[0001] 本申请涉及微生物鉴定领域，特别是涉及一种分枝杆菌的菌株类型的鉴别方法。

[0002] 结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，以肺结核最常见，主要通过飞沫传播的呼吸道传染病。结核病是一种高死亡率疾病(～50％)，是目前第二大致死性传染病，是威胁人类健康的重要公共卫生问题。

[0003] 非结核分枝杆菌与结核分枝杆菌同属于分枝杆菌属，非结核分枝杆菌中有少部分可引起人类感染(如鸟胞分枝杆菌复合群、堪萨斯分枝杆菌、脓肿分枝杆菌等)，并且非结核分枝杆菌感染具有与结核病相似的临床表现。近年来，非结核分枝杆菌感染有逐年增加的趋势。因此，非结核分枝杆菌的菌株类型鉴定对于临床诊断与治疗具有重要意义。

[0004] 传统的结核菌株类型鉴定方法主要是利用NCBI数据库或自行构建的结核菌株数据库，通过BLAST序列比对工具确定待鉴定的结核菌株类型。尽管BLAST序列比对能够鉴定出一定数量的结核菌株类型(比如，相似度低或差异明显的结核菌株类型)。但是，有些非结核分枝杆菌的高度同源，序列相似度极高；同时，在菌株测序过程中，由于碱基识别等原因，测序菌株自身伴随着一定概率的碱基突变。这样，BLAST比对很难准确鉴定相似度极高或部分碱基发生突变的结核菌株类型。

[0005] 为了克服传统结核菌株鉴别方法的缺陷和不足，一些相似度高的结核分枝杆菌的特异性位点被发现，并利用这些特异性位点提高结核菌株类型鉴别方法的准确性。例如专利申请CN 117604131 A用于确定结核分枝杆菌的特异性位点的菌株类型鉴定方法。这些结核分枝杆菌的特异性位点及在结核分枝杆菌的菌株类型鉴定中的应用具有重要价值。

[0006] 有鉴于此，本申请被提出。

[0048] 下面结合附图、实施方式和实施例，对本申请作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本申请公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为充分地理解，应理解，本申请可以无需一个或多个这些细节而得以实施。

[0049] 除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本申请。

[0050] 术语

[0051] 除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：

[0052] 本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。

[0053] 本申请中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。

[0054] 本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。

[0055] 本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本申请的技术方案、解决本申请的技术问题、实现本申请预期的技术效果为准。

[0056] 本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本申请保护范围的限制。

[0057] 本申请中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本申请保护范围的限制。

[0058] 本申请中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。

[0059] 本申请中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。

[0060] 本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

[0061] 本申请中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1～10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。

[0062] 本申请中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。

[0063] 本申请中，％(w/w)与wt％均表示重量百分比，％(v/v)指体积百分比，％(w/v)指质量体积百分数。

[0064] 在本申请提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的申请目的和/或技术方案相冲突，否则，本申请涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本申请中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本申请中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本申请为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。

