[0001] 本发明涉及一种液态医药组合物。

[0002] 近年来，关于药液投给的医疗设备，从对针的恐惧症对策、追求可用性、减少感染性废弃物量等观点考虑，对无针注射器的关心提高。一般而言，无针注射器已知的是以压缩气体、弹簧的力为驱动力，从喷嘴顶端挤出药液，向生物体内投给药液的注射器(非专利文献1)。此外，开发了一种将点火药的燃烧能量用作射出能量的无针注射器(专利文献1)。

[0003] 将点火药的燃烧能量用作射出能量的所述无针注射器，由于瞬间挤出药液进行投给，因此能够将药液送达至细胞核、胞质溶胶。从药物传递系统(drug delivery systems，DDS)的观点考虑，所述无针注射器的有用性也备受关注，并且在使用具有抗癌作用的低分子、肽、蛋白质、抗体等的各种药剂中进行了应用的研究。特别是，在疫苗、免疫的领域，报道了所述无针注射器能够提高抗体滴度、诱导细胞免疫(非专利文献2)。

[0004] 在疫苗的领域中，产生了针对新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的疫苗开发等重大突破。在该疫苗中也以mRNA为有效成分的疫苗显示出在临床试验中的高有效性后(非专利文献
3)，在全世界使用，产生了很大的影响。所述mRNA疫苗是一种新的治疗方式(modality)，期待作为技术上的特异点。

[0005] 另一方面，核酸疫苗在得到足够的抗体滴度时，需要核酸中所含的基因的非常高的表达。在实际广泛使用的针对SARS‑CoV‑2的核酸疫苗中，均使用脂质纳米粒(Lipid NanoParticle，LNP)来用于提高基因表达。但是，LNP的新的开发不仅需要大量的劳力，而且制造成本也大。此外，也存在因LNP中使用的聚乙二醇(PEG)而引起的过敏性休克等与安全性有关的担忧。因此，迫切期望不使用LNP而提高基因表达的技术。此外，在使用无针注射器向注射对象投给包含基因的核酸的情况下，也正在进行用于实现与LNP相当的程度的基因表达的改良。

[0006] 现有技术文献

[0007] 专利文献

[0008] 专利文献1：日本特开2012‑61269号公报

[0009] 非专利文献

[0010] 非专利文献1：Clin.Cosmet.Investig.Dermatol.，2018May 1；11：231‑238非专利文献2：AAPS PharmSciTech.，2019Dec 9；21(1)：19

[0011] 非专利文献3：厚生劳动省，关于辉瑞公司的新型冠状病毒疫苗，[online]，[2022年3月11日检索]，互联网

[0038] 各实施方式中的各构成和它们的组合等是一个例子，可以在不脱离本公开的主旨的范围内适当进行构成的附加、省略、置换以及其他变更。本公开不受实施方式限定而仅受权利要求书限定。此外，本说明书所公开的各方案也可以与本说明书所公开的其他任何特征组合。

[0039] 本公开的一个实施方案是一种液态医药组合物，其中，所述液态医药组合物包含核酸和二价阳离子，所述二价阳离子的浓度以总量计为0.0406mM以上且小于81.1mM，所述液态医药组合物利用不经由注射针而将液态医药组合物注入至注入对象的注入器来被注入至注入对象。

[0040] (核酸)

[0041] 本实施方案的液态医药组合物所含的核酸只要是在注入对象中发挥生理活性的核酸就没有特别限制。

[0042] 所述核酸可以是DNA也可以是RNA。此外，所述核酸可以是包含编码蛋白质的部分的核酸，也可以是不含编码蛋白质的部分的核酸(非编码核酸)。此外，所述液态医药组合物中所含的所述核酸可以是一种，也可以是多种。

[0043] 作为所述核酸是包含编码蛋白质的部分的核酸的情况，可列举出下述内容。

[0044] 例如，若所述核酸是包含基因的DNA，则发挥作为用于产生蛋白质的mRNA合成(转录)时的模板这样的生理活性，其生理活性可以通过产生的mRNA、蛋白质的量来定量地进行评价。

[0045] 此外，若所述核酸为mRNA，则发挥作为蛋白质合成(翻译)时的模板这样的生理活性，其生理活性可以通过产生的蛋白质的量来定量地进行评价。

[0046] 此外，所述生理活性也可以基于因产生的mRNA、蛋白质增加或减少而引起的注入对象的变化来进行评价。例如，注入对象是能够诱导细胞免疫的注入对象(例如个体(生物体)等)，所述核酸是编码诱导细胞免疫的蛋白质的核酸，通过诱导该细胞免疫的蛋白质增加，在注入对象中产生细胞免疫被诱导这样的变化的情况下，所述核酸发挥诱导细胞免疫这样的生理活性，其生理活性可以通过该注入对象的细胞免疫的诱导量来定量地进行评价。此外，也可以通过诱导所述细胞免疫的蛋白质引起的再刺激(复敏)后的该注入对象的细胞免疫的诱导量来进行评价。

[0047] 作为所述核酸是不含编码蛋白质的部分的核酸的情况，可列举出下述内容。

[0048] 例如，在注入对象是能够被投给疫苗的个体(生物体)的情况下，若所述核酸是包含CpG基序的DNA(CpG DNA)或聚肌苷酸‑聚胞苷酸(polyinosine‑polycytidylic acid，PolyI：C)，则发挥作为用于提高疫苗效果的佐剂的生理活性，其生理活性可以通过抗肿瘤效果(该效果例如可以通过肿瘤尺寸的减小等进行评价)、免疫细胞的成熟度等来定量地进行评价。

[0049] 此外，若所述核酸为小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，则发挥分解mRNA并序列特异性地抑制靶基因表达这样的生理活性，其生理活性可以通过基于该靶基因产生的mRNA、蛋白质的量来定量地进行评价。

[0050] 此外，若所述核酸是反义DNA、反义RNA，则与靶基因的RNA杂交，发挥阻碍剪接、阻碍翻译这样的生理活性，其生理活性可以通过基于该靶基因产生的mRNA、蛋白质的量来定量地进行评价。

[0051] 本实施方案中的核酸在被注入至注入对象时在该注入对象中发挥生理活性，并稳定地存在，此外，若没有破坏该注入对象等不良影响，则可以是游离的形态，也可以是固定在纳米粒子等载体上的形态，也可以被修饰，包括溶剂，其方案没有特别限定。

[0052] 所述核酸可以是天然物，也可以是人工合成的核酸。

[0053] 在后述的实施例中，作为所述核酸，列举出：使用包含GFP(Green Fluorescence Protein，绿色荧光蛋白)基因的游离的质粒DNA，并将该GFP基因用作报告基因(reporter gene)的实施例；使用编码作为报告蛋白的GFP的mRNA的实施例；使用编码卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)的mRNA的实施例。

[0054] 在所述DNA包含基因的情况下，可以以在表达盒、表达载体中包含该基因的形态来进行设计。而且，例如，也可以在适合于待注入所述DNA的注入对象和注入部位的启动子的控制下配置基因。即，可以在任意方案中均使用公知的基因工程的方法。例如，在后述的实施例中，列举出使用包含GFP基因的载体CMV‑DASHER‑GFP(ATUM公司制)来作为表达载体的实施例。所述质粒载体是公知的，只要是本领域技术人员就能获取。表达载体和重组载体的亚克隆可以按照公知的方法进行。

[0055] 在本实施方案中，“能够在将包含在注入对象中发挥生理活性的核酸的液态医药组合物注入至注入对象时得到高的生理活性”是指，在用定量指标评价核酸所发挥的生理活性的情况下，与在利用不经由注射针而将液态医药组合物注入至注入对象的注入器来将包含核酸且二价阳离子的浓度以总量计不在后述的规定范围内的液态医药组合物注入至注入对象时的、该核酸所发挥的生理活性(该生理活性例如可以是表示该生理活性的量)相比，将包含核酸且二价阳离子的浓度以总量计在后述的规定范围内的液态医药组合物与上述同样地注入时的、该核酸所发挥的生理活性(该生理活性例如可以是表示该生理活性的量)更大。

[0056] 即，例如，当将在利用不经由注射针而将液态医药组合物注入至注入对象的注入器来将包含核酸且二价阳离子的浓度以总量计小于0.0406mM且81.1mM以上的液态医药组合物注入至注入对象时(将其作为方案B)的、该核酸所发挥的生理活性设为“活性B”，将在除了包含核酸且二价阳离子的浓度以总量计设为0.0406mM以上且小于81.1mM以外设为与方案B相同的条件，并与上述同样地将液态医药组合物注入至注入对象时(将其作为方案A)的、该核酸所发挥的生理活性设为“活性A”时，活性B<活性A。

[0057] 此外，在本实施方案中，也可以是，“能够在将包含在注入对象中发挥生理活性的核酸的液态医药组合物注入至注入对象时得到高的生理活性”是指，在用定量指标评价核酸所发挥的生理活性的情况下，与利用有针注射器来将包含核酸且二价阳离子的浓度以总量计在后述的规定范围内的液态医药组合物注射至注射对象时的、该核酸所发挥的生理活性(该生理活性例如可以是表示该生理活性的量)相比，在除了利用不经由注射针而将液态医药组合物注入至注入对象的注入器来将包含核酸且二价阳离子的浓度以总量计在后述的规定范围内的液态医药组合物注入至注入对象以外与上述同样地注入时的、该核酸所发挥的生理活性(该生理活性例如可以是表示该生理活性的量)更大。

[0058] 即，例如，也可以是，当将在利用有针注射器来将包含核酸且二价阳离子的浓度以总量计为0.0406mM以上且小于81.1mM的液态医药组合物注射至注射对象时(将其作为方案C)的、该核酸所发挥的生理活性设为“活性C”，将在除了利用不经由注射针而将液态医药组合物注入至注入对象的注入器来将包含核酸且二价阳离子的浓度以总量计为0.0406mM以上且小于81.1mM的液态医药组合物注入至注入对象以外设为与方案C相同的条件时(将其作为方案A)的、该核酸所发挥的生理活性设为“活性A”时，活性C<活性A。

[0059] 在通过定量指标(例如表达量、细胞免疫的诱导量、抗肿瘤效果、免疫细胞的成熟度等)评价所述核酸所发挥的生理活性的情况下，该定量指标根据所述核酸所发挥的生理活性适当设定即可。

[0060] 对于所述定量指标而言，例如若在所述核酸为DNA即包含基因的情况下，则例如可列举出以其为模板产生的mRNA、以该mRNA为模板产生的蛋白质的量(通常作为该基因的表达量进行评价)等。

