技术领域
[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，更具体地说，涉及一种红树莓RuSA1基因及其表达蛋白和应用。
相关背景技术
[0002] 红树莓又名覆盆子(Rubus idaeus L.)，是蔷薇科悬钩子属灌木植物，高1‑2米；幼枝被柔毛，疏生皮刺，叶长卵形或椭圆形；花瓣匙形，被短柔毛或无毛，白色；果近球形为聚合果，成熟时红或橙黄或黑色，密被短绒毛。果实含有丰富的次生代谢物质，具有益肾固精缩尿、养肝明目、抗癌、抗氧化、抗衰老、抗菌抗炎等作用。
[0003] 在细胞生物学领域，信号传导通路是细胞内外相互作用的重要途径之一。在这个信号传导网中，SA通路被认为是一条重要的通路，对细胞的生命过程和功能起着关键的调控作用。SA通路通过调控一系列基因的表达和活性，影响细胞的增殖、分化、凋亡等重要生理过程，以及应对外界环境的应激反应。此外，SA可以促进果实多酚积累和黄酮关键通路基因的表达(卫颖，2021)。SA基因及其通路可能影响植物的主要营养成分和抗氧化能力，从而提高植物的抗病害能力和利于植物的生长和发育。为了探索SA通路的调控机制及其关键基因的功能，提高红树莓植物的抗氧化成分和生长势，为生产利用及其育种提供有力的支持。因此，解析红树莓RuSA1基因的表达及其应用研究具有重要的科学和应用价值。
具体实施方式
[0030] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中如无详细说明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0031] 本申请选用的红树莓材料种植于江苏省南京市溧水区白马镇的江苏省中国科学院植物研究所实验基地；分别采摘红树莓不同时期青果、青黄果、黄色果、黄红转色果、红色果，新鲜采摘后立即在液氮中冷冻，然后储存在‑80℃用于RNA提取。
[0032] 本申请选用的番茄侵染材料种植于江苏省中国科学院植物研究所(南京中山植物园北园)科学楼的组培室；采摘番茄叶片及不同时期果实青果、黄果、橙果、橙红果和红果，采摘后立刻放入液氮中冷冻，然后储存在‑80℃用于RNA提取及后续生理指标测定。
[0033] 实施例1
[0034] 1、总RNA提取及cDNA获得
[0035] 使用植物多糖多酚总RNA提取试剂盒提取红树莓和番茄的总RNA(BioTeke,Beijing,China)，并通过琼脂凝胶电泳检测RNA的完整性。RNA的浓度和纯度采用Nanodrop 2000c spectrophotometer(Thermo Fisher,Waltham,MA,USA)进行检测。使用PrimeScript RT Master Mix试剂盒(TaKaRa,Otsu,Japan)反转录成cDNA。
[0036] 2、红树莓RuSA1基因克隆
[0037] 根据红树莓基因组序列，使用Oligo 7.0软件设计引物，通过高速高保真PCR酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase克隆候选基因的开放阅读框ORF序列。引物序列如下所示：
[0038] RuSA1 ORF‑F：5’‑ATGGAGAATATAAGACTGAAGC‑3’，
[0039] RuSA1 ORF‑R：5’‑AGAATATTTCTGAGCAACCTTG‑3’。
[0040] 用快捷型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(BioTeKe,Beijing,China)进行目的片段的切胶回收和纯化，然后使用pClone007 Blunt Vector Kit试剂盒(TSINGKE,Beijing,China)将切胶回收纯化后的产物与T载体连接，一起转入到大肠杆菌感受态中，短暂复苏后涂布于抗性为氨苄的培养基上，37℃过夜培养后挑选单菌落。使用的2×T5 Super PCR Mix(Colony)做菌液PCR验证(TSINGKE,Beijing,China)，将阳性菌液送至南京擎科生物技术有限公司进行一代Sanger测序验证。
