；每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于解剖显微镜下拍照，用高级图像处理软件分析并采集数据，分析斑马鱼头部黑色素信号强度(S)，根据公式计算并判断样品是否具有美白功效；

[0105] 美白功效＝(正常对照组S‑样品组S)/正常对照组S*100％；

[0106] 统计学分析p<0.05，判定为有显著性差异；结果见下表。

[0107]样品浓度 抑制率 P值 检测结果
0.5％ 21％ <0.001 显著

[0108] 根据实验结果可知，所述组合物具有明显的美白功效。

[0109] 实施例3：弹性蛋白酶抑制测试

[0110] 样品配制方法：

[0111] 样品：取实施例1中配方1所得液态组合物10mL和冻干粉187.5mg，混合，溶解，然后加水稀释至总体积为40mL，得到浓度为25％的样品；

[0112] 对照配方组样品：取实施例1中对照配方所得液态组合物3mL和冻干粉62mg，混合，溶解，得到浓度为100％的样品。

[0113] 弹性蛋白酶抑制实验原理是弹性蛋白酶与酶底物发生反应，添加活性物质后吸光度发生变化，通过测定吸光度变化的大小可以反映弹性蛋白酶抑制剂抑制率的大小。

[0114] 参照《化妆品抗皱紧致功效体外测试方法(弹性蛋白酶抑制法)》设计、进行实验：在96孔板中加入适量的缓冲溶液、待测样品溶液或对照溶液、底物，振荡混匀后孵育20分钟，随后加入弹性蛋白酶溶液，立即振荡孵育10分钟，用酶标仪在410nm处测定吸光度，分析处理数据计算待测样品对弹性蛋白酶的抑制率；弹性蛋白酶抑制率(％)＝[1‑(A‑B)/(C‑D)]*100％，式中：

[0115] A为实验组吸光度(含底物、缓冲溶液、弹性蛋白酶溶液，含待测样品溶液)；

[0116] B为实验空白组吸光度(含底物、缓冲溶液，不含弹性蛋白酶溶液，含待测样品溶液)；

[0117] C为对照组吸光度(含底物、缓冲溶液、弹性蛋白酶溶液，不含待测样品溶液)；

[0118] D为空白组吸光度(含底物、缓冲溶液，不含弹性蛋白酶溶液，不含待测样品溶液)；

[0119] 实验结果见下表。

[0120] 实验分组 实验浓度 弹性蛋白酶抑制率(％) P值 差异性分析样品 25％ 15.94 <0.05  
对照配方组样品 100％ 14.49 <0.05 有统计学差异
阳性对照组：槲皮素溶液 200μg/mL 94.42 <0.05 有统计学差异
阴性对照组：水 / 1.20 / /

[0121] 备注：p<0.05说明与阴性对照组相比有统计学差异，p≥0.05说明与阴性对照组相比无统计学差异。

[0122] 阳性对照组浓度为200μg/mL时，弹性蛋白酶抑制率≥90％，说明反应体系有效；根据实验结果可知，本发明的组合物样品可以有效抑制弹性蛋白酶，相对对照配方的样品，在浓度降低的情况下，抑制弹性蛋白酶作用还有提升，本发明提供的组合物具有相对更强的紧致抗皱作用。

[0123] 实施例4：抗皱、紧致功效测试

[0124] 样品配制方法：取实施例1中配方1所得液态组合物10mL和冻干粉187.5mg，混合，溶解，得到混合液；然后：

[0125] 取1mL混合液，加水稀释至20mL，得到浓度为5％的样品；

[0126] 取1mL混合液，加水稀释至40mL，得到浓度为2.5％的样品；

[0127] 取1mL混合液，加水稀释至80mL，得到浓度为0.125％的样品。

[0128] 培养液：低糖DMEM培养液；

[0129] 空白对照组：低糖DMEM培养液；

[0130] 阴性对照组：低糖DMEM培养液；

[0131] 阳性对照组：含有100μg/mLVC(维生素C)和7μg/mLVE(维生素E)的培养液；

[0132] 按适宜的接种密度(8×104/孔)接种人源成纤维细胞至24孔板，培养箱(37℃、5％CO2)中孵育12小时；待24孔板中细胞铺板率达到40％～60％时进行辐照，阴性对照组、阳性2
对照组及样品组接受剂量为9J/cm 的UVA辐射，同时，空白对照组放置于相同的环境(UVA辐
2
射剂量为0J/cm)；辐照结束后，空白对照组、阴性对照组每孔加入1mL的细胞培养液；阳性对照组每孔加入1mL含有100μg/mLVC(维生素C)和7μg/mLVE(维生素E)的培养液；样品组每孔加入1mL含有相应浓度样品的培养液；孵育培养24h后，收集细胞培养上清液于EP管中，置于‑80℃冰箱冷冻保存；根据ELISA检测试剂盒的操作说明书对Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白的含量(单位：ng/mL)进行检测分析，根据ELISA检测试剂盒的操作说明书对弹性蛋白的含量(单位：ng/mL)进行检测分析；测试结果见下表。