[0061] 此外，例如，若所述核酸为mRNA，则例如可列举出以其为模板产生的蛋白质的量等。

[0062] 即，例如，在所述核酸为DNA即包含基因的情况下，在所述定量指标为该基因的表达量的情况下，当将在利用不经由注射针而将液态医药组合物注入至注入对象的注入器来将二价阳离子的浓度以总量计小于0.0406mM且81.1mM以上的液态医药组合物注入至注入对象时(将其作为方案B1)的、该基因的表达量设为“表达量B1”，将在除了二价阳离子的浓度以总量计设为0.0406mM以上且小于81.1mM以外设为与方案B1相同的条件，并与上述同样地将液态医药组合物注入至注入对象时(将其设为方案A1)的、该基因的表达量设为“表达量A1”时，表达量B1<表达量A1。

[0063] 此外，也可以是，当将在利用有针注射器来将二价阳离子的浓度以总量计为0.0406mM以上且小于81.1mM的液态医药组合物注射至注射对象时(将其作为方案C1)的、该基因的表达量设为“表达量C1”，将在除了利用不经由注射针而将液态医药组合物注入至注入对象的注入器来将二价阳离子的浓度以总量计为0.0406mM以上且小于81.1mM的液态医药组合物注入至注入对象以外设为与方案C1相同的条件时(将其设为方案A1)的、该基因的表达量设为“表达量A1”时，表达量C1<表达量A1。

[0064] 此外，对于所述定量指标而言，例如，在所述核酸是编码诱导细胞免疫的蛋白质的核酸，所述定量指标是细胞免疫的诱导量的情况下，当将在利用不经由注射针而将液态医药组合物注入至注入对象的注入器来将二价阳离子的浓度以总量计小于0.0406mM且81.1mM以上的液态医药组合物注入至注入对象时(将其作为方案B2)的、该细胞免疫的诱导量设为“诱导量B1”，将在除了二价阳离子的浓度以总量计设为0.0406mM以上且小于81.1mM以外设为与方案B1相同的条件，并与上述同样地将液态医药组合物注入至注入对象时(将其作为方案A1)的、该细胞免疫的诱导量设为“诱导量A1”时，诱导量B1<诱导量A1。

[0065] 该关系在诱导所述细胞免疫的蛋白质的再刺激(复敏)后的、该注入对象中的细胞免疫的诱导量也是同样的。

[0066] 所述细胞免疫的诱导量只要是表示细胞免疫的诱导程度的诱导量即可，例如，也可以是如后述的实施例那样使用ELISpot(enzyme‑linked immunosorbent spot：酶联免疫斑点)试剂盒时的斑点(spot)数等。

[0067] 此外，也可以是，当将在利用有针注射器来将二价阳离子的浓度以总量计为0.0406mM以上且小于81.1mM的液态医药组合物注射至注射对象时(将其作为方案C1)的、该细胞免疫的诱导量设为“诱导量C1”，将在除了利用不经由注射针而将液态医药组合物注入至注入对象的注入器来将二价阳离子的浓度以总量计为0.0406mM以上且小于81.1mM的液态医药组合物注入至注入对象以外设为与方案C1相同的条件时(将其作为方案A1)的、该细胞免疫的诱导量设为“诱导量A1”时，诱导量C1<诱导量A1。

[0068] 该关系在诱导所述细胞免疫的蛋白质的再刺激(复敏)后的、该注入对象中的细胞免疫的诱导量也是同样的。

[0069] 作为所述定量指标的评价方法，例如可以在将所述液态医药组合物注入至注入对象后，使用该注入对象的全部或一部分，根据所述核酸所发挥的生理活性适当选择。

[0070] 例如，如后述的实施例那样，可以在注入对象是个体(生物体)、所述核酸是包含基因的DNA、且对注入部位周边(即注入对象的一部分)的该基因的表达量进行评价的情况下，在将所述液态医药组合物注入至注入对象后，获取该注入部位的周边，根据所述核酸所发挥的生理活性适当选择。

[0071] 此外，如后述的实施例那样，可以通过公知的方法，制备样品，并以蛋白质的产生量来评价所述核酸所发挥的生理活性。在后述的实施例中，由于产生的蛋白质是GFP蛋白质，因此以荧光亮度为指标来评价生理活性。

[0072] 此外，例如，如后述的实施例那样，可以在注入对象是个体(生物体)、所述核酸是编码诱导细胞免疫的蛋白质的核酸、且对细胞免疫的诱导量进行评价的情况下，在将所述液态医药组合物注入至注入对象后，使用该个体(生物体)本身(即注入对象的全部)，并使用对细胞免疫的诱导量进行评价的公知的方法等来对细胞免疫的诱导量进行评价。

[0073] 此外，在本实施方案中，在将含有在注入对象中发挥生理活性的核酸的液态医药组合物注入至注入对象时得到的生理活性能够长时间发挥。

[0074] 根据所述核酸的种类、注入对象、在注入了所述核酸的注入对象中所述核酸所发挥的生理活性等，所述生理活性发挥的时期不同，通常，从所述液态医药组合物注入至注入对象的时刻起经过规定的时间后发挥。

[0075] 所述生理活性的发挥开始的时刻(始期)优选从所述液态医药组合物注入至注入对象的时刻起尽可能早，例如从所述液态医药组合物注入至注入对象的时刻起6小时后。另一方面，所述生理活性的发挥结束的时刻(终期)优选从所述液态医药组合物注入至注入对象的时刻起尽可能迟，例如从所述液态医药组合物注入至注入对象的时刻起1天后、2天后、3天后、5天后、7天后、14天后。

[0076] (二价阳离子)

[0077] 当本实施方案的液态医药组合物中的二价阳离子的浓度的总量在规定范围内时，在利用不经由注射针而将液态医药组合物注入至注入对象的注入器来将该液态医药组合物注入至注入对象时，与注入以往的液态医药组合物的情况相比，能够得到更高的生理活性。

[0078] 作为所述规定范围的下限，例如为0.0406mM以上、0.203mM以上、0.406mM以上、0.492mM以上、2.03mM以上、3.47mM以上、3.9mM以上、4.06mM以上、4.15mM以上、4.92mM以上、
6.8mM以上、40.6mM以上、49.2mM以上。

[0079] 将所述液态医药组合物注入至注入对象时得到高的生理活性的机理并不明确，但推测如下。需要说明的是，本公开不限于下述推测。

[0080] 众所周知，在使用了原子力显微镜(Atomic Force Microscope，AFM)的核酸研究、细胞分裂期的染色体凝缩的研究中，核酸具有因如镁离子那样的二价阳离子共存而诱发电荷交联，凝集的作用。

[0081] 另一方面，就利用不经由注射针而将液态医药组合物注入至注入对象的注入器来将核酸送达至细胞内而言，是通过瞬间进行注入并施加高能量，使核酸物理性穿过细胞膜而实现的。细胞膜的结构是磷脂双层膜，在核酸物理性穿过细胞膜的情况下，与经由受体、对细胞膜的吸附的情况不同，明确了粒径等空间位阻对穿过的效率有很大影响。作为事实，报道了纳米粒子的细胞膜的直接穿过优选为小粒径。

[0082] 由以上推测：通过核酸和二价阳离子共存，引起核酸的粗粒化和流体力学直径的减小，核酸向细胞内的送达效率提高。而且，推测：在使用了利用不经由注射针而将液态医药组合物注入至注入对象的注入器的情况下，核酸向细胞内的送达效率提高，能够得到高的生理活性。

[0083] 基于以上推测：在注入对象为细胞的情况或包含细胞的情况下，所述二价阳离子的浓度的总量大，则容易进行核酸的粗粒化，流体力学直径容易减小，其结果是，向细胞内的核酸的注入量容易增加，容易得到高的生理活性。反过来说，所述二价阳离子的浓度的总量小，则不易进行核酸的粗粒化，流体力学直径不易减小，其结果是，向细胞内的核酸的注入量也不易增加，难以得到高的生理活性。

[0084] 此外，作为所述规定范围的上限，例如为小于81.1mM、49.2mM以下、40.6mM以下、6.8mM以下、4.92mM以下、4.15mM以下、4.06mM以下、3.9mM以下、3.47mM以下、2.03mM以下、
0.492mM以下、0.406mM以下、0.203mM以下。

[0085] 所述二价阳离子的浓度的总量小，则能够尽可能地抑制因注入所述液态医药组合物而引起的注入对象的负荷。例如，在注入对象是细胞的情况或包含细胞的情况下，能够尽可能地抑制细胞受损或死亡。

[0086] 鉴于采用上限的理由和采用下限的理由，所述规定范围的上限和下限可以是从上述的上限的例子和下限的例子中选择的不矛盾的组合。具体而言，可以是下述内容。

[0087] 例如，可以为0.0406mM以上且小于81.1mM、0.0406mM以上且49.2mM以下、0.0406mM以上且40.6mM以下、0.0406mM以上且6.8mM以下、0.0406mM以上且4.92mM以下、0.0406mM以上且4.15mM以下、0.0406mM以上且4.06mM以下、0.0406mM以上且3.9mM以下、0.0406mM以上且3.47mM以下、0.0406mM以上且2.03mM以下、0.0406mM以上且0.492mM以下、0.0406mM以上且0.406mM以下、或0.0406mM以上且0.203mM以下。

[0088] 此外，例如，可以为0.203mM以上且小于81.1mM、0.203mM以上且49.2mM以下、0.203mM以上且40.6mM以下、0.203mM以上且6.8mM以下、0.203mM以上且4.92mM以下、
0.203mM以上且4.15mM以下、0.203mM以上且4.06mM以下、0.203mM以上且3.9mM以下、
0.203mM以上且3.47mM以下、0.203mM以上且2.03mM以下、0.203mM以上且0.492mM以下、或
0.203mM以上且0.406mM以下。

[0089] 此外，例如，可以为0.406mM以上且小于81.1mM、0.406mM以上且49.2mM以下、0.406mM以上且40.6mM以下、0.406mM以上且6.8mM以下、0.406mM以上且4.92mM以下、
0.406mM以上且4.15mM以下、0.406mM以上且4.06mM以下、0.406mM以上且3.9mM以下、0.406以上且3.47mM以下、0.406mM以上且2.03mM以下、或0.406mM以上且0.492mM以下。

[0090] 此外，例如，可以为0.492以上且小于81.1mM、0.492mM以上且49.2mM以下、0.492mM以上且40.6mM以下、0.492mM以上且6.8mM以下、0.492mM以上且4.92mM以下、0.492mM以上且4.15mM以下、0.492mM以上且4.06mM以下、0.492mM以上且3.9mM以下、0.492mM以上且3.47mM以下、或0.492mM以上且2.03mM以下。

[0091] 此外，例如，可以为2.03mM以上且小于81.1mM、2.03mM以上且49.2mM以下、2.03mM以上且40.6mM以下、2.03mM以上且6.8mM以下、2.03mM以上且4.92mM以下、2.03mM以上且4.15mM以下、2.03mM以上且4.06mM以下、2.03mM以上且3.9mM以下、或2.03mM以上且3.47mM以下。

