[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及一种水稻低垩白粒率QTL CGR5的分子标记方法。

[0002] 垩白是稻米胚乳中白色不透明的部分，通常使用垩白粒率、垩白大小和垩白度三个指标来衡量稻米垩白的发生程度，其中使用最多的就是垩白粒率。低垩白粒率通常意味着更好的外观品质和更优的食味品质，因此，低垩白粒率是优质水稻选育的关键指标之一。稻米垩白是多基因控制的复杂性状，其遗传同时具有母体效应、胚乳效应和细胞质效应。同时，稻米垩白还极易受到环境因子的影响，在环境效应上，氮素和温度对稻米垩白的发生具有重要影响，随着施氮量的增加和气温异常程度的累积，往往垩白率同步增加。寒地稻区是我国最重要的商品稻米生产基地，培育低垩白粒率品种是东北优质粳稻育种的一个重要目标。传统育种方法费时、费力、表型鉴定困难、育种效率低，由于水稻垩白粒率是典型的数量性状，涉及多个基因位点，且与环境间存在互作效应，使得低垩白粒率遗传改良困难。利用低垩白粒率基因及与其紧密连锁的分子标记，开展分子标记辅助选择育种可以有效地解决这一问题。截止目前，已有部分低垩白粒率基因位点被定位，也报道了有一些连锁标记信息，但交换率偏高，选择效果不良。同时，少数紧密连锁的标记属于测序获得的SNP信息，没有转换为紧密连锁标记，因此，针对低垩白粒率基因位点的辅助分子标记仍然很稀缺。在国家知识产权局数据库中仅查询到5个关于水稻垩白性状的分子标记专利，包括“CN202110972968，一种与稻米垩白度相关的单倍型SNP分子标记及其检测方法与应用”，“CN111808865A，WCR1基因在调节稻米心白率或食味品质中的应用”，“CN110184380A，一种水稻垩白性状高温钝感主效QTL的鉴定及其在水稻育种中的用途”，“CN107254548A，一种鉴定水稻垩白性状的分子标记、鉴定方法及应用”和“CN105925689A，鉴别水稻垩白基因Chalk5等位基因型的分子标记及其方法”。上述5个标记都是基于籼稻或者南方粳稻开发而来，在寒地早粳稻育种中应用受限。

[0014] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。

[0015] 本发明中使用到的生物材料“龙稻18”和“东农421”均为常规商品化水稻品种，本领域技术人员可以从公开的市场购买得到。

[0016] 1、水稻低垩白粒率QTL CGR5的发现与分子标记

[0017] “龙稻18”是黑龙江省首个国标一级米品种，其垩白粒率极低。以低垩白粒率的“龙稻18”为父本，以高产、抗病的品种“东农421”为母本进行杂交，通过单粒传获得F6代分离群体。2022‑2023连续两年利用该群体进行垩白粒率性状的QTL定位分析，在水稻第5号染色体短臂端检测到一个稳定遗传的主效QTL‑CGR5，其增效等位基因来自于低垩白粒率品种“龙稻18”，在该区间内检测到了一个与低垩白粒率QTL CGR5紧密连锁的分子标记CGR5‑1(核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示)。导入CGR5可以使水稻的垩白粒率降低5％左右。在F6代群体中，携带该QTL的株系的垩白粒率为0～2.1％，没有该QTL的株系垩白粒率为5.2％～7.8％。

[0018] 2、进行水稻CGR5分子辅助育种应用

[0019] 将分子标记CGR5‑1应用于龙稻18和东农421的育种后代F6群体中进行验证：

[0020] DNA提取采用常规的CTAB法，

[0021] PCR扩增体系为15μL，含50mM KCl,10mM Tris‑HCl(pH 8.8),0.1％ Triton‑X,1.5mM MgCl2,200μM each of dNTPs,0.2μM of each primer和0.5U Taq DNA聚合酶。反应程序为94℃预变性5min；每个循环94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；
最后72℃延伸8min。

[0022] PCR扩增产物经3％的琼脂糖凝胶电泳分离。

[0023] 染色后观察并记录结果。

[0024] 携带低垩白粒率QTL CGR5的后代材料(垩白粒率0～2.1％)能够扩增出163bp左右的条带，而不具有低垩白粒率QTL CGR5的后代(垩白粒率5.2％～7.8％)能够扩增出176bp左右的条带。可以看出，这个分子标记可以用于鉴定待测材料是否含有低垩白粒率QTL CGR5。