[0041] 最终测序获得红树莓RuSA1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0042] 3、红树莓RuSA1基因表达模式分析
[0043] 使用TB Green Premix TaqⅡ试剂(Takara,Dalian,China)对红树莓不同果实时期的cDNA进行RT‑qPCR实验。使用qTOWER2.2实时PCR系统(Analytik，Jena，Germany)进行‑ΔΔCTqRT‑PCR反应，反应系统和步骤均根据制造商的说明书进行的。根据2 法，以18S为内参基因检测候选红树莓基因RuSA1在不同果实时期的相对表达水平。引物序列如下所示：
[0044] RuSA1 qRT‑F：5’‑TGGAGCTGGTCATGGAGCGT‑3’，
[0045] RuSA1 qRT‑R：5’‑TCGGGTTGATCCCGGATGCT‑3’。
[0046] 结果如图1所示，RuSA1基因在红树莓生长发育过程中表达量先下降然后上升，在S2阶段表达量最低，为0.09，而在S5阶段成熟时表达量最高是5.10。
[0047] 实施例2
[0048] 1、构建红树莓RuSA1基因过表达载体及转化农杆菌
[0049] 采用Gateway技术构建红树莓的过量表达载体，通过LR反应将入门载体(Linker‑7)中的目的片段转移至35S强启动子的过量表达载体Pbi121‑des‑3HA中，验证成功的菌液用于提取质粒。取100ng待转化质粒加入100μL农杆菌GV3101感受态中进行转化，涂布于卡那和利福平双抗性的培养基上，28℃培养2天，随机挑选单菌落，菌液PCR验证，4℃保存备用。
[0050] 2、遗传转化番茄及阳性植株筛选
[0051] 当番茄幼苗的2片子叶完全展开时，用手术刀将子叶切成小段移至预培养基中，暗培养2d。将已准备好的转化基因的农杆菌扩大培养(OD600＝0.5‑1)，将菌液4000rpm室温离心10min，收集菌体，使用乙酰丁香酮的MS培养基重悬菌体，立即混匀。将切好的叶片放入侵染10‑20min。侵染后吸干表面水分，放入共培养基上暗培养2‑3d。将共培养培养基中的外植体移入含100mg/L Ti(特美汀)的无菌水中浸泡1h，再用含300mg/L Ti的无菌水浸泡15min，吸干表面水分后放入筛选培养基(包含Kan筛选压：100mg/L；Ti抑制农杆菌：300mg/L)中，28℃培养，之后每半月换一次培养基。3周后将外植体转入生芽培养基，当外植体分化出小苗时，将小苗用手术刀切下插入生根培养基(包含Kan筛选压：50mg/L；Ti抑制农杆菌：300mg/L)中培养。待苗的根系发达后，移栽转移至盆中，温室中培养，25℃，每日光照16h。提取番茄转基因株系和空白对照的叶片RNA反转录成cDNA并通过荧光定量PCR检测目标基因是否过表达，从而筛选获得表达量较高的阳性转基因株系。
[0052] 3、转基因番茄基因表达模式分析
[0053] 对阳性转基因番茄的叶片进行基因表达水平分析，筛选出RuSA1基因表达量较高的株系RuSA1‑1和RuSA1‑8(图2)。后续对株系RuSA1‑1和RuSA1‑8的不同时期果实进行基因表达水平分析。
[0054] 结果如图3所示，株系RuSA1‑1和RuSA1‑8的不同时期果实的表达量均显著高于CK，其中株系RuSA1‑1的表达量最高。
[0055] 4、转基因番茄植株的外观指标及生理指标
[0056] 对株系RuSA1‑1和RuSA1‑8的外观指标(株高、花序、冠幅、花直径)进行测定，叶绿素含量(SPAD)值和N含量采用SPAD仪器(TYS‑4N型，浙江托普云农科技股份有限公司)测定。