[0092] 此外，例如，可以为3.47mM以上且小于81.1mM、3.47mM以上且49.2mM以下、3.47mM以上且40.6mM以下、3.47mM以上且6.8mM以下、3.47mM以上且4.92mM以下、3.47mM以上且4.15mM以下、3.47mM以上且4.06mM以下、或3.47mM以上且3.9mM以下。

[0093] 此外，例如，可以为3.9mM以上且小于81.1mM、3.9mM以上且49.2mM以下、3.9mM以上且40.6mM以下、3.9mM以上且6.8mM以下、3.9mM以上且4.92mM以下、3.9mM以上且4.15mM以下、或3.9mM以上且4.06mM以下。

[0094] 此外，例如，可以为4.06mM以上且小于81.1mM、4.06mM以上且49.2mM以下、4.06mM以上且40.6mM以下、4.06mM以上且6.8mM以下、4.06mM以上且4.92mM以下、或4.06mM以上且4.15mM以下。

[0095] 此外，例如，可以为4.15mM以上且小于81.1mM、4.15mM以上且49.2mM以下、4.15mM以上且40.6mM以下、4.15mM以上且6.8mM以下、或4.15mM以上且4.92mM以下。

[0096] 此外，例如，可以为4.92mM以上且小于81.1mM、4.92mM以上且49.2mM以下、4.92mM以上且40.6mM以下、或4.92mM以上且6.8mM以下。

[0097] 此外，例如，可以为6.8mM以上且小于81.1mM、6.8mM以上且49.2mM以下、或6.8mM以上且40.6mM以下。

[0098] 此外，例如，可以为40.6mM以上且小于81.1mM、或40.6mM以上且49.2mM以下。

[0099] 此外，例如，可以为49.2mM以上且小于81.1mM。

[0100] 作为所述二价阳离子，例如可列举出：Mg2+、Ca2+、Ba2+、Cu2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+等，优选2+ 2+ 2+ 2+
为Mg 、Ca 、Mn 、Zn 。此外，所述液态医药组合物中所含的所述二价阳离子可以是一种，也可以是多种。

[0101] 所述二价阳离子的供给源可以是溶解于溶剂时产生所述二价阳离子的“盐”。作为盐，例如可列举出：盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、天冬氨酸盐、醋酸盐、乳酸盐、葡萄糖酸盐等。此外，所述二价阳离子的供给源可以是水合物的形态。

[0102] 作为Mg2+源，例如可列举出：氯化镁、硫酸镁、硝酸镁、天冬氨酸镁、醋酸镁、乳酸镁、葡萄糖酸镁等。从通用性的观点考虑，优选氯化镁、硫酸镁、硝酸镁、天冬氨酸镁。

[0103] 作为Ca2+源，例如可列举出：氯化钙、硫酸钙、硝酸钙、天冬氨酸钙、醋酸钙、乳酸钙、葡萄糖酸钙等。从通用性的观点考虑，优选氯化钙。

[0104] 作为Ba2+源，例如可列举出：氯化钡、硫酸钡、硝酸钡、天冬氨酸钡、醋酸钡、乳酸钡、葡萄糖酸钡等。

[0105] 作为Cu2+源，例如可列举出：氯化铜(II)、硫酸铜(II)、硝酸铜(II)、天冬氨酸铜(II)、醋酸铜(II)、乳酸铜(II)、葡萄糖酸铜(II)等。

[0106] 作为Fe2+源，例如可列举出：氯化铁(II)、硫酸铁(II)、硝酸铁(II)、天冬氨酸铁(II)、醋酸铁(II)、乳酸铁(II)、葡萄糖酸铁(II)等。

[0107] 作为Mn2+源，例如可列举出：氯化锰(II)、硫酸锰(II)、硝酸锰(II)、天冬氨酸锰(II)、醋酸锰(II)、乳酸锰(II)、葡萄糖酸锰(II)等。从通用性的观点考虑，优选硫酸锰(II)。

[0108] 作为Zn2+源，例如可列举出：氯化锌、硫酸锌、硝酸锌、天冬氨酸锌、醋酸锌、乳酸锌、葡萄糖酸锌等。

[0109] (注入对象)

[0110] 本实施方案中的注入对象例如可以为选自由细胞、细胞片、细胞团、组织、器官(皮肤、脏器等)、器官系统、个体(生物体)等构成的组中的一种以上，没有限制。可以是以体外(in vitro)系统、活体(in vivo)系统、离体(ex vivo)系统为代表的任意种。所述细胞团可以是通过三维培养得到的细胞团，所述器官(皮肤、脏器等)可以是类器官。

[0111] 此外，在对所述注入对象进行注入的情况下，也可以注入至对象所含的下位的层级。即，例如，在将个体(生物体)作为注入对象的情况下，可以注入至该个体(生物体)所含的组织，也可以注入至该个体(生物体)所含的细胞，也可以注入至两者。此外，在将组织作为注入对象的情况下，可以注入至该组织所含的细胞，可以注入至该组织所含的细胞间基质，也可以注入至两者。

[0112] 此外，在本实施方案中的注入对象为选自由细胞、细胞片、细胞团、组织、器官(皮肤、脏器等)、器官系统构成的组中的一种以上的情况下，可以为存在于个体(生物体)中的状态下的选自由细胞、细胞片、细胞团、组织、器官(皮肤、脏器等)、器官系统构成的组中的一种以上，也可以为不存在于个体(生物体)中的状态(例如，从个体(生物体)摘除、分离的状态，在个体(生物体)外制作的状态)下的选自由细胞、细胞片、细胞团、组织、器官(皮肤、脏器等)、器官系统构成的组中的一种以上。

[0113] 此外，本实施方案中的注入对象也可以为选自由源自iPS细胞(人工多功能干细胞)等干细胞的细胞、细胞片、细胞团、组织、器官(皮肤、脏器等)、器官系统构成的组中的一种以上，它们可以为存在于个体(生物体)中的状态，也可以为不存在于个体(生物体)中的状态(例如，从个体(生物体)摘除、分离的状态，在个体(生物体)外制作的状态)。所述细胞团可以是通过三维培养得到的细胞团，所述器官(皮肤、脏器等)可以是类器官。

[0114] 所述个体(生物体)优选为哺乳动物的个体(生物体)。作为所述哺乳动物没有特别限制，可列举出人，此外可列举出除人以外的哺乳动物。作为除人以外的哺乳动物，可列举出：小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、牛、山羊、绵羊、猪、猴、犬、猫等。

[0115] 此外，本实施方案中的注入对象无论为上述的任意种，在注入于细胞的情况下，均可以注入至该细胞的细胞质，也可以注入至该细胞的细胞核，也可以注入至该细胞的细胞质和细胞核这两者。

[0116] 此外，本实施方案中的注入对象没有特别限制，优选哺乳动物的个体(生物体)的皮肤内的选自由皮内、皮下以及在其下部的肌肉层构成的组中的一种以上。在该情况下，可以采用将所述液态医药组合物从注入器向皮肤表面射出并注入至皮肤，注入至选自由该皮肤内的皮内、皮下及皮肤下部的肌肉层构成的组中的一种以上的方法。

[0117] (液态医药组合物)

[0118] 在本实施方案的液态医药组合物中，所述核酸和所述二价阳离子可以是溶解在药理学上可接受的液体(溶剂)中的形态。作为所述药理学上可接受的液体，例如可列举出使用了水(例如注射用水等)、磷酸的缓冲液(例如磷酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水(PBS)(可以是PBS(+)，也可以是PBS(‑))等。

[0119] 需要说明的是，在本公开中，“溶解”可以是“悬浮”、“乳化”，“溶液”可以是“悬浮液”、“乳化液”，“溶剂”可以是“悬浮剂”、“乳化剂”。

[0120] 本实施方案的液态医药组合物除了包含所述核酸和所述二价阳离子以外，还可以与医药组合物用无毒性载体混合。作为该载体，例如可列举出：葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、糊精、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、羟乙基淀粉、乙二醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、氨基酸、明胶、白蛋白、水、生理盐水等。此外，也可以根据需要，适当添加稳定化剂、湿润剂、乳化剂、结合剂、等渗剂(isotonic agent)等惯用的添加剂。

[0121] 所述核酸相对于本实施方案的液态医药组合物总量的含量可以基于所述核酸的种类、注入对象、在注入了所述核酸的注入对象中所述核酸所发挥的生理活性等适当设定。此外，也可以考虑所述二价阳离子的含量而适当设定。

[0122] 此外，所述液态医药组合物向注入对象的注入量可以基于所述核酸的含量或种类、注入对象、在注入了所述核酸的注入对象中所述核酸所发挥的生理活性等适当设定。此外，也可以考虑所述二价阳离子的注入量而适当设定。

[0123] 就本实施方案的液态医药组合物的pH而言，只要在利用不经由注射针而将液态医药组合物注入至注入对象的注入器来将所述液态医药组合物注入至注入对象时，所述核酸在该注入对象中发挥生理活性，并稳定地存在，此外没有破坏该注入对象等不良影响，所述pH就没有特别限制。

[0124] 本实施方案的液态医药组合物可以是疫苗的形态。

[0125] 本实施方案的液态医药组合物优选用于诱导细胞免疫的用途。在该情况下，所述注入对象可以是能够诱导细胞免疫的注入对象(例如个体(生物体)等)。所述核酸可以是编码诱导细胞免疫的蛋白质的核酸。在后述的实施例中，使用卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)作为诱导所述细胞免疫的蛋白质，但细胞免疫是对异物的免疫反应，所述诱导细胞免疫的蛋白质不仅限定于OVA。

[0126] 所述诱导细胞免疫可以是因诱导细胞免疫而引起的次要现象。例如，可以是产生干扰素γ(IFN‑γ)的诱导。

[0127] (注入器)

[0128] 作为本实施方案中的注入器，可以使用能够不经由注射针而将所述液态医药组合物注入至所述注入对象的注入器。即，所述液态医药组合物能够利用不经由所述注射针而将液态医药组合物注入至注入对象的注入器来注入至注入对象。

[0129] 在本实施方案中的注入器中，“顶端侧”是指配置有从注入器射出所述液态医药组合物的射出口的一侧，“基端侧”是指在注入器中与顶端侧相反的一侧，这些表述并不限定地表示特定的部位、位置。

[0130] 在本实施方案中的注入器中，为了向所述注入对象射出所述液态医药组合物，驱动部进行射出能量的赋予。本实施方案中的由注入器实现的“射出”通过如下方式实现：利用由所述驱动部赋予的射出能量而由所述加压部对容纳于所述容纳部的所述液态医药组合物进行加压，由此使所述液态医药组合物流过容纳部的流路。作为射出能量，可以是用于以往的注入器的射出能量，例如可以利用火药等的燃烧能量、气体发生剂等的发生能量、压电元件等的电能、弹簧等的机械能等，此外，可以利用将这些形式的能量适当组合而成的能量。

