[0001] 本发明涉及一种高性能终止子及其在提高基因表达中的应用，属于生物技术领域。

[0002] 终止子位于基因3'端的非编码区，其最基本的功能是终止上游基因转录，避免转录通读现象的发生。转录通读会导致RNA聚合酶循环过程被限制，因此对整体的转录效率造成额外负担，影响下游基因表达。因此，探究影响终止子终止效率的因素一直是终止子领域研究的重点。

[0003] 然而，除了终止基因转录通读外，越来越多的研究表明终止子对于提高上游基因表达和维持上游基因mRNA的稳定性方面同样有着不可忽视的作用。在真核生物中，终止子由3'‑UTR非翻译区和终止mRNA转录的区域组成，它可以对抗细胞内酶的水解作用从而保护上游基因的mRNA不被降解，而这种保护作用与3'‑UTR区域是密切相关的，3'‑UTR内GC碱基的含量、区域的长度和二级结构都会影响终止子对上游基因mRNA的保护作用。

[0004] 在原核生物中，尽管有部分研究表明终止子可以通过抑制水解酶的降解维持上游基因mRNA的稳定性从而提高上游基因表达水平，但尚缺乏相关研究探讨终止子特征与上游基因mRNA稳定性之间的关系，明确这种关系对于设计高效提高上游基因表达水平的终止子元件是至关重要的。

[0028] 以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。

[0029] 以下实验如未著名具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购可获得的常规产品。除非另外说明，否则所有的百分数、比率或份数按重量计。

[0030] 除非另外定义，文中所用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用与本发明。

[0031] 下面实施例涉及的测定方法或培养方法如下：

[0032] LB培养基：蛋白胨10.0g·L‑1，NaCl 10.0g·L‑1，酵母粉5.0g·L‑1，121℃灭菌20min。

[0033] PBS缓冲液：氯化钾0.2g·L‑1、氯化钠8.0g·L‑1、磷酸二氢钾0.24g·L‑1、磷酸氢二‑1钠1.44g·L 、；pH 7.4，121℃灭菌20min。

[0034] 生物量的测定方法(紫外可见光光度计)：将各个取样点的样品稀释合适倍数，至OD600值为0.2‑0.8，在波长600nm处测取吸光度。

[0035] mRNA水平检测方法：取1mL发酵后的菌液通过RNA提取试剂盒从中提取RNA，再通过反转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，最后通过Quantitative Real‑time PCR(qPCR)的方式对mRNA水平进行检测。

[0036] 烟酰胺单核苷酸(NMN)的摇瓶发酵产量测定方法：取亲本菌株RSF和突变菌株RSF‑‑11到RSF‑4的菌液10μL，划线接种于固体LB平板(Kan抗性)上并于37℃、220r·min 条件下培‑1
养12h。挑取单菌接种到10ml LB小瓶(Kan抗性)中，37℃，220r·min 培养12h，随后取600μL‑1
加入30mL LB大瓶(Kan抗性)，37℃，220r·min 培养2h至OD为0.4～0.6之间。加入终浓度为‑1 ‑1
0.3mM的IPTG，25℃，220r·min 发酵12h，投底物于25℃反应2h，12000r·min 离心10min，取上清液过水膜，使用HPLC测定NMN的产量。

[0037] 腺苷蛋氨酸(SAM)的摇瓶发酵产量测定方法：取亲本菌株GSH和突变菌株GSH‑1到‑1GSH‑4的菌液10μL，划线接种于固体LB平板(Kan抗性)上并于37℃、220r·min 条件下培养‑1
12h。挑取单菌接种到10mL LB小瓶(Kan抗性)中，37℃，220r·min 培养12h，随后取1mL加入‑1
50mL LB大瓶(Kan抗性)，37℃，220r·min 培养2h至OD为0.6～0.8之间。加入终浓度为‑1
0.01mM的IPTG，25℃，220r·min 发酵12h，取2mL发酵液洗涤(Tris盐酸)2次，投底物于37℃‑1
反应2h，加入20％高氯酸终止反应，12000r·min 离心10min，取上清液过水膜，使用HPLC测定SAM产量。

[0038] 以下为具体实施例：

[0039] 实施例1：大规模终止子突变文库构建及FlowSeq技术

[0040] (1)终止子突变文库的构建

[0041] 终止子突变文库的模板DNA分成保守区域和突变区域，首先将正向链和反向链引物的干粉稀释至10μM，各取10μL混合，然后进行退火反应，退火结束后将样品缓慢冷却至室温，随后使用Klenow酶扩增第二链RNA，在25℃下培养20min，然后加入终浓度为10mM的EDTA，在75℃下反应20min，以去除酶的活性。反应完成后用T4 polyphosphorylase酶将上述反应后的样品5'端磷酸化，为下一步的连接反应做准备。

[0042] 使用限制性酶Hind III和EcoR I对质粒进行酶切，获得线性化质粒，然后用T4 DNA ligase将线性化质粒与前面磷酸化的片段在4℃下过夜连接。将连接产物分装到20只大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，放置于冰上冷却30min，随后在42℃下加热90s，再次放于冰上冷却5min。之后向每个试管中加入LB培养基，使最终体积达到1mL。在37℃、220r·‑1min 的条件下培养1h后，把10只试管中的液体加入到100mL添加了卡那霉素的LB液体培养‑1
基中于37℃、220r·min 条件下过夜培养。