[0065] 本申请实施例的第一方面，提供检测特异性位点的试剂在制备结核分枝杆菌的鉴别产品中的应用；

[0066] 以结核分枝杆菌标准株H37Rv的基因组为参考基因组，所述特异性位点包括检测如下一种或者多种的结核分枝杆菌的特异性位点：

[0067] 鉴别胃分枝杆菌的特异性位点528892_C_G、529051_G_C或者529078_T_C；

[0068] 鉴别哥伦比亚分枝杆菌的特异性位点529012_G_A或者529024_C_G；

[0069] 鉴别海分枝杆菌的特异性位点528995_C_T和529009_C；

[0070] 鉴别溃疡分枝杆菌的特异性位点528811_C_T或者529003_G_A；

[0071] 鉴别脓肿分枝杆菌脓肿亚种的特异性位点528886_G_T、528889_G_T和528898_G_C；

[0072] 鉴别脓肿分枝杆菌博莱亚种的特异性位点528958_C_T、528961_C_T和529000_C；

[0073] 鉴别伤口分枝杆菌的特异性位点529048_A、529054_T或者529078_T；

[0074] 鉴别加纳利群岛分枝杆菌的特异性位点528919_C_T或者529096_G_A；

[0075] 鉴别托斯卡纳分枝杆菌528952_C、529078_T_C或者529084_G_C；

[0076] 鉴别偶发分枝杆菌的特异性位点528892_C_A或者528907_C_T；

[0077] 鉴别牛分枝杆菌的特异性位点2289071_C_G和2156465_C_T；

[0078] 鉴别山羊分枝杆菌的特异性位点5752_G_A或者6307_T_G；

[0079] 鉴别田鼠分枝杆菌的特异性位点5671_C_T或者1473079_G_A；

[0080] 鉴别海豹分枝杆菌的特异性位点1674520_C_T或者1473094_T_C；

[0081] 鉴别非洲分枝杆菌的特异性位点4327103_T_A、1673338_G_A、1674434_T_C和1461251_G_T；

[0082] 鉴别猫鼬分枝杆菌的特异性位点1476719_C_A；

[0083] 鉴别米氏分枝杆菌的特异性位点1476664_T_G；

[0084] 鉴别卡氏分枝杆菌的特异性位点648856_T_C或者649601_C_T；

[0085] 鉴别牛分枝杆菌的特异性位点2289071_C_G和2156465_C；

[0086] 鉴别奇美拉分枝杆菌的特异性位点2371385_T_A、2370533_A_G、1870566_C_T或者1870236_A_G；

[0087] 鉴别副胞内分枝杆菌的特异性位点2371385_T_C、2370533_A_C、1870566_C_G或者1870236_A_C；

[0088] 鉴别胞内分枝杆菌复合群的特异性位点528892_C_T或者529084_G_C；

[0089] 鉴别马萨分枝杆菌的特异性位点528907_C_T或者529012_G_A；

[0090] 鉴别蒂莫内分枝杆菌的特异性位点528856_C_T、528889_G、528892_C_T、528919_C_T、528928_G_C、529012_G_A或者529051_G。

[0091] 在本申请的一些实施方式中，所述试剂包括序列如SEQ ID NO.1所示的引物以及SEQ ID NO.4所示的引物。

[0092] 在本申请的一些实施方式中，所述试剂包括序列如SEQ ID NO.2所示的引物以及SEQ ID NO.4所示的引物。

[0093] 在本申请的一些实施方式中，所述试剂包括序列如SEQ ID NO.3所示的引物以及SEQ ID NO.4所示的引物。

[0094] 在本申请的一些实施方式中，所述试剂包括：序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或者SEQ ID NO.7所示的引物，以及，SEQ ID NO.11所示的引物。

[0095] 在本申请的一些实施方式中，所述试剂包括序列如SEQ ID NO.8所示的引物以及SEQ ID NO.11所示的引物。

[0096] 在本申请的一些实施方式中，所述试剂包括：序列如SEQ ID NO.9或者SEQ ID NO.10所示的引物，以及SEQ ID NO.11所示的引物。

[0097] 本申请实施例的第二方面，还提供一种结核分枝杆菌的鉴别产品，所述结核分枝杆菌鉴别产品包括上述定义的试剂。

[0098] 本申请实施例的第三方面，还提供一种结核分枝杆菌的鉴别方法所述鉴别方法包括：

[0099] 采用上述定义的试剂对待测结核分枝菌进行检测，以及，

[0100] 根据所得检测结果判断所述待测结核分枝菌的类型。

[0101] 本申请的鉴别方法，可以以诊断为目的，也可以非诊断为目的。

[0102] 下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本申请中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。

[0103] 下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。

[0104] 表1、目标结核菌株类型及英文名称对照

[0105]

[0106]

[0107] 利用BLAST比对能够鉴定出那些相似度低或差异明显的结核分枝杆菌的菌株类型。但是，对于一些高度同源的结核菌株类型，BLAST比对很难准确判断其菌株类型。利用特异性位点的结核分枝杆菌类型鉴定方法不但能够准确判断结核分枝杆菌的菌株类型，而且极大节约了鉴定需要的时间成本和计算资源，对于结核分枝杆菌的快速诊断和及时治疗具有重要的临床意义。

[0108] 为了能够快速准确鉴定结核分枝杆菌的菌株类型，本申请实施例构建了一个高质量的结核分枝杆菌的特异性位点数据集。基于高质量的特异性位点数据集，本申请实施例开发了结核分枝杆菌的菌株类型鉴定系统，包括三个主要模块：