[0131] 在将火药的燃烧能量用作射出能量的情况下，作为火药，例如可列举出：包含锆和高氯酸钾的火药(ZPP)、包含氢化钛和高氯酸钾的火药(THPP)、包含钛和高氯酸钾的火药(TiPP)、包含铝和高氯酸钾的火药(APP)、包含铝和氧化铋的火药(ABO)、包含铝和氧化钼的火药(AMO)、包含铝和氧化铜的火药(ACO)、包含铝和氧化铁的火药(AFO)中的任一种火药、或包含它们中的多种的组合的火药。作为这些火药的特征，即使其燃烧产物在高温状态下为气体，在常温下也不含气体成分，因此点火后燃烧产物立即进行冷凝。由此，在用于射出所述液态医药组合物的加压过程中，能通过点火药的燃烧，使该加压时的燃烧产物的温度在施加于所述液态医药组合物的压力迎来第一个峰值射出力后在短时间内推移至常温附近。

[0132] 此外，在将气体发生剂的发生能量用作射出能量的情况下，作为气体发生剂，也可以使用单基无烟火药(例如可列举出包含硝化纤维素98质量％、二苯胺0.8质量％、硫酸钾1.2质量％的单基无烟火药)、在气囊用气体发生器或安全带预紧器用气体发生器中使用的各种气体发生剂。

[0133] 在本实施方案中的注入器中，通过加压部，在工作时对容纳于所述容纳部的所述液态医药组合物加压，由此使所述液态医药组合物从所述射出口向所述注入对象射出。

[0134] 由所述加压部实现的加压只要没有破坏系统，例如破坏所述容纳部等，就没有特别限制，可以采用通常的注入器的加压条件。

[0135] 其中，所述压力是指容纳部内的压力。该测定方法没有特别限制，例如可以如下所述地进行测定。即，如日本特开2005‑21640号公报中记载的测定方法那样，通过如下方法进行测定：将射出的力分散地施加在配置于喷嘴的下游的测力传感器的隔膜(diaphragm)，来自测力传感器的输出经由检测放大器，由数据采集装置采集，存储为按照时间的射出力(N)。通过将如此测定出的射出压力除以注入器的射出口31a的面积，计算出射出压力。容纳部的内压测定的测定值与射出压力相同，能以射出压力作为容纳部内的压力。

[0136] 由上述驱动部得到的射出能量经由活塞传递到柱塞，使柱塞在容纳部内滑动，由此容纳于容纳部的所述液态医药组合物沿着形成于喷嘴部的流路被挤出，最终从射出口向注入对象射出。

[0137] 容纳部可以从一开始就容纳所述液态医药组合物，也可以不容纳所述液态医药组合物，在未容纳的情况下，通过经由具有射出口的喷嘴将所述液态医药组合物吸引到容纳部内来容纳。如此，通过采用需要对容纳部进行容纳操作的构成，能够向注入对象注入需要的任意的所述液态医药组合物。因此，在本实施方案中的注入器中，注射筒(syringe)部与注入器主体构成为可拆装。

[0138] 本实施方案中的所述利用不经由注射针而将液态医药组合物注入至注入对象的注入器来被注入至注入对象可以是通过喷射注射被注入至注入对象。

[0139] 在此，在本公开中，“喷射注射”是指不经由注射针的注射，该注射的特征在于，包含核酸和二价阳离子且所述二价阳离子的浓度以总量计为0.0406mM以上且小于81.1mM的液态医药组合物从射出口向注入对象射出，由此形成贯穿注入对象的内与外的边界的贯通孔，产生能够穿过该贯通孔而将液态医药组合物注入至注入对象内的高压的超微液流。例如，在注入对象是哺乳动物的个体(生物体)的情况下，该注射是指特征在于以产生能够贯穿该哺乳动物的个体(生物体)的例如皮肤的高压的超微液流的注射。

[0140] 本实施方案中的注入器可以以如下方式得到：在能用于不经由注射针而将注射液(液态医药组合物)注入至注入对象的以往的注入器中，使所述液态医药组合物容纳于所述容纳部。作为这样的以往的注入器，例如可列举出：国际公开第2019/156238号中记载的注入器、国际公开第2019/156239号中记载的注入器、国际公开第2019/156237号中记载的注入器、日本专利5989039号说明书中记载的注入器等。它们是能够进行所述喷射注射的注入器，但除此以外，还存在很多能够进行所述喷射注射的市售的注入器(无针注射器)。例如可列举出：Straits(Pharmajet公司)、Tropis(Pharmajet公司)、Vitajet(Bioject Medical Technologies Inc.)、Biojector 2000(Bioject Medical Technologies Inc.)、Bioject Zetajet(Bioject Medical Technologies Inc.)、Glide(Glide Pharma公司)、MediJector Vision(Antares公司)、Sumaval DosePro(Zogenix公司)、SQ Pen(Bespak公司)、Injex(Equidyne公司)、透明质酸注射筒(BEAUTTO公司，Amazon Standard Identification Number(ASIN)：B08NCHTRHZ)等。

[0141] 以下，参照附图，作为本实施方式的注入器的例子，对注射器1(无针注射器)进行说明。需要说明的是，以下实施方式的构成是示例，不限定于本实施方式的构成。需要说明的是，使用“顶端侧”和“基端侧”作为表示注射器1的长度方向上的相对位置关系的术语。所述“顶端侧”表示靠近后述的注射器1的顶端即靠近射出口31a的位置，所述“基端侧”表示在注射器1的长度方向上与“顶端侧”相反一侧的方向即驱动部7侧的方向。此外，本示例是将由点火装置进行点火的火药的燃烧能量作为射出能量用于加压的示例，但本实施方案并不限定于此。

[0142] (注射器1的构成)

[0143] 图1是表示注射器1的概略构成的图，也是注射器1的沿其长度方向的剖视图。注射器1通过如下方式构成：注射器组装体10安装于外壳(注射器外壳)2，该注射器组装体10将由注射筒部3和柱塞4构成的子组装体与由注射器主体6、活塞5以及驱动部7构成的子组装体一体地组装而成。

[0144] 如上所述，注射器组装体10构成为相对于外壳2拆装自如。在注射器组装体10中所包括的形成于注射筒部3与柱塞4之间的容纳部32中填充有所述液态医药组合物，而且，该注射器组装体10是在每次进行所述液态医药组合物的射出时用完就扔掉的单元。另一方面，在外壳2侧包括向注射器组装体10的驱动部7中所包括的点火器71供电的电池9。来自电池9的供电通过用户进行按下设于外壳2的按钮8的操作，经由布线在外壳2侧的电极与注射器组装体10的驱动部7侧的电极之间进行。需要说明的是，就外壳2侧的电极和注射器组装体10的驱动部7侧的电极而言，两电极的形状和位置被设计为在注射器组装体10安装于外壳2时自动地接触。此外，外壳2是只要在电池9中剩余能够向驱动部7供给的电力就能反复使用的单元。需要说明的是，在外壳2中，在电池9的电力耗尽的情况下，也可以仅更换电池9而继续使用外壳2。

[0145] 接着，对注射器组装体10的详细内容进行说明。首先，当对包括注射筒部3和柱塞4的子组装体进行说明时，注射筒部3在其内部形成有作为能够容纳所述液态医药组合物的空间的容纳部32。更详细而言，如图1所示，柱塞4被配置为沿着在注射筒部3的轴向上延伸的内壁面滑动自如，由注射筒部3的内壁面和柱塞4划定出容纳部32。此外，注射筒部3具有与容纳部32连通的喷嘴部31，在喷嘴部31的顶端侧形成有射出口31a。喷嘴部31是其流路截面积从容纳部32侧趋向射出口31a侧逐渐减小，并且用于将填充于容纳部32的所述液态医药组合物引导至射出口31a的流路。在图1所示的例子中，柱塞4的顶端侧的形状与喷嘴部31的形状大致一致。

[0146] 接着，对包括注射器主体6、活塞5以及驱动部7的子组装体进行说明。活塞5例如是金属制，构成为通过由驱动部7的点火器71生成的燃烧产物(燃烧气体)进行加压，在形成于注射器主体6的内部的贯通孔中滑动。注射器主体6是大致圆筒状的构件，沿着在其轴向上延伸的内壁面滑动自如地容纳有活塞5。需要说明的是，活塞5也可以是树脂制，在该情况下，也可以在要求耐热性、耐压性的部分并用金属。此外，如图1所示，活塞5与柱塞4一体地连结。

[0147] 接着，对驱动部7进行说明。如图1所示，驱动部7以注射器主体6中的贯通孔为基准固定于基端侧。驱动部7具有作为电点火器的点火器71。点火器71以面向注射器主体6中的贯通孔的内部的方式配置，在其内部容纳有点火药。作为点火药，可以如上所述采用各种火药。此外，点火药例如可以容纳于由适当的薄壁金属形成的火药杯中。

[0148] 接着，对上述构成的注射器1的动作内容进行说明。如图1所示，在将注射器组装体10安装于外壳2的状态下，从喷嘴部31的射出口31a吸引所述液态医药组合物。由此，可以将所述液态医药组合物填充至容纳部32内。从该状态起，例如，在使注射器1中的射出口31a抵接于注入对象的状态下，当用户进行按下设于外壳2的按钮8的操作时，以此作为触发，从电池9向驱动部7的点火器71供给工作电力，点火器71进行工作。当点火器71进行工作时，点火药被点火而燃烧，生成燃烧产物(火焰、燃烧气体等)。其结果是，例如点火器71的火药杯裂开，点火药的燃烧气体向注射器主体6中的贯通孔内释放。由此，注射器主体6的贯通孔内的压力急剧升高，朝向注射器主体6的顶端侧按压活塞5，其结果是，活塞5沿着注射器主体6中的贯通孔的内壁面朝向顶端侧滑动。如上所述，由于柱塞4与活塞5一体地连结，因此柱塞4也以与活塞5联动的方式沿着注射筒部3的内壁面滑动。即，通过将柱塞4向位于注射筒部3的顶端侧的喷嘴部31压入，容纳有所述液态医药组合物的容纳部32的容积减小，会急剧地加压。其结果是，填充于容纳部32的所述液态医药组合物被压入至喷嘴部31，从射出口31a以高压射出。由此，能将所述液态医药组合物注入至注入对象。