[0043] (2)流式细胞分选

[0044] 取2mL过夜培养后的菌液加入100mL添加卡那霉素的LB液体培养基中，并加入终浓‑1度为0.5mM的IPTG，在37℃、220r·min 条件下诱导培养2h。接着取1mL菌液在12000r·min‑1
转速下离心，用PBS溶液洗涤两次，随后加入1mL PBS溶液对细胞进行重悬。接着使用流式细胞仪对细胞进行筛选，流式细胞仪(Becton Dickinson FACSAria III)的激发波长为
561nm，发射波长为610/20nm，检测mRFP1荧光。使用FlowJo v10软件分析流式细胞仪的数据并计算平均荧光强度。最后根据下游红色荧光的强度将细胞分为弱终止子bin1、中强度终止子bin2和强终止子bin3。

[0045] (3)高通量测序

[0046] 将收集到的细胞在37℃、220r·min‑1的条件下复苏2h，随后接种到100mL添加卡那‑1霉素的LB培养基中，在37℃下以220r·min 的速度振荡培养12h，取1mL菌液提取质粒，使用目标引物进行PCR扩增获得DNA扩增产物。接着，使用RNA提取试剂盒从菌液中提取RNA，并使用反转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，然后使用目标引物进行PCR扩增，获得cDNA扩增片段。
最后，三个bin各取1000ng DNA和RNA扩增片段进行高通量测序，测序平台为华大的MGISEQ‑
2000平台。

[0047] 相关流程示意图见附图1。

[0048] (4)数据处理

[0049] 对于测序完成的fastq文件，采取以下步骤对序列数据进行处理：使用cutadapt软件对序列进行切除同时使用prinseqlite软件对序列进行指控，单个碱基的质量得分应在30以上。同时，序列的U‑tract位置处的前三个碱基中应该保证至少有1个以上的U碱基存在。利用Vienna RNA package工具包中的RNA折叠和RNA评估软件对终止子的二级结构进行预测，同时计算每个终止子的最小自由能ΔG。

[0050] 数据处理完成后，从终止子强度、突变位点碱基组成、以及二级结构差异三个角度出发分析，得出有利于提高上游基因mRNA稳定性的终止子应满足以下特征：终止效率高、发卡基部富含GC碱基且U‑tract下游富含AT碱基、并且二级结构稳定。

[0051] 基于以上的特征，我们设计筛选得到了h‑1至h‑4这4种高性能终止子，并将于两种不同的表达体系中验证它们的调控效果。

[0052] 表1高性能终止子h‑1至h‑4的序列信息

[0053]

[0054] 实施例2：亲本菌株RSF及突变菌株RSF‑1至RSF‑4的发酵性能及上游基因mRNA水平分析

[0055] 以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，在质粒pET28a原有的T7启动子后加入Nrk基因，构建得到一株能够发酵生产NMN的亲本菌株RSF；进一步，将高性能终止子(h‑1至h‑4)插入菌株RSF的质粒中，替换原有的T7终止子，从而产生了四个突变菌株RSF‑1至RSF‑4。

[0056] 对亲本菌株RSF和突变菌株RSF‑1至RSF‑4进行摇瓶发酵，同时对上游基因mRNA水平进行检测，菌株RSF作为对照，评价高性能终止子在该表达体系中的应用效果，结果如图2所示。

[0057] (1)发酵产物NMN的产量比较

[0058] RSF的发酵产生的NMN产量为1.0g·L‑1，替换高性能终止子后的突变菌株发酵产生‑1的NMN产量则有着不同程度的提高。其中RSF‑4发酵产生的NMN产量最高，达到1.64g·L ，比RSF的发酵产量高出64％。

[0059] (2)上游基因mRNA水平比较

[0060] 亲本菌株RSF和突变菌株RSF‑1至RSF‑4的上游基因mRNA水平结果表明：与亲本菌株RSF相比，突变菌株RSF‑1至RSF‑4的上游mRNA水平都有极大的提升，其中RSF‑4的上游基因mRNA水平甚至达到了RSF的4倍。

[0061] 实施例3：亲本菌株GSH及突变菌株GSH‑1至GSH‑4的发酵性能及上游基因mRNA水平分析

[0062] 以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，在质粒pET28a原有的T7启动子后加入Sam2基因，构建得到一株能够发酵生产SAM的亲本菌株GSH；进一步，将高性能终止子(h‑1至h‑4)插入菌株GSH的质粒中，替换原有的T7终止子，从而产生了四个突变菌株GSH‑1至GSH‑4。

[0063] 对亲本菌株GSH和突变菌株GSH‑1至GSH‑4进行摇瓶发酵，同时对上游基因mRNA水平进行检测，菌株GSH作为对照，评价高性能终止子在该表达体系中的应用效果，结果如图3所示。

[0064] (1)发酵产物SAM的产量比较

[0065] GSH发酵产生的SAM产量为0.28g·L‑1，突变菌株GSH‑1至GSH‑4的发酵产物产量都‑1超过了0.4g·L ，相较于GSH的发酵产量提高了40％～60％。

[0066] (2)上游基因mRNA水平比较

[0067] 与亲本菌株GSH的上游基因mRNA水平相比，GSH‑1至GSH‑4的上游基因mRNA水平提高了30％～55％，其中GSH‑1、GSH‑3和GSH‑4的上游基因mRNA水平提升都超过了50％。

[0068] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。