[0109] (1)数据库模块

[0110] 本申请实施例构建了结核分枝杆菌数据库(包括所有的目标杆菌类型，见表1)，即结核分枝杆菌参考数据库(包括全基因组参考序列数据)，结核分枝杆菌16S rRNA参考数据库，结核分枝杆菌ITS参考数据库，结核分枝杆菌23S rRNA参考数据库，及结核分枝杆菌HSP65参考数据库。

[0111] (2)特异性位点模块

[0112] 本申请实施例利用结核分枝杆菌数据库，通过序列比对分析确定结核分枝杆菌的特异性位点(如果存在的话)。结核分枝杆菌的特异性位点不但是每种结核菌株类型的所有菌株的共有位点，而且这些位点是该菌株类型所独有的位点，其他的菌株类型在同一位置不会出现对应的位点。

[0113] (3)鉴定模块

[0114] 菌株类型鉴定包括初次鉴定和再次鉴定两个部分，而且这两个部分互为补充，相辅相成：

[0115] 1.如果BLAST比对能够在初次鉴定中推断可能的菌株类型，本申请实施例在再次鉴定时利用特异性位点数据核查初次鉴定结果的准确性(如果存在的话)；

[0116] 2.如果BLAST比对不能在初次鉴定中判断菌株类型(比如序列高度相似的菌株类型)，本申请实施例在再次鉴定利用特异性位点数据判断其菌株类型。

[0117] 同时，本申请实施例设计并实施了利用特异性位点的结核分枝杆菌的菌株类型鉴定流程，如图1所示：

[0118] (1)测序数据质控：将待鉴定菌株的测序数据通过数据质控模块，利用FastQC查看测序数据质量，并使用Trimmomatic去除测序数据中引物序列和质量低的数据。

[0119] (2)有效突变位点判定：利用序列比对工具(比如，MAFFT等)将通过数据质控的测序数据与结核分枝杆菌的参考基因组(H37Rv，NC_000962.3)进行序列比对，确定待鉴定样本的突变位点信息。本申请实施例选定测序深度大于10且突变频率大于0.75的突变位点为样本的有效突变位点(包括插入和缺失)。

[0120] (3)菌株类型的初次鉴定：将通过数据质控的测序数据与结核分枝杆菌参考数据库进行BLAST比对。本申请实施例选择有效扩增深度大于10且有效扩增比例大于0.75的测序数据作为有效记录，并标记候选菌株类型；如果不能满足有效记录的条件要求，则菌株类型标记为空。

[0121] (4)菌株类型的再次鉴定：将待鉴定菌株的有效突变位点信息与结核分枝杆菌的特异性位点数据集进行搜索比较。对于步骤(3)能够判断类型的菌株，本申请实施例利用菌株特异性位点的信息核查初次菌株类型鉴定结果的可靠性(如果存在的话)，并优化结核分枝杆菌的特异性位点数据集；对于步骤(3)不能判断类型的菌株，本申请实施例将利用特异性位点数据集信息确定该菌株的菌株类型(利用样本菌株的有效突变位点进行判断)。

[0122] 实施例1

[0123] 确定脓肿分枝杆菌的三个亚种(脓肿亚种、博莱亚种和马赛亚种)相对于结核分枝杆菌参考基因组NC_000962.3的(528886,529111)区域内的特异性位点。

[0124] 参照图1所示流程：

[0125] 将脓肿分枝杆菌的脓肿亚种、博莱亚种和马赛亚种的菌株测序数据通过数据质控模块，使用Trimmomatic去除测序数据中引物序列和质量低的数据，获得对应菌株的基因组序列。利用MAFFT将菌株基因组序列与结核分枝杆菌标准株H37Rv参考基因组NC_000962.3进行序列比对，确定菌株序列相对于参考基因组的有效突变位点。本申请实施例把脓肿分枝杆菌的脓肿亚种、博莱亚种和马赛亚种的菌株序列相对于参考基因组在(528886,529111)区域的有效突变位点以稀疏矩阵形式进行了标记，见表2。

[0126] 表2、脓肿分枝杆菌三个亚种在(528886,529111)区域的有效突变位点的稀疏矩阵表示

[0127]

[0128]