[0149] 此外，在图1所示的注射器主体6内，虽然没有特别地配置追加的火药成分，但为了对经由活塞5施加于所述液态医药组合物的压力推移进行调整，也可以将通过由点火器71中的火药燃烧产生的燃烧产物燃烧而产生气体的气体发生剂等配置于点火器71内、注射器主体6的贯通孔内。在点火器71内配置气体发生剂的构成是如国际公开公报01‑031282号、日本特开2003‑25950号公报等所公开的那样已经公知的技术。此外，作为气体发生剂的一个例子，可列举出包含硝化纤维素98质量％、二苯胺0.8质量％、硫酸钾1.2质量％的单基无烟火药。此外，也可以使用用于气囊用气体发生器、安全带预紧装置用气体发生器的各种气体发生剂。通过调整配置在贯通孔内时的气体发生剂的尺寸或大小、形状、特别是表面形状，能使该气体发生剂的燃烧完成时间发生变化，由此，能将施加于所述液态医药组合物的压力推移设为所期望的推移、即能使所述液态医药组合物适当地到达注入对象的推移。在本实施方案中，驱动部7中也包括根据需要使用的气体发生剂等。在本实施方式中，“加压部”包含柱塞4和活塞5而构成。

[0150] 本公开的另一实施方案是一种注入器，其不经由注射针而将液态医药组合物注入至注入对象，该注入器具备：容纳部，含有液态医药组合物；喷嘴部，与所述容纳部连通，该喷嘴部具有用于将所述液态医药组合物向注入对象射出的射出口；以及加压部，在工作时对容纳于所述容纳部的所述液态医药组合物加压，由此将所述液态医药组合物从所述射出口向所述注入对象射出，所述液态医药组合物包含核酸和二价阳离子，所述二价阳离子的浓度以总量计为0.0406mM以上且小于81.1mM。

[0151] 本实施方案的注入器是所述方案中记载的一种不经由注射针而将液态医药组合物注入至注入对象的注入器，其中，所述注入器在所述容纳部容纳有所述方案的液态医药组合物。本实施方案的说明援引上述方案的说明。

[0152] 本发明的另一实施方案是一种利用不经由注射针而将液态医药组合物注入至注入对象的注入器来将液态医药组合物注入至注入对象的方法，其中，所述液态医药组合物包含核酸和二价阳离子，所述二价阳离子的浓度以总量计为0.0406mM以上且小于81.1mM。

[0153] 本实施方案的方法是所述方案中记载的一种利用不经由注射针而将液态医药组合物注入至注入对象的注入器来将所述方案的液态医药组合物注入至注入对象的方法。本实施方案的说明援用上述方案的说明。

[0154] 当通过本实施方案的方法向注入对象注入液态医药组合物时，如上述方案所述，该液态医药组合物中所含的所述核酸的生理活性在该注入对象中发挥。

[0155] 因此，本实施方案的方法可以是使核酸的生理活性在注入对象中发挥的方法，其包括如下工序：

[0156] 利用不经由注射针而将液态医药组合物注入至注入对象的注入器来将液态医药组合物注入至注入对象，其中，

[0157] 所述液态医药组合物包含核酸和二价阳离子，所述二价阳离子的浓度以总量计为0.0406mM以上且小于81.1mM。

[0158] 实施例

[0159] 虽然以下记载了实施例，但所有实施例均不是可以解释为限定性含义的实施例。

[0160] 以下的动物实验在大阪大学医学部附属动物实验机构中进行，按照由大阪大学动物实验委员会规定的大阪大学动物实验规定来实施。

[0161] 〔试验例1〕

[0162] 将PBS片剂(TAKARA BIO公司制)(PBS(‑))溶解于注射用水(大冢制药株式会社制)来制备2倍的PBS，进行过滤灭菌。将硫酸镁(MgSO4·7H2O)(Nacalai Tesque公司)溶解在所制备的2倍的PBS中，使得为图2所示的最终浓度，进行过滤灭菌。然后，与作为包含GFP基因的质粒DNA的CMV‑DASHER‑GFP(ATUM公司制)(溶剂：TE)(1.0mg/mL)混合成1∶1，制成液态医2+
药组合物。即，以使包含GFP基因的质粒DNA的最终浓度为0.5mg/mL，Mg 的最终浓度(括号内表示MgSO4·7H2O的最终浓度)为0.00406mM(0.001mg/ml)、0.0406mM(0.01mg/ml)、0.406mM(0.1mg/ml)、4.06mM(1mg/ml)、40.6mM(10mg/ml)或203mM(50mg/ml)的方式制备出液态医药组合物。

[0163] 使用所制备的液态医药组合物，通过动态光散射法(Dynamic Light Scattering，DLS)(Malvern公司，NANO‑ZS)来测定流体力学直径。平均力学直径的测定以1.0mL的容量制备测定样品，在塑料制的样品池(Cuvette)中进行。测定结果使用根据散射强度计算出的结果，以至少5次不同的测定为基础求出平均和标准偏差。

[0164] 〔比较试验例1‑1〕

[0165] 将PBS片剂(TAKARA BIO公司制)(PBS(‑))溶解于注射用水(大冢制药株式会社制)来制备2倍的PBS，进行过滤灭菌。然后，与作为包含GFP基因的质粒DNA的CMV‑DASHER‑GFP(ATUM公司制)(溶剂：TE)(1.0mg/mL)混合成1∶1，制成液态医药组合物。即，制备出使包含2+
GFP基因的质粒DNA的最终浓度为0.5mg/mL，Mg 的最终浓度为0的液态医药组合物。除此以外与试验例1同样地进行。

[0166] 将结果示于图2。在比较试验例1‑1中，流体力学直径为177nm，与此相对，在试验例2+ 2+ 2+
1中，随着Mg 浓度的增加，显示出小的流体力学直径。此外，在Mg 浓度为1mg/mL(Mg 浓度
2+
为4.06mM)以上时，流体力学直径约为100nm。可认为这是随着Mg 浓度的增加，在核酸内部
2+ 2+
进行电交联，在分子内进行凝集的结果。此外，在Mg 浓度为1mg/mL(Mg 浓度为4.06mM)以上的情况下，认为核酸的电交联充分发生，不会导致流体力学直径的进一步降低。

[0167] 〔比较试验例1‑2〕

[0168] 使用氯化锂(LiCl)(Nacalai Tesque公司)代替硫酸镁(MgSO4·7H2O)，使得为图3+所示的最终浓度，除此以外，与试验例1同样地进行。即，以Li的最终浓度(括号内表示LiCl的最终浓度)为23.59mM(1mg/ml)或235.9mM(10mg/ml)的方式制备出液态医药组合物。

[0169] 〔比较试验例1‑3〕

[0170] 将PBS片剂(TAKARA BIO公司制)(PBS(‑))溶解于注射用水(大冢制药株式会社制)来制备2倍的PBS，进行过滤灭菌。然后，与作为包含GFP基因的质粒DNA的CMV‑DASHER‑GFP(ATUM公司制)(溶剂：TE)(1.0mg/mL)混合成1∶1，制成液态医药组合物。即，制备出使包含+GFP基因的质粒DNA的最终浓度为0.5mg/mL，Li的最终浓度为0的液态医药组合物。除此以外与试验例1同样地进行。该比较试验例1‑3实质上与比较试验例1‑1相同。

[0171] 将结果示于图3。在比较试验例1‑3中，流体力学直径为162nm，与此相对，在比较试+验例1‑2中，即使Li浓度增加，所述流体力学直径也仅变化至153nm。可认为这是因为，与二
2+ +
价阳离子Mg 不同，在一价阳离子Li中不发生核酸的电交联，核酸未粗粒化。

[0172] 由以上的结果可知，在核酸溶液中存在Mg2+的情况下，在核酸中发生电交联，核酸粗粒化。

[0173] 〔试验例2〕

[0174] (液态医药组合物的制备)

[0175] 将PBS片剂(TAKARA BIO公司制)(PBS(‑))溶解于注射用水(大冢制药株式会社制)来制备2倍的PBS，进行过滤灭菌。将氯化镁(MgCl2·6H2O，Nacalai Tesque公司)溶解在所制备的2倍的PBS中，使其浓度为注入至作为受试动物的11周龄雄性balb/c小鼠(CLEA JAPAN)时的浓度的2倍，进行过滤灭菌。然后，与作为包含GFP基因的质粒DNA的CMV‑DASHER‑GFP(ATUM公司制)(溶剂：TE)(1.0mg/mL)混合成1∶1，制成液态医药组合物。即，以使包含GFP基2+
因的质粒DNA的最终浓度为0.5mg/mL，Mg 的最终浓度(括号内表示MgCl2·6H2O的最终浓度)为0.492mM(0.1mg/ml)、4.92mM(1mg/ml)或49.2mM(10mg/ml)的方式制备出液态医药组合物。

[0176] (对小鼠的注入)

[0177] 用异氟烷对小鼠进行吸入麻醉后，使用动物用电推剪进行背部的剪毛。然后，用酒精对该背部进行消毒，使用下述注入器在该背部的多个部位注入所述液态医药组合物。每个部位注入20μL的所述液态医药组合物。使用的注入器是图1所记载的注入器(无针注射器)，是直径0.1mm的喷嘴直径的注入器。使用25mg的ZPP作为该注入器的点火药，使用40mg的单基无烟火药(包含硝化纤维素98质量％、二苯胺0.8质量％、硫酸钾1.2质量％)作为气体发生剂。

[0178] (基因表达的评价)

[0179] 注入1天后，将该小鼠安乐死。然后，从该背部采集能够进行显微镜观察的厚度的皮肤片，贴附于松浪玻底载玻片后，用荧光显微镜BZ‑X710(KEYENCE公司制)进行观察。获取明场图像(曝光时间：1/350s)和GFP通道的荧光图像(曝光时间：1/20s)，根据需要获取叠加的图像(明场图像+荧光图像)。

[0180] 〔比较试验例2〕

[0181] 将PBS片剂(TAKARA BIO公司制)(PBS(‑))溶解于注射用水(大冢制药株式会社制)来制备2倍的PBS，进行过滤灭菌。然后，与作为包含GFP基因的质粒DNA的CMV‑DASHER‑GFP(ATUM公司制)(溶剂：TE)(1.0mg/mL)混合成1∶1，制成液态医药组合物。即，制成使包含GFP2+
基因的质粒DNA的最终浓度为0.5mg/mL，Mg 浓度为0的液态医药组合物。除此以外与试验例
2同样地进行。

