技术领域
[0001] 本发明涉及一种促进肿瘤细胞空洞的shRNA转基因重组质粒及其应用，属于生物医药技术领域。
相关背景技术
[0002] 视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)是儿童最常见的眼部恶性肿瘤，“二次突变－－假说”认为RB1抑癌基因的两个等位基因在视网膜发育过程中相继失活，导致RB1 / RB的发生。然而最新研究发现约2％的RB患者体内MYCN原癌基因高度扩增的同时不伴有RB1基因突+ + A －－
变，因此将RB1/MYCN 作为RB一种新的致病基因型。此型RB较经典RB1 / RB型起病早、侵袭性强、保眼率低。
[0003] 肿瘤细胞空洞是由于肿瘤血管发育不完善，当肿瘤中心部分缺乏营养供给，会出现坏死，当坏死物质吸收后形成空洞。在视网膜母细胞瘤、肝癌等恶性肿瘤中经常能够看到肿瘤形成空洞，但是现有技术还没有针对空洞型RB预后分析。
[0004] 病毒类载体是基因治疗主要的基因导入工具。慢病毒载体可对基因进行有效递送，但慢病毒具有较高的宿主基因组整合率，临床应用安全风险大。近年来研究发现，腺相关病毒(AAV)能广泛感染组织细胞，免疫原性和整合能力低，递送效率和安全性较高。
[0005] 腺病毒(Adenovirus)是一种线性双链DNA无包膜病毒，对分裂期细胞和非分裂期细胞均具有感染能力，且具有嗜上皮细胞性。重组腺病毒载体是以腺病毒为基础发展起来的工具病毒载体，具有宿主范围广，免疫原性强，基因容量大，不与基因组整合，瞬时表达等特点。
具体实施方式
[0037] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
[0038] 除非另有指明，本文所用的技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义，需要注意的是，本文所用的术语仅为了描述具体实施方式，而非意图限制本申请的示例性实施方式。
[0039] 为了更充分理解本发明，以下对本发明中的专业词汇进行解释说明。
[0040] 转基因重组质粒，有目的基因，有质粒，然后用酶使两者相接就是重组质粒。
[0041] shRNA，是英文单词short hairpin RNA的缩写。翻译为“短发夹RNA”。shRNA包括两个短反向重复序列。克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制。随后再连上5‑6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。
[0042] 注射，指的是借助注射器一类的医疗器械将液体或气体注入人体，以达到诊断、治疗、预防疾病的目的。其与吃药不一样。药剂经注射后可迅速到达血液并产生作用。
[0043] 启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游,启动子本身不被转录。但有一些启动子(如tRNA启动子)位于转录起始点的下游,这些DNA序列可以被转录。
[0044] 连接酶，又称合成酶，能催化两个分子连接成一个分子或把一个分子的首尾相连接的酶。此反应与ATP的分解反应相偶联。在把两分子相连接的同时发生三磷酸腺苷(ATP)的高能磷酸键的断裂如DNA连接酶等。
[0045] 泛素连接酶，又称为E3泛素连接酶，是一个能够将泛素分子连接到目的蛋白质的某个赖氨酸上的酶。
[0046] 肿瘤，是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物(newgrowth)，因为这种新生物多呈占位性块状突起，也称赘生物(neoplasm)。
[0047] 以下实施例采用的实验器材包括：
[0048] TRIZOL购于Invitrogen(美国)；蛋白裂解液购于Thermo Fisher(美国)；荧光二抗购于Sigma‑Aldrich(美国)；DAPI染料购于生工公司(中国)；光学显微镜购于OLYMPUS(日本)。
[0049] 实施例1制备shRNA转基因重组质粒
[0050] shRNA转基因重组质粒包括1个目的基因，shRNA：5’‑GCCAGTATTAGACTGGA AGTT‑3’。选用AAV2(RC质粒，广州派真生物技术有限公司)制备AAV，质粒图谱如图1所示。shRNA表达基因插入的位置为U6启动子的末端，且U6启动子的前端和shRNA表达基因的末端连接泛素连接酶E3A。
[0051] 如图2‑3所示，图3中样品酶切结果条带从左至右分别为:Lane1：DL10,000DNA，Marker，Lane2：C‑12978(SmaI)，Lane3：C‑12978(AhdI)，Lane4：C‑12978(NheI+EcoRI)，Lane5：C‑12978。经测序结果比对和酶切电泳图谱比对，均与图谱及模拟图谱一致，证明质粒载体构建检测合格。
[0052] 实施例2shRNA转基因重组质粒在RB PDX动物模型队列上的疗效评价
[0053] 实验方法
[0054] 2.1、本实施例使用经序列传代及组织学稳定性评估后的RB第二代PDX模型(P2)作为本部分实验的实验用鼠，待PDX P2移植瘤生长1周，可肉眼看到白瞳症后，行玻璃体腔注射实施例1制备的shRNA转基因重组质粒(命名为AAV2‑shRNA)进行治疗，对照组进行AAV2‑shCtrl注射治疗；
[0055] 2.2、给药后，每周对小鼠眼部肿瘤形态进行测量和记录，进行相关安全性评估；
[0056] 2.3、待治疗3周后终止实验，颈椎脱臼处理裸鼠，解剖取出瘤体，测量瘤体大小，拍照。解剖所得瘤体留存，并对肿瘤进行HE染色。
[0057] 实验结果
[0058] 相关指标检测将与进行AAV2‑shCtrl治疗的对照组RB PDX模型鼠进行对比，结果如图4所示，4A图RB肿瘤体内注射AAV2‑shRNA后，RB空洞形成显著增多；4B图经AAV‑shRNA基因治疗后RB PDX肿瘤呈现出更多的玫瑰花结结构；4C图眼前节OCT显示AAV2‑shRNA基因治疗后RB PDX有更多的空洞。
[0059] 进一步，分析小鼠眼内肿瘤MYCN的RNA表达水平，结果如图5所示中AAV2‑shRNA的MYCN蛋白的表达水平被显著抑制。因此，分析，本发明的shRNA转基因重组质粒促进肿瘤空洞可能与shRNA转基因重组质粒抑制MYCN表达相关。
[0060] 实施例3空洞型RB预后分析
[0061] 收集2018年至2024年前于申请人医院就诊的视网膜母细胞瘤病人，收集其预后资料并统计分析。
[0062] 结果如图6所示，6A图空洞型RB患者转移风险显著低于非空洞型RB患者；6B图空洞型RB患者总体生存率显著优于非空洞型RB患者。可见，空洞型RB具有更好的预后。
[0063] 申请人声明，在上述说明书的描述过程中：
[0064] 术语“本实施例”、“本发明实施例”、“如……所示”、“进一步的”、“进一步改进的技术分方案”等的描述，意指该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中；在本说明书中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例，而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点等可以在任意一个或者多个实施例或示例中以合适的方式结合或组合；此外，在不产生矛盾的前提下，本领域的普通技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合或组合。
[0065] 最后应说明的是：
[0066] 以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非是对其的限制；
[0067] 尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，本领域技术人员根据本说明书内容所做出的非本质改进和调整或者替换，均属本发明所要求保护的范围。