[0129] 如表2所示，脓肿分枝杆菌脓肿亚种在位点528886发生G‑T突变，而其他类型的分枝杆菌在位点528886没有发生突变。因此，本申请实施例确定528886_G_T是脓肿分枝杆菌脓肿亚种的特异性位点。类似地，脓肿分枝杆菌脓肿亚种在(528886,529111)区域的特异性位点为528886_G_T、528889_G_T和528898_G_C。

[0130] 进一步地，本申请实施例确定在区域(528886,529111)，脓肿分枝杆菌博莱亚种有特异性位点528958_C_T；脓肿分枝杆菌马赛亚种有特异性位点529111_C_T。此外，脓肿分枝杆菌的博莱亚种和马赛亚种在(528886,529111)区域相似，因为它们在位点528889和528898有相同的有效突变位点。本申请实施例还定义了特异性位点组合。具体来说，根据博莱亚种和马赛亚种在表2所示的有效突变位点信息，本申请实施例定义博莱亚种的特异性位点组合为{528958_C_T，528961_C_T，529000_C}，马赛亚种的特异性位点组合为{528889_G_C,529000_C_T，529111_C_T，528961_C_T}。这样，本申请实施例可以利用特异性位点组合区分脓肿分枝杆菌的博莱亚种和马赛亚种。

[0131] 本申请实施例将结核菌株类型的特异性位点和特异性位点组合统称为特异性位点。本申请实施例列举了一些结核分枝杆菌的部分特异性位点，见表3。

[0132] 表3、结核分枝杆菌的特异性位点

[0133]

[0134] 实施例2

[0135] 本申请实施例利用结核分枝杆菌的特异性位点鉴定0510批次的5个菌株类型已知的脓肿分枝杆菌的亚种菌株类型。

[0136] 如表4所示，本申请实施例的5个样本(GDTB240510001_S1～GDTB240510005_S5)的菌株类型(包括大类和子类)。本申请实施例的靶标扩增区域R1P‑F9‑F1和R1P‑F10‑2RH‑F的引物序列信息见表5。

[0137] 表4、0510批次的5个样本的菌株类型信息

[0138]样本ID 菌株类型(大类) 菌株类型(小类)
GDTB240510001_S1 脓肿分枝杆菌 脓肿分枝杆菌马赛亚种
GDTB240510002_S2 脓肿分枝杆菌 脓肿分枝杆菌马赛亚种
GDTB240510003_S3 脓肿分枝杆菌 脓肿分枝杆菌博莱亚种
GDTB240510004_S4 脓肿分枝杆菌 脓肿分枝杆菌脓肿亚种
GDTB240510005_S5 脓肿分枝杆菌 脓肿分枝杆菌马赛亚种

[0139] 表5、靶标扩增区域的引物序列信息

[0140]

[0141] 按照结核分枝杆菌特异性位点的菌株类型鉴定流程(见图1)：

[0142] 本申请实施例将样本GDTB240510001_S1‑GDTB240510005_S5的测序数据通过数据质控模块，使用Trimmomatic去除测序数据中引物序列和质量低的数据。利用MAFFT工具将通过质控的测序数据与结核分枝杆菌的参考基因组NC_000962.3进行序列比对，确定待鉴定菌株的有效突变位点。本申请实施例选择测序深度大于10且突变频率大于0.75的突变位点为菌株的有效突变位点。

[0143] 本申请实施例把通过质控模块的测序数据与结核分枝杆菌参考数据库进行BLAST比对，进行菌株类型的初次鉴定。基于BLAST比对结果，样本GDTB240510001_S1与脓肿分枝杆菌(Identity＝98.473，Evalue＝1.08e‑57)和结核分枝杆菌(Identity＝96.154，Evalue＝8.34e‑53)相似。本申请实施例判断样本GDTB240510001_S1的菌株类型为脓肿分枝杆菌，因为脓肿分枝杆菌在扩增区域R1P‑F9‑F1和R1P‑F10‑2RH‑F的扩增深度都大于10且有效扩增比例大于0.95；而结核分枝杆菌的扩增深度和扩增比例不能作为样本类型判断的有效依据，具体数据见表6。

[0144] 由于脓肿分枝杆菌的亚种之间高度同源，利用BLAST比对无法鉴定菌株类型到亚种水平。因此，本实施例利用特异性位点信息对样本GDTB240510001_S1的菌株类型进行亚种水平鉴定。本申请实施例发现样本GDTB240510001_S1中存在有效突变位点529111_C_T、528961_C_T、528889_G_C和529000_C_G，这些位点是脓肿分枝杆菌马赛亚种的特异性位点。
据此判定，样本GDTB240510001_S1的菌株类型为脓肿分枝杆菌(大类)的马赛亚种(小类)。