[0182] 将结果示于图4。与比较试验例2相比，在试验例2中，在任意Mg2+浓度下，均观察到来自GFP的明显强的荧光。

[0183] 由该结果可以确认：在核酸溶液中存在Mg2+的情况下，提高了通过图1所记载的注入器(无针注射器)导入基因的效率，带来高的基因表达。

[0184] 〔试验例3〕

[0185] 将PBS片剂(TAKARA BIO公司制)(PBS(‑))溶解于注射用水(大冢制药株式会社制)来制备2倍的PBS，进行过滤灭菌。将硫酸镁(MgSO4·7H2O，Nacalai Tesque公司)溶解在所制备的2倍的PBS中，使其浓度为注入至作为受试动物的11～13周龄雄性balb/c小鼠(CLEA JAPAN)时的浓度的2倍，进行过滤灭菌。然后，与作为包含GFP基因的质粒DNA的CMV‑DASHER‑GFP(ATUM公司制)(溶剂：TE)(1.0mg/mL)混合成1∶1，制成液态医药组合物。即，以使包含GFP2+
基因的质粒DNA的最终浓度为0.5mg/mL，Mg 的最终浓度(括号内表示MgSO4·7H2O的最终浓度)为0.00406mM(0.001mg/ml)、0.0406mM(0.01mg/ml)、0.203mM(0.05mg/ml)、0.406mM(0.1mg/ml)、4.06mM(1mg/ml)、40.6mM(10mg/ml)、81.1mM(20mg/ml)或203mM(50mg/ml)的方式制备出液态医药组合物。

[0186] 对小鼠的注入与试验例2同样地进行。此外，获取明场图像(曝光时间：1/350s)和GFP通道的荧光图像(曝光时间：1/20s)，根据需要获取叠加的图像后，作为基因表达的分析，使用分析应用程序(Hybrid Cell Count(混合细胞计数))(KEYENCE公司制)分析上述荧光图像。分析在亮度设定为10、区域指定为off的条件下实施。

[0187] 〔比较试验例3〕

[0188] 使用30G针的有针注射器(MISAWA MEDICAL INDUSTRY株式会社制Dentronics针30G)作为注入器，除此以外，与试验例3同样地进行。

[0189] 需要说明的是，对如下情况也进行了试验：无处理的情况(不进行所述液态医药组合物的注入的情况)；使用图1所记载的注入器(无针注射器)作为注入器，并且使用与比较2+
试验例2中所制备的液态医药组合物相同的液态医药组合物(Mg 浓度为0)作为所述液态医药组合物的情况；使用30G针的有针注射器(MISAWA MEDICAL INDUSTRY株式会社制Dentronics针30G)作为注入器，并且使用与比较试验例2中所制备的液态医药组合物相同
2+
的液态医药组合物(Mg 浓度为0)作为所述液态医药组合物的情况。

[0190] 将结果示于表1。需要说明的是，表中的“相对光度”是将在试验例3和比较试验例32+
中分别使用与比较试验例2中所制备的液态医药组合物相同的液态医药组合物(Mg 浓度为
0)作为所述液态医药组合物的情况下的光度换算为1.00而得到的值。

[0191] 当对试验例3的条件之间进行比较时，启示了例如在Mg2+浓度为0.0406mM以上且小2+
于81.1mM的情况下的光度比Mg 浓度为0的情况下的光度大。

[0192] 此外，Mg2+浓度在0.0406mM～40.6mM的范围(MgSO4·7H2O为0.01mg/ml～10mg/ml的范围)内，基因表达增加。从相对光度(有时称为基因表达增加率)的结果来看，在比较试验例3中最大停留在约1.6倍，另一方面，在试验例3中最大为约7.4倍。从该结果可以明确，2+
在核酸溶液中存在Mg 的情况下的基因表达增强效果在使用图1所记载的注入器(无针注射器)的情况下是更显著的现象。

[0193] 此外，从相对光度的结果来看，在试验例3中，Mg2+浓度在0.0406mM～40.6mM的范围(MgSO4·7H2O为0.01mg/ml～10mg/ml的范围)内，基因表达增加率为超过1的数值。进而，即使在与对应于这些范围的比较试验例3的基因表达增加率的比较中，也在试验例3中显示出2+ 2+
更大的值。因此，可以明确在核酸溶液中存在Mg 的情况下的基因表达增强效果在Mg 浓度在0.0406mM～40.6mM的范围(MgSO4·7H2O为0.01mg/ml～10mg/ml的范围)内时尤其能够得到。

[0194] [表1]

[0195]

[0196] 〔试验例4〕

[0197] 使用11‑13周龄的雄性balb/c小鼠(CLEA JAPAN)作为受试动物，将试验例3的液态2+
医药组合物的Mg 的最终浓度设为0.406mM(MgSO4·7H2O为0.1mg/ml)，在注入起6小时后、1天后、2天后、3天后、5天后、7天后或14天后将该小鼠安乐死来进行实验，除此以外，与试验例3同样地进行。

[0198] 〔比较试验例4‑1〕

[0199] 使用与比较试验例2中所制备的液态医药组合物相同的液态医药组合物(Mg2+浓度为0)作为所述液态医药组合物，除此以外，与试验例4同样地进行。

[0200] 〔比较试验例4‑2〕

[0201] 使用30G针的有针注射器(MISAWA MEDICAL INDUSTRY株式会社制Dentronics针30G)作为注入器，除此以外，与试验例4同样地进行。

[0202] 〔比较试验例4‑3〕

[0203] 使用30G针的有针注射器(MISAWA MEDICAL INDUSTRY株式会社制Dentronics针30G)作为注入器，并且使用与比较试验例2中所制备的液态医药组合物相同的液态医药组
2+
合物(Mg 浓度为0)作为所述液态医药组合物，除此以外，与试验例4同样地进行。

[0204] 将结果示于表2和图5。需要说明的是，表中的“相对光度(1)”是以比较试验例4‑1的光度为基准换算试验例4的光度而得到的值，“相对光度(2)”是以比较试验例4‑3的光度为基准换算比较试验例4‑2的光度而得到的值。

[0205] 由试验例4的结果可知，在注入所述液态医药组合物的6小时后至14天后，任意情2+
况下的光度均比Mg 浓度为0的情况下(比较试验例4‑1)的光度大。

[0206] 此外，在比较试验例4‑2、比较试验例4‑3中，在注入所述液态医药组合物的6小时后至14天后，均仅能观察到非常微弱的GFP的荧光，基因表达弱。在比较试验例4‑1中，在1天后观察到强的荧光，在3天后为微弱的荧光。另一方面，在试验例4中，1～5天后观察到强的荧光，14天后荧光的观察变得困难。这些结果表明，在使用图1所记载的注入器(无针注射2+
器)的情况的基因表达的期间因核酸溶液中存在Mg 而大大延长。

[0207] 此外，从相对光度(1)和相对光度(2)(有时称为基因表达增加率)的结果来看，在任意情况下，在注入所述液态医药组合物的6小时后至14天后，均为超过1的值。进而，在注入液态医药组合物的6小时后至14天后的任意情况下，相对光度(1)均显示出大于相对光度(2)的值。由此，在注入液态医药组合物的6小时后至14天后的任意情况下，均确认了在核酸2+
溶液中存在Mg 的情况下的基因表达增强效果。特别是，在使用图1所记载的注入器(无针注
2+
射器)的情况下，即在核酸溶液中存在Mg 的情况下，注入液态医药组合物的2天后、3天后的基因表达增加率为超过60的值，表明了基因表达大大提高。

[0208] [表2]

[0209] 表2

[0210]

[0211]

[0212] 〔试验例5〕

[0213] 将PBS片剂(TAKARA BIO公司制)(PBS(‑))溶解于注射用水(大冢制药株式会社制)来制备2倍的PBS，进行过滤灭菌。将氯化镁(MgCl2·6H2O，Nacalai Tesque公司)、硝酸镁(Mg(NO3)2·6H2O，Nacalai Tesque公司)或天门冬氨酸镁(Angene International Limited公司)溶解在所制备的2倍的PBS中，使其浓度为注入至作为受试动物的11周龄雄性balb/c小鼠(CLEA JAPAN)时的浓度的2倍，进行过滤灭菌。然后，与作为包含GFP基因的质粒DNA的CMV‑DASHER‑GFP(ATUM公司制)(溶剂：TE)(1.0mg/mL)混合成1∶1，制成液态医药组合物。即，2+
以使包含GFP基因的质粒DNA的最终浓度为0.5mg/mL、对于氯化镁(MgCl2·6H2O)而言Mg 的最终浓度为4.92mM(MgCl2·6H2O的最终浓度为1mg/ml)、对于硝酸镁(Mg(NO3)2·6H2O)而言
2+ 2+
Mg 的最终浓度为3.90mM(Mg(NO3)2·6H2O的最终浓度为1mg/ml)、对于天冬氨酸镁而言Mg的最终浓度为3.47mM(天冬氨酸镁的最终浓度为1mg/ml)的方式制备出液态医药组合物。

[0214] 除了对小鼠的注入以外，明场图像、荧光图像的获取、叠加的图像的获取、基因表达的分析与试验例2同样地进行。

[0215] 〔比较试验例5〕

[0216] 使用30G针的有针注射器(MISAWA MEDICAL INDUSTRY株式会社制Dentronics针30G)作为注入器，除此以外，与试验例5同样地进行。

[0217] 需要说明的是，对如下情况也进行了试验：使用图1所记载的注入器(无针注射器)作为注入器，并且使用与比较试验例2中所制备的液态医药组合物相同的液态医药组合物2+
(Mg 浓度为0)作为所述液态医药组合物的情况；使用30G针的有针注射器(MISAWA MEDICAL INDUSTRY株式会社制Dentronics针30G)作为注入器，并且使用与比较试验例2中所制备的
2+
液态医药组合物相同的液态医药组合物(Mg 浓度为0)作为所述液态医药组合物的情况。

[0218] 将结果示于表3和图6。表中的“相对光度”是将在试验例5和比较试验例5中分别使2+
用与比较试验例2中所制备的液态医药组合物相同的液态医药组合物(Mg 浓度为0)作为所述液态医药组合物的情况下的光度换算为1.00而得到的值。

[0219] 由试验例5的结果可知，使用任一种镁盐的情况下的光度均比Mg2+浓度为0的情况下的光度大。

[0220] 此外，在使用任一种镁盐的情况下，与Mg2+浓度为0的情况相比，基因表达也均增加。从相对光度(有时称为基因表达增加率)的结果来看，在试验例5中，使用任一种镁盐的情况下均为超过1的值。进而，即使在与对应于这些情况的比较试验例5的基因表达增加率2+
的比较中，也在试验例5中显示出大的值。因此，可以明确在核酸溶液中存在Mg 的情况下的基因表达增强效果无论镁盐的种类如何都能得到。

[0221] [表3]

[0222] 表3

[0223]