[0133]

[0134] 备注：用t‑test双尾检验方法进行统计分析时，NC组与BC组相比，显著性以#表示，p<0.05表示为#，p<0.01表示为##；PC组、样品组与NC组相比，显著性以*表示，p<0.05表示为*，p<0.01表示为**。

[0135] 根据实验结果可知，与BC组相比，NC组人源成纤维细胞接受剂量为9J/cm2的UVA辐射后，Ⅰ型胶原蛋白，Ⅲ型胶原蛋白和弹性蛋白含量显著下降(p<0.01)，说明本次造模成功；与NC组相比，PC组的VC和VE可以显著提高I型胶原蛋白，Ⅲ型胶原蛋白和弹性蛋白的含量水平(p<0.01)，表明阳性对照检测有效；与NC组相比，样品在浓度为1.25％、2.50％和5.00％时，人源成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白含量显著提升(p<0.01)，Ⅲ型胶原蛋白含量显著提升(p<
0.05)，弹性蛋白含量显著提升(p<0.01)，且与NC组相比都具有统计学差异；由此可确定，本发明提供的组合物具有抗皱、紧致功效。

[0136] 实施例5：抗皱功效测试

[0137] 样品配制方法：取实施例1中配方1所得液态组合物10mL和冻干粉187.5mg，混合，溶解，得到混合液；然后：

[0138] 取1mL混合液，加水稀释至20mL，得到浓度为5％的样品；

[0139] 取1mL混合液，加水稀释至40mL，得到浓度为2.5％的样品；

[0140] 取1mL混合液，加水稀释至80mL，得到浓度为0.125％的样品。

[0141] 培养液：低糖DMEM培养液；

[0142] 空白对照组：低糖DMEM培养液；

[0143] 阴性对照组：低糖DMEM培养液；

[0144] 阳性对照组：含有100μg/mLVC(维生素C)和7μg/mLVE(维生素E)的培养液；

[0145] 按适宜的接种密度(8×104/孔)接种人源成纤维细胞至24孔板，培养箱(37℃、5％CO2)中孵育12小时；待24孔板中细胞铺板率达到40％～60％时进行辐照，阴性对照组、阳性2
对照组及样品组接受剂量为9J/cm 的UVA辐射，同时，空白对照组放置于相同的环境(UVA辐
2
射剂量为0J/cm)；辐照结束后，空白对照组、阴性对照组每孔加入1mL的细胞培养液；阳性对照组每孔加入1mL含有100μg/mLVC(维生素C)和7μg/mLVE(维生素E)的培养液；样品组每孔加入1mL含有相应浓度样品的培养液；孵育培养24h后，每孔加入0.5mL裂解液，室温放置
5min，使其充分裂解，转移至1.5mLRNase‑free Eppendorf管中，按照操作规程提取RNA；按照RNA反转录试剂盒产品说明书，合成cDNA；对ⅩⅦ型胶原蛋白基因进行qRT‑PCR(实时定量反转录PCR)检测。测试结果见下表。

[0146]

[0147] 备注：用t‑test双尾检验方法进行统计分析时，NC组与BC组相比，显著性以#表示，p<0.05表示为#，p<0.01表示为##；PC组、样品组与NC组相比，显著性以*表示，p<0.05表示为*，p<0.01表示为**。

[0148] 根据实验结果可知，与BC组相比，NC组人成纤维细胞接受剂量为9J/cm2的UVA辐射后，ⅩⅦ型胶原蛋白基因相对表达量显著下降(p<0.01)，说明本次造模成功；与NC组相比，PC组的VC和VE可以显著提高ⅩⅦ型胶原蛋白基因相对表达量(p<0.01)，表明阳性对照检测有效；与NC组相比，样品在浓度为1.25％、2.5％和5％时，人源成纤维细胞ⅩⅦ型胶原蛋白基因相对表达量显著提升，且与NC组相比具有统计学差异(p<0.01)；由此可确定，本发明提供的组合物具有抗皱、紧致功效。

[0149] 根据上述测试结果可知，本发明提供的液态组合物，具有较好的促蛋白再生，提升皮肤弹性，美白、抗皱等改善皮肤衰老状态，抵抗衰老的作用。

[0150] 本发明的方案已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本发明内容和范围内对本文所述的方案或应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进条件/参数来实现和/或应用本发明技术。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。