[0145] 类似地，样本GDTB240510002_S2和GDTB240510005_S5与样本GDTB240510001_S1的菌株类型相同，同为脓肿分枝杆菌的马赛亚种。

[0146] 基于相同的鉴别流程对其他菌株样本类型进行鉴别：

[0147] 根据结核分枝杆菌参考数据库的BLAST比对结果及样本在靶标扩增区域内的扩增深度和扩增比例，本申请实施例初步判断样本GDTB240510003_S3的菌株类型为脓肿分枝杆菌。同时，样本GDTB240510003_S3存在有效突变位点{528958_C_T，528961_C_T，529000_C}为博莱亚种的特异性位点。据此判定，样本GDTB240510003_S3的菌株类型为脓肿分枝杆菌(大类)的博莱亚种(小类)。

[0148] 样本GDTB240510004_S4的结核分枝杆菌参考数据库BLAST比对结果显示，样本类型可能为结核分枝杆菌，脓肿分枝杆菌或圣保罗拟分枝杆菌。本申请实施例根据样本在靶标扩增区域的扩增深度和扩增比例排除样本为结核分枝杆菌或圣保罗拟分枝杆菌的可能。进一步地，本申请实施例发现样本GDTB240510004_S4中的有效突变位点528886_G_T、
528889_G_T和528898_G_C为脓肿分枝杆菌脓肿亚种的特异性位点。因此，样本
GDTB240510004_S4的菌株类型被鉴定为脓肿分枝杆菌(大类)的脓肿亚种(小类)。

[0149] 表6、样本GDTB240510001_S1～GDTB240510005_S5在靶标扩增区域的扩增情况及可能的菌株类型

[0150] 样本ID 靶标扩增区域 扩增深度 有效扩增深度 有效扩增比例 可能的菌株类型GDTB240510001_S1 R1P‑F10‑2RH‑F1 4625 4531 0.979676 脓肿分枝杆菌GDTB240510001_S1 R1P‑F10‑2RH‑F1 4625 94 0.020324 结核分枝杆菌
GDTB240510001_S1 R1P‑F10‑2RH‑F2 25 1 0.04 结核分枝杆菌
GDTB240510001_S1 R1P‑F10‑2RH‑F2 25 24 0.96 脓肿分枝杆菌
GDTB240510001_S1 R1P‑F9‑F1 22265 128 0.005749 结核分枝杆菌
GDTB240510001_S1 R1P‑F9‑F1 22265 22137 0.994251 脓肿分枝杆菌
GDTB240510002_S2 R1P‑F10‑2RH‑F2 31 1 0.032258 结核分枝杆菌
GDTB240510002_S2 R1P‑F10‑2RH‑F2 31 30 0.967742 脓肿分枝杆菌
GDTB240510002_S2 R1P‑F9‑F1 29229 74 0.002532 结核分枝杆菌
GDTB240510002_S2 R1P‑F9‑F1 29229 29155 0.997468 脓肿分枝杆菌
GDTB240510002_S2 R1P‑F10‑2RH‑F1 6420 55 0.008567 结核分枝杆菌
GDTB240510002_S2 R1P‑F10‑2RH‑F1 6420 6365 0.991433 脓肿分枝杆菌
GDTB240510003_S3 R1P‑F9‑F1 27930 67 0.002399 结核分枝杆菌
GDTB240510003_S3 R1P‑F9‑F1 27930 27863 0.997601 脓肿分枝杆菌
GDTB240510003_S3 R1P‑F10‑2RH‑F2 31 31 1 脓肿分枝杆菌
GDTB240510003_S3 R1P‑F10‑2RH‑F1 6234 85 0.013635 结核分枝杆菌
GDTB240510003_S3 R1P‑F10‑2RH‑F1 6234 6149 0.986365 脓肿分枝杆菌
GDTB240510004_S4 R1P‑F9‑F1 31917 850 0.026632 结核分枝杆菌
GDTB240510004_S4 R1P‑F9‑F1 31917 31067 0.973368 脓肿分枝杆菌
GDTB240510004_S4 R1P‑F9‑F1 31917 6 0.000188 圣保罗拟分枝杆菌
GDTB240510004_S4 R1P‑F10‑2RH‑F2 44 2 0.045455 结核分枝杆菌
GDTB240510004_S4 R1P‑F10‑2RH‑F2 44 42 0.954545 脓肿分枝杆菌
GDTB240510004_S4 R1P‑F10‑2RH‑F1 6532 342 0.052358 结核分枝杆菌
GDTB240510004_S4 R1P‑F10‑2RH‑F1 6532 6190 0.947642 脓肿分枝杆菌
GDTB240510004_S4 R1P‑F10‑2RH‑F1 6532 1 0.000153 圣保罗拟分枝杆菌
GDTB240510005_S5 R1P‑F10‑2RH‑F2 35 33 0.942857 脓肿分枝杆菌
GDTB240510005_S5 R1P‑F10‑2RH‑F2 35 2 0.057143 结核分枝杆菌
GDTB240510005_S5 R1P‑F9‑F1 32950 32656 0.991077 脓肿分枝杆菌
GDTB240510005_S5 R1P‑F9‑F1 32950 294 0.008923 结核分枝杆菌
GDTB240510005_S5 R1P‑F10‑2RH‑F1 6847 6682 0.975902 脓肿分枝杆菌
GDTB240510005_S5 R1P‑F10‑2RH‑F1 6847 165 0.024098 结核分枝杆菌