[0224] 〔试验例6〕

[0225] 将PBS片剂(TAKARA BIO公司制)(PBS(‑))溶解于注射用水(大冢制药株式会社制)来制备2倍的PBS，进行过滤灭菌。将氯化钙(CaCl2·2H2O，Nacalai Tesque公司)、硫酸锰(II)(MnSO4·5H2O，Nacalai Tesque公司)或氯化锂(LiCl，Nacalai Tesque公司)溶解在所制备的2倍的PBS中，使其浓度为注入至作为受试动物的11周龄雄性balb/c小鼠(CLEA JAPAN)时的浓度的2倍，进行过滤灭菌。然后，与作为包含GFP基因的质粒DNA的CMV‑DASHER‑GFP(ATUM公司制)(溶剂：TE)(1.0mg/mL)混合成1∶1，制成液态医药组合物。即，以使包含GFP2+
基因的质粒DNA的最终浓度为0.5mg/mL、对于氯化钙(CaCl2·2H2O)而言Ca 的最终浓度为
2+
6.8mM(CaCl2·2H2O的最终浓度为1mg/ml)、对于硫酸锰(II)(MnSO4·5H2O)而言Mn 的最终+
浓度为4.15mM(MnSO4·5H2O的最终浓度为1mg/ml)、对于氯化锂(LiCl)而言Li的最终浓度为23.5mM(LiCl的最终浓度为1mg/ml)的方式制备出液态医药组合物。

[0226] 除了对小鼠的注入以外，明场图像、荧光图像的获取、叠加的图像的获取、基因表达的分析与试验例2同样地进行。

[0227] 〔比较试验例6〕

[0228] 使用30G针的有针注射器(MISAWA MEDICAL INDUSTRY株式会社制Dentronics针30G)作为注入器，除此以外，与试验例6同样地进行。

[0229] 需要说明的是，对如下情况也进行了试验：在使用图1所记载的注入器(无针注射器)作为注入器，并且使用与比较试验例2中所制备的液态医药组合物相同的液态医药组合2+ 2+ +
物(Ca 浓度、Mn 浓度、Li浓度均为0)作为所述液态医药组合物的情况；使用30G针的有针注射器(MISAWA MEDICAL INDUSTRY株式会社制Dentronics针30G)作为注入器，并且使用与
2+ 2+ +
比较试验例2中所制备的液态医药组合物相同的液态医药组合物(Ca 浓度、Mn 浓度、Li浓度均为0)作为所述液态医药组合物的情况。

[0230] 将结果示于表4和图7。表中的“相对光度”是将在试验例6和比较试验例6中分别使2+ 2+
用与比较试验例2中所制备的液态医药组合物相同的液态医药组合物(Ca 浓度、Mn 浓度、+
Li浓度均为0)作为所述液态医药组合物的情况下的光度换算为1.00而得到的值。

[0231] 当对试验例6的条件之间进行比较时，使用氯化钙、硫酸锰(II)的情况下的光度大于全部的浓度为0的情况下的光度。

[0232] 此外，从相对光度(有时称为基因表达增加率)的结果来看，在试验例6中，在使用氯化钙、硫酸锰(II)的情况下，为超过1的值。进而，即使在与对应于这些情况的比较试验例6的基因表达增加率的比较中，也在试验例6中显示出大的值。因此，在核酸溶液中存在二价+
阳离子的情况下，能得到基因表达增强效果，另一方面，在核酸溶液中存在一价Li 的情况下，结果为基因表达增加率低于1，没有得到基因表达增强效果。这些结果与DLS的结果(试验例1、比较试验例1‑1、比较试验例1‑2、比较试验例1‑3)非常一致。由此，以下内容得到支持：使用图1所记载的注入器(无针注射器)的情况下的基因表达增强效果是在核酸溶液中存在二价阳离子的情况下特有的现象，是由核酸的粗粒化而引起的。

[0233] [表4]

[0234] 表4

[0235]

[0236] *1Ca2+浓度、Mn2+浓度、Li+浓度均为0

[0237] 〔试验例7〕

[0238] 利用AFM直接观察核酸溶液中存在Mg2+的情况下的核酸的粗粒化。利用AFM的测定使用Hitachi High‑Tech公司制的AFM5000/AFM5300E来实施。此外，悬臂使用生物体试样用的SI‑DF20S(Olympus公司制)。

[0239] 将PBS片剂(TAKARA BIO公司制)(PBS(‑))溶解于注射用水(大冢制药株式会社制)来制备2倍的PBS，进行过滤灭菌。将硫酸镁(MgSO4·7H2O)(Nacalai Tesque公司)溶解在所制备的2倍的PBS中，使得为图8所示的最终浓度，进行过滤灭菌。然后，与作为包含GFP基因的质粒DNA的CMV‑DASHER‑GFP(ATUM公司制)(溶剂：TE)

[0240] (1.0mg/mL)混合成1∶1，制成液态医药组合物。即，以使包含GFP基因的质粒DNA的2+
最终浓度为0.5mg/mL，Mg 的最终浓度(括号内表示MgSO4·7H2O的最终浓度)为2.03mM(0.5mg/ml)或40.6mM(10mg/ml)的方式制备出液态医药组合物。将其滴加到新鲜的云母表面，使其吸附规定的时间后，通过吹气使其干燥而使用。

[0241] 〔比较试验例7〕

[0242] 将PBS片剂(TAKARA BIO公司制)(PBS(‑))溶解于注射用水(大冢制药株式会社制)来制备2倍的PBS，进行过滤灭菌。然后，与作为包含GFP基因的质粒DNA的CMV‑DASHER‑GFP(ATUM公司制)(溶剂：TE)(1.0mg/mL)混合成1∶1，制成液态医药组合物。即，制备出使包含2+
GFP基因的质粒DNA的最终浓度为0.5mg/mL，Mg 的最终浓度为0的液态医药组合物。除此以外与试验例7同样地进行。

[0243] 将结果示于图8。

[0244] 在比较试验例7中，确认了200nm左右的圆形的结构。另一方面，在试验例7中观察到100nm左右的粒子。这些结果与DLS的结果(试验例1、比较试验例1‑1、比较试验例1‑2、比2+
较试验例1‑3)非常一致，确认了在核酸溶液中存在Mg 的情况下，核酸确实会粗粒化。根据
2+
该结果以下内容得到支持：在核酸溶液中存在Mg 的情况下，使用图1所记载的注入器(无针注射器)的情况下的基因表达增强效果是由核酸的粗粒化引起的。

[0245] 〔试验例8〕

[0246] 在试验例2中，使用弹簧式无针注射器(BEAUTTO公司，透明质酸注射筒，亚马逊标准识别号码(Amazon Standard Identification Number，ASIN)：B08NCHTRHZ)来代替图1所记载的注入器(无针注射器)，使用硫酸镁(MgSO4·7H2O，Nacalai Tesque公司)来代替氯化2+
镁(MgCl2·6H2O)，以使包含GFP基因的质粒DNA的最终浓度为0.5mg/mL，Mg 的最终浓度(括号内表示MgSO4·7H2O的最终浓度)为2.03mM(0.5mg/ml)或40.6mM(10mg/ml)的方式制备出液态医药组合物。

[0247] 除了对小鼠的注入以外，明场图像、荧光图像的获取、叠加的图像的获取、基因表达的分析与试验例2同样地进行。

[0248] 〔比较试验例8〕

[0249] 使用30G针的有针注射器(MISAWA MEDICAL INDUSTRY株式会社制Dentronics针30G)作为注入器，除此以外，与试验例8同样地进行。

[0250] 需要说明的是，对如下情况也进行了试验：使用所述弹簧式的无针注射器作为注2+
入器，并且使用与比较试验例2中所制备的液态医药组合物相同的液态医药组合物(Mg 浓度为0)作为所述液态医药组合物的情况；使用30G针的有针注射器(MISAWA MEDICAL INDUSTRY株式会社制Dentronics针30G)作为注入器，并且使用与比较试验例2中所制备的
2+
液态医药组合物相同的液态医药组合物(Mg 浓度为0)作为所述液态医药组合物的情况。

[0251] 将结果示于表5和图9。表中的“相对光度”是将在试验例8和比较试验例8中分别使2+
用与比较试验例2中所制备的液态医药组合物相同的液态医药组合物(Mg 浓度为0)作为所述液态医药组合物的情况下的光度换算为1.00而得到的值。

[0252] 由试验例8的结果可知，核酸溶液中存在Mg2+的情况下的光度均比Mg2+浓度为0的情况下的光度大。

[0253] 此外，在试验例8中，作为弹簧式的无针注射器的射出条件，没有对最佳条件进行研究，因此均停留在低的基因表达，但从相对光度(有时称为基因表达增加率)的结果来看，2+
在核酸溶液中存在Mg 的情况下，均为超过1的值。进而，即使在与对应于这些情况的比较试验例8的基因表达增加率的比较中，也在试验例8中显示出大的值。因此，表明了核酸溶液中
2+
存在Mg 的情况下的基因表达增强效果不限定于用将点火药的燃烧能量用作射出能量的注入器得到，用弹簧式的无针注射器也能得到。

[0254] [表5]

[0255] 表5

[0256]

[0257] 〔试验例9〕

[0258] 将PBS片剂(TAKARA BIO公司制)(PBS(‑))溶解于注射用水(大冢制药株式会社制)来制备2倍的PBS，进行过滤灭菌。将硫酸镁(MgSO4·7H2O，Nacalai Tesque公司)溶解在所制备的2倍的PBS中，使其浓度为注入至作为受试动物的11周龄雄性balb/c小鼠(CLEA JAPAN)时的浓度的2倍，进行过滤灭菌。然后，与编码作为报告蛋白的GFP的mRNA(未修饰)(OZ公司制，Funakoshi Cat#.MRNA15‑100)(溶剂：TE)(0.2mg/mL)混合成1∶1，制成液态医药组合物。2+
即，以使编码GFP的mRNA的最终浓度为0.1mg/mL(每次注入2.0μg)，Mg 的最终浓度(括号内表示MgSO4·7H2O的最终浓度)为2.03mM(0.5mg/ml)、4.06mM(1mg/ml)、或40.6mM(10mg/ml)的方式制备出液态医药组合物。

[0259] 除了对小鼠的注入以外，明场图像、荧光图像的获取、叠加的图像的获取、基因表达的分析与试验例2同样地进行。

[0260] 〔比较试验例9〕

[0261] 使用30G针的有针注射器(MISAWA MEDICAL INDUSTRY株式会社制Dentronics针30G)作为注入器，除此以外，与试验例9同样地进行。

[0262] 需要说明的是，对如下情况也进行了试验：使用图1所记载的注入器(无针注射器)作为注入器，并且使用与比较试验例2中所制备的液态医药组合物相同的液态医药组合物2+
(Mg 浓度为0)作为所述液态医药组合物的情况；使用30G针的有针注射器(MISAWA MEDICAL INDUSTRY株式会社制Dentronics针30G)作为注入器，并且使用与比较试验例2中所制备的
2+
液态医药组合物相同的液态医药组合物(Mg 浓度为0)作为所述液态医药组合物的情况。

[0263] 将结果示于表6和图10。需要说明的是，表中的“相对光度”是将在试验例9和比较试验例9中分别使用与比较试验例2中所制备的液态医药组合物相同的液态医药组合物2+
(Mg 浓度为0)作为所述液态医药组合物的情况下的光度换算为1.00而得到的值。