[0057] 结果如表1所示，转基因番茄45d时转基因株系的花序均少于CK，株系RuSA1‑1和RuSA1‑8的SPAD值和N含量均显著高于CK；90d时，株系RuSA1‑1和RuSA1‑8的株高均高于CK；165d时，株系RuSA1‑1和RuSA1‑8的SPAD值和N含量与CK差异不显著。结果表明，随着番茄植株的生长发育SPAD值和N含量逐渐降低。综上所述，RuSA1基因促进番茄株系生长，提高叶片叶绿素和N含量。
[0058] 表1转基因番茄植株的外观指标测定
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[0060] 5、转基因番茄果实的外观指标
[0061] 使用游标卡尺测量株系RuSA1‑1和RuSA1‑8的果实纵径(果基到果顶的长度)和果实横径(果实最粗处的直径)。用精确到0.001克的天平测量番茄单果质量。用KM‑5型硬度计测定果实硬度。
[0062] 结果如表2所示，随着果实生长发育，株系RuSA1‑1和RuSA1‑8果实的质量、横径和纵径均逐渐增加，而硬度逐渐降低。与对照组相比，株系RuSA1‑1和RuSA1‑8果实的质量、横径和纵径均显著增大，硬度差异并不显著(图4)。上述结果表明，RuSA1基因促进番茄果实生长，且成熟时降低硬度。
[0063] 表2转基因番茄果实的外观指标测定
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[0066] 6、转基因番茄果实的生理指标
[0067] 可溶性固形物测定使用PAL‑1糖度计测定。可滴定酸含量(TA)通过氢氧化钠滴定法测定。花色苷含量的检测方法：取果实样品液氮研磨至粉末，称取1g，加入提取液(含0.1％甲酸的50％乙醇)，摇匀，在35℃以60Hz超声波处理20min，5000rpm离心5min，取上清液0.3mL，加入2.7mL pH＝1的PBS，摇匀，室温下避光静置20min，在510nm处测吸光度，计算花色苷含量FW(mg/g)。使用南京建成生物工程研究所的植物总酚检测试剂盒(A143‑1‑1)测定总多酚含量。采用FRAP法，使用总抗氧化能力(T‑AOC)测定试剂盒(A015‑3‑1)测定转基因植株果实的总抗氧化能力。
[0068] 结果如图5所示，在S5时期株系RuSA1‑1和RuSA1‑8果实的可溶性固形物含量与CK差异不显著，但在S3时期时转基因果实显著高于CK(图5a)。转基因果实在S3和S5时期可滴定酸含量显著高于CK，S5时，RuSA1‑1的可滴定酸含量最高为2.36％(图5b)。S5时期株系RuSA1‑1和RuSA1‑8果实的花色苷含量均显著高于CK(图5c)。SA转基因果实S3时总多酚含量‑1显著高于CK，S5时，转基因果实略高于CK，其中RuSA1‑1的含量最高为6.18mg·g FW(图5d)。
番茄的总抗氧化能力在S5时期最高，转基因果实的总抗氧化能力显著高于CK，其中RuSA1‑8‑1
的总抗氧化能力最高，为251.14mmol·g FW(图5e)。结果表明，RuSA1基因促进番茄果实花色苷和总多酚等物质积累，并提高其总抗氧化能力。
[0069] 7、转基因番茄果实中激素相关基因的表达水平分析
[0070] 结果如图6所示，株系RuSA1‑1和RuSA1‑8果实中与ABA激素分泌相关的基因SlABA、SlNCED1、SlACS2和SlACO1，与IAA激素分泌相关的基因SlIAA36，与GA激素分泌相关的基因Sl2ox4和Sl20x2的表达量均显著高于CK。结果表明，RuSA1基因可能促进IAA、ABA和GA激素合成途径上的相关基因的表达。
[0071] 以上说明对本发明而言只是说明性的，而非限制性的，本领域普通技术人员理解，在不脱离所附权利要求所限定的精神和范围的情况下，可做出许多修改、变化或等效，但都将落入本发明的保护范围。