[0151] 本申请实施例把样本GDTB240510001_S1～GDTB240510005_S5的菌株类型鉴定结果与样本的真实菌株类型信息相对照发现，利用结核分枝杆菌的特异性位点信息可以准确鉴定结核分枝杆菌到亚种菌株类型。

[0152] 通过以上实施例发现，BLAST比对能够鉴定相似度低或差异明显的结核菌株类型。但是，对于那些高度同源的结核菌株类型(序列相似度极高)，BLAST比对很难准确判断样本的结核菌株类型(或亚种菌株类型)。尽管本申请实施例中菌株类型鉴定方法的条件设置相对严格(需要满足靶标扩增区域的扩增深度和扩增比例的要求)，实施例仍然可以通过利用分枝杆菌的特异性位点信息来判断结核样本的菌株类型(有些样本不能满足扩增深度或扩增比例的要求)。

[0153] 实施例3

[0154] 为了进一步提高结核菌株类型鉴定方法的准确性，本申请实施例利用四个靶标扩增区域(R1P‑F7‑6‑F1、R1P‑F8‑F1、R1P‑F9‑F1和R1P‑F10‑2RH‑F)，并结合BLAST比对和分枝杆菌的特异性位点鉴定样本GDTB240718001_S1～GDTB240718009_S9的结核菌株类型。

[0155] 本申请实施例的四个靶标扩增区域的引物序列信息见表7；菌株样本DNA提取使用诺唯赞VAMNE Magnetic Pathogen DNA/RNA Kit试剂盒，参照使用说明对分枝杆菌进行DNA提取；扩增实验的反应体系和反应程序分别见表8和表9。

[0156] 表7、扩增区域的引物序列信息

[0157]

[0158] 表8、扩增实验的反应体系

[0159] 组分 体积正向扩增引物(12.5uM) 0.4μl
反向扩增引物(12.5uM) 0.13μl
接头引物(100uM) 0.4μl
Taq Pro Multiplex DNA Polymerase(High sensitive) 1μl
2x Multiplex buffer 12.5μl
template 5μl
H2O 5.6μl
Total 25μl

[0160] 表9、扩增实验的反应程序

[0161]

[0162] 按照结核分枝杆菌特异性位点的菌株类型鉴定流程(见图1)：

[0163] 本申请实施例将样本GDTB240718001_S1～GDTB240718009_S9的测序数据通过数据质控模块，使用Trimmomatic去除测序数据中引物序列和质量低的数据。利用MAFFT工具将通过质控的测序数据与结核分枝杆菌的参考基因组NC_000962.3进行序列比对，确定待鉴定菌株的有效突变位点。本申请实施例选择测序深度大于10且突变频率大于0.75的突变位点为菌株的有效突变位点。同时，样本GDTB240718001_S1～GDTB240718009_S9的结核菌株类型及样本在四个靶标扩增区域的扩增情况分别见表10和表11。