[0264] 当对试验例9的条件之间进行比较时，核酸溶液中存在Mg2+的情况下的光度均比2+
Mg 浓度为0的情况下的光度大。

[0265] 此外，在试验例9中，在核酸溶液中存在Mg2+的情况下，均观察到强的GFP荧光。此外，从相对光度(有时称为基因表达增加率)的结果来看，在试验例9中，在核酸溶液中存在2+
Mg 的情况下，均为超过1的值。进而，即使在与对应于这些情况的比较试验例9的基因表达
2+
增加率的比较中，也在试验例9中显示出大的值。由该结果表明：在核酸溶液中存在Mg 的情况下，使用图1所记载的注入器(无针注射器)的情况下的基因表达增强效果能在包含mRNA在内的广义的核酸中得到。

[0266] [表6]

[0267] 表6

[0268]

[0269] 〔试验例10〕

[0270] 使用11‑13周龄雄性balb/c小鼠(CLEA JAPAN)作为受试动物，将试验例9的液态医2+
药组合物的Mg 的最终浓度设为2.03mM(MgSO4·

[0271] 7H2O为0.5mg/ml)，在注入起6小时后、1天后、2天后、3天后、5天后、7天后或14天后将该小鼠安乐死来进行实验，除此以外，与试验例9同样地进行。

[0272] 〔比较试验例10‑1〕

[0273] 使用与比较试验例2中所制备的液态医药组合物相同的液态医药组合物(Mg2+浓度为0)作为所述液态医药组合物，除此以外，与试验例10同样地进行。

[0274] 〔比较试验例10‑2〕

[0275] 使用30G针的有针注射器(MISAWA MEDICAL INDUSTRY株式会社制Dentronics针30G)作为注入器，除此以外，与试验例10同样地进行。

[0276] 〔比较试验例10‑3〕

[0277] 使用30G针的有针注射器(MISAWA MEDICAL INDUSTRY株式会社制Dentronics针30G)作为注入器，并且使用与比较试验例2中所制备的液态医药组合物相同的液态医药组
2+
合物(Mg 浓度为0)作为所述液态医药组合物，除此以外，与试验例10同样地进行。

[0278] 将结果示于表7和图11。需要说明的是，表中的“相对光度(1)”是以比较试验例10‑1的光度为基准换算试验例10的光度而得到的值，“相对光度(2)”是以比较试验例10‑3的光度为基准换算比较试验例10‑2的光度而得到的值。

[0279] 由试验例10的结果可知，在注入所述液态医药组合物的6小时后至14天后的任意2+
情况下的光度均比Mg 浓度为0的情况下(比较试验例10‑1)的光度大。

[0280] 此外，在比较试验例10‑1中，从6小时后开始观察到强的荧光，在7天后为微弱的荧光。另一方面，在试验例10中，在6小时后至7天后观察到强的荧光，14天后为弱的荧光。

[0281] 此外，从相对光度(1)(有时称为基因表达增加率)的结果来看，在任意情况下，在注入所述液态医药组合物的6小时后至14天后的任意情况下，均为超过1的值。进而，在注入所述液态医药组合物的6小时后至14天后的任意情况下，相对光度(1)均显示出大于相对光度(2)的值。由此，在使用图1所记载的注入器(无针注射器)注入所述液态医药组合物的6小2+
时后至14天，即使在使用mRNA作为核酸的情况下，也能确认核酸溶液中存在Mg 的情况下的基因表达增强效果。

[0282] [表7]

[0283] 表7

[0284]  6小时后 1天后 2天后 3天后 5天后 7天后 14天后
比较试验例10‑1 18476 14440 16547 7336 6703 393 1
试验例10 33486 35294 33438 27438 25501 16855 3
相对光度(1) 1.81 2.44 2.02 3.74 3.80 42.88 4.12
比较试验例10‑3 0.04 6.97 0.50 0.11 1.40 0.84 0.40
比较试验例10‑2 0.05 12.38 0.60 0.10 0.53 0.77 0.29
相对光度(2) 1.20 1.78 1.20 0.90 0.38 0.92 0.73

[0285] 〔试验例11〕

[0286] (液态医药组合物的制备)

[0287] 将PBS片剂(TAKARA BIO公司制)(PBS(‑))溶解于注射用水(大冢制药株式会社制)来制备2倍的PBS，进行过滤灭菌。将硫酸镁(MgSO4·7H2O，Nacalai Tesque公司)溶解在所制备的2倍PBS中，使其浓度为注入至作为受试动物的11周龄雄性C57BL6小鼠(CLEA JAPAN)时的浓度的2倍，进行过滤灭菌。然后，与编码卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)的mRNA(OZ公司制，Funakoshi Cat#.MRNA42‑100)(溶剂：TE)(0.2mg/mL)混合成1∶1，制成液态医药组合物。即，2+
以编码OVA的mRNA的最终浓度为0.1mg/mL(每次注入2.0μg)，Mg 的最终浓度(括号内表示MgSO4·7H2O的最终浓度)为2.03mM(0.5mg/ml)的方式制备出液态医药组合物。

[0288] (对小鼠的注射)

[0289] 用异氟烷对11周龄雄性C57BL6小鼠进行吸入麻醉后，使用动物用电推剪进行背部的剪毛。然后，用酒精对该背部进行消毒，使用下述注入器在该背部的两个部位注入所述液态医药组合物。每个部位注入20μL的所述液态医药组合物。使用的注入器是图1中记载的注入器(无针注射器)，是直径0.1mm的喷嘴直径的注入器。使用25mg的ZPP作为该注入器的点火药，使用40mg的单基无烟火药(包含硝化纤维素98质量％、二苯胺0.8质量％、硫酸钾1.2质量％)作为气体发生剂。

[0290] (ELISpot分析)

[0291] 在注入液态医药组合物后第9天，将该小鼠安乐死，并摘出脾脏。在摘出的脾脏中添加了ELISpot试剂盒(鼠IFN‑γ单色ELISPOT(CTL公司制))附带的培养基后，使用细胞过滤器制成细胞悬浮液。然后，使用VersaLyse溶血试剂(Beckman Coulter公司)进行溶血和洗涤，得到脾脏的细胞分散液。使用一次性细胞计数板(C‑Chip，Digital Bio公司)实施细胞计数。

[0292] 通过ELISpot分析(鼠IFN‑γ单色ELISPOT(CTL公司制))对与OVA的MHC I类分子的表位肽(epitope peptide)(氨基酸序列：SIINFEKL(序列号1)，委托PH Japan公司合成)反应而产生INF‑γ的细胞进行检测。具体而言，将100μL的细胞分散液以为规定的细胞数(5×5
10个)的方式接种在预涂有检测抗体的板上，接着使用试剂盒附带的培养基，使每1个孔的总量为200μL。在进行利用抗原的刺激的情况下，使用包含40μg/mL的所述肽(氨基酸序列：
SIINFEKL(序列号1))作为抗原的培养基，使每1个孔的总量为200μL。然后将细胞培养过夜，进行板的呈色。根据试剂盒所记载的试验方案(protocol)进行板的呈色。

[0293] 〔比较试验例11‑1〕

[0294] 将PBS片剂(TAKARA BIO公司制)(PBS(‑))溶解于注射用水(大冢制药株式会社制)来制备2倍的PBS，进行过滤灭菌。将硫酸镁(MgSO4·7H2O，Nacalai Tesque公司)溶解在所制备的2倍PBS中，使其浓度为注入至作为受试动物的11周龄雄性C57BL6小鼠(CLEA JAPAN)时的浓度的2倍，进行过滤灭菌。然后，与编码卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)的mRNA(OZ公司制，Funakoshi Cat#.MRNA42‑100)(溶剂：TE)(0.2mg/mL)混合成1∶1，制成液态医药组合物。即，2+
制成使编码OVA的mRNA的最终浓度为0.1mg/mL(每次注入2.0μg)，Mg 浓度为0的液态医药组合物。除此以外，与试验例11同样地进行。换言之，是用图1所记载的注入器(无针注射器)注
2+
入包含编码OVA的mRNA且Mg 浓度为0的液态医药组合物的比较试验例。

[0295] 〔比较试验例11‑2〕

[0296] 使用30G针的有针注射器(MISAWA MEDICAL INDUSTRY株式会社制Dentronics针30G)作为注入器，除此以外，与比较试验例11‑1同样地进行。换言之，是用有针注射器注入
2+
包含编码OVA的mRNA且Mg 浓度为0的液态医药组合物的比较试验例。

[0297] 〔比较试验例11‑3〕

[0298] 使用1倍的PBS作为液态医药组合物。除此以外，与试验例11同样地进行。换言之，是用图1所记载的注入器(无针注射器)注入作为1倍的PBS的液态医药组合物的比较试验例。

[0299] 〔比较试验例11‑4〕

[0300] 也准备了无处理的情况(不进行所述液态医药组合物的注入的情况)。

[0301] 〔比较试验例11‑5〕

[0302] 使用30G针的有针注射器(MISAWA MEDICAL INDUSTRY株式会社制Dentronics针30G)作为注入器，除此以外，与试验例11同样地进行。换言之，是用有针注射器注入包含编
2+
码OVA的mRNA且Mg 的最终浓度(括号内表示MgSO4·7H2O的最终浓度)为2.03mM(0.5mg/ml)的液态医药组合物的比较试验例。

[0303] 将结果示于图12。

[0304] 首先，由图12中的(A)可知，在比较试验例11‑2、比较试验例11‑3、比较试验例11‑4中，未形成斑点，未达到细胞免疫的诱导。另一方面，在比较试验例11‑1中，形成了许多斑点，诱导了细胞免疫。

[0305] 接着，由图12中的(B)可知，与比较试验例11‑1相比，在试验例11中，明显形成了许多斑点，细胞免疫的诱导提高。即，推测出即使在使用图1所记载的注入器(无针注射器)而2+
同样地进行注入的情况下，核酸溶液中存在Mg ，由此小鼠个体(生物体)内的蛋白质的表达量也会增加，细胞免疫也会增强。另一方面，由图12中的(C)可知，在有针注射的情况下，即
2+
使核酸溶液中存在Mg ，也未确认出斑点数的增加。

[0306] 由该结果明确了：在使用图1所记载的注入器(无针注射器)的情况下，能得到核酸2+
疫苗的效果。此外明确了：通过在核酸溶液中存在Mg ，细胞免疫的诱导提高，核酸疫苗的效果提高。

[0307] 附图标记说明

[0308] 1：注射器；2：壳体；3：注射筒部；4：柱塞；5：活塞；6：注射器主体；7：驱动部；8：按钮；9：电池；10：注射器组装体；31：喷嘴部；31a：射出口；32：容纳部；71：点火器。