[0164] 表10、0718批次的9个结核菌株样本信息及对应菌株类型

[0165]样本ID 菌株类型(真实) 菌株类型(鉴定)
GDTB240718001_S1 溃疡分枝杆菌 溃疡分枝杆菌
GDTB240718002_S2 海分枝杆菌 海分枝杆菌
GDTB240510003_S3 胃分枝杆菌 胃分枝杆菌
GDTB240510004_S4 脓肿分枝杆菌脓肿亚种 脓肿分枝杆菌脓肿亚种
GDTB240510005_S5 草分枝杆菌 草分枝杆菌
GDTB240718006_S6 金色分枝杆菌 金色分枝杆菌
GDTB240718007_S7 浅黄分枝杆菌 浅黄分枝杆菌
GDTB240510008_S8 蟾蜍分枝杆菌 蟾蜍分枝杆菌

[0166] 如表11所示，根据样本GDTB240718001_S1在四个靶标扩增区域的扩增情况及BLAST比对结果，本申请实施例初步推测样本的菌株类型为Mycobacterium_marinum_homcomplex(溃疡分枝杆菌和海分枝杆菌的复合群)。进一步地，样本GDTB240718001_S1的有效突变位点包含表3所示的溃疡分枝杆菌的特异性位点528811_C_T和529003_G_A。因此，本申请实施例鉴定样本GDTB240718001_S1的菌株类型为溃疡分枝杆菌，与样本的真实菌株类型相一致，见表10。

[0167] 类似地，本申请实施例初步推测样本GDTB240718002_S2的菌株类型为溃疡分枝杆菌和海分枝杆菌的复合群。利用样本的有效突变位点信息确认样本GDTB240718002_S2的菌株类型为海分枝杆菌，因为样本GDTB240718002_S2的有效突变位点包含海分枝杆菌的特异性位点{528995_C_T,529009_C}。

[0168] 一般情况下，本申请的结核菌株类型鉴定方法会依据样本在靶标扩增区域的有效扩增对应的候选菌株类型推测样本的菌株类型。但是，由于菌株质量和实验条件等原因，无法保证样本在每个靶标扩增区域都能够进行有效扩增，比如菌株GDTB240718003_S3在R1P‑F8‑F1(有效扩增占比0.7)和R1P‑F9‑F1(有效扩增占比0.721019)没有达到有效扩增的要求。此时，本申请实施例会适当降低菌株类型鉴定的有效扩增条件。因此，样本GDTB240718003_S3的初次菌株类型推测为胃分枝杆菌。同时，本申请实施例还会利用胃分枝杆菌的特异性位点528892_C_G；529051_G_C；529078_T_C信息来进一步确认样本的结核菌株类型预测结果是否准确。经验证，样本GDTB240718003_S3的有效突变位点中包含胃分枝杆菌的特异性位点，因此，样本GDTB240718003_S3的菌株类型为胃分枝杆菌。

[0169] 与实施例2的脓肿分枝杆菌的亚种菌株类型鉴定方法相同，样本GDTB240510004_S4的菌株类型为脓肿分枝杆菌的脓肿亚种。

[0170] 对于样本GDTB240510005_S5～GDTB240510009_S9，根据样本在靶标扩增区域的有效扩增对应的候选菌株类型并使用BLAST比对可以直接推测样本的结核菌株类型，对应的菌株类型预测结果见表10。

[0171] 正如表10所示，样本GDTB240510001_S1～GDTB240510009_S9的真实菌株类型和预测菌株类型都是一致的。因此，利用特异性位点的结核分枝杆菌类型鉴定方法不但能够准确判断结核分枝杆菌的菌株类型，而且极大节约了鉴定需要的时间成本和计算资源，对于结核分枝杆菌的快速诊断和及时治疗具有重要的临床意义。

[0172] 表11、样本GDTB240718001_S1‑GDTB240718009_S9在靶标扩增区域的扩增情况及候选菌株类型

[0173]

[0174]

[0175]

[0176] 以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。

[0177] 以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，便于具体和详细地理解本申请的技术方案，但并不能因此而理解为对申请专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。此外应理解，在阅读了本申请的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本申请作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本申请提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本申请所附权利要求的保护范围内。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。