[0001] 本发明属于色谱分离技术领域，具体涉及一种用于筛选具有壮骨作用活性物质的细胞膜色谱柱及其应用。

[0002] 骨质疏松症（osteoporosis）是由于多种原因导致的骨密度和骨质量下降，骨微结构破坏，造成骨脆性增加，从而容易发生骨折的全身性骨病。骨量减少和骨质疏松是同一种疾病的不同阶段，两者都会表现出骨质含量减少。骨质疏松的骨质量减少会比较严重,骨量减少是骨质疏松的前一个阶段,也能表明骨质疏松比骨量减少的症状更加严重。我国40～49岁人群低骨量率达到32.9%，低骨量状态和骨质疏松症前期通常没有明显的临床表现，加之基层医疗卫生机构骨质疏松症防治能力不足，以及社会老龄化的加剧，骨质疏松给患者家庭和社会带来沉重的经济负担。因此，快速筛选出壮骨的特效药，确定药物的选择和使用，能减少盲目用药，缩短患者治疗时间。

[0003] 现有技术中由于技术限制，对于快速筛选出壮骨药效物质还存在较大缺点，不能满足实际需要。比如采用斑马鱼模型高效筛选壮骨关节丸中有毒性的药味，可以实现规模H化筛选，但是缺乏针对性。再比如基于核磁共振氢谱（1 NMR）代谢组学结合分子对接技术筛选补肾壮骨汤促睾酮合成的活性成分，确实能够影响效应靶点表达的关键蛋白，应用分子对接技术从活性组分中筛选出与此关键蛋白结合较好的化学成分；但是此方法只能推测出大致的物质结构，并没有专一性。

[0016] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

[0017] 下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

[0018] 实施例1（1）hBMP7目的基因的获取及骨架载体（pCDH）的酶切
用限制性内切酶NheI和BamHI对hBMP7目的基因片段进行双酶切，酶切电泳分析结果示意图如图1所示，酶切条带理论大小为1200 bp，在1296 bp的位置观察到目的基因的片段；目的条带出现，条带清晰，酶切片段与理论值长度一致，提示成功获取目的基因。用限制性内切酶NheI和BamHI对骨架载体（pCDH）进行双酶切，，双酶切电泳分析结果示意图如图2所示，经双酶切后，呈现线性单条带，在8190 bp位置观察到载体片段，表明成功的将其切开。

[0019] （2）双酶切后hBMP7目的基因和骨架载体（pCDH）的连接采用下表120 μL 连接体系，T4连接酶连接扩增hBMP7目的基因和骨架载体
（pCDH），4℃过夜连接，获得携带有hBMP7的表达基因的慢病毒载体（重组载体）；
表1 20 μL 连接体系组成表
。

[0020] （3）携带有hBMP7的表达基因的慢病毒载体的鉴定菌落PCR鉴定结果显示，大部分的克隆连接结果成阳性，之后的测序结果显示序列无碱基的缺失和突变，质粒构建正确。

[0021] （4）携带有hBMP7的表达基因的慢病毒载体转染大鼠BMSCs（骨髓间充质干细胞）：1）细胞培养：大鼠BMSCs使用BASAL（ORIcell公司）培养液于37℃，5%CO2环境下常规培养，血清浓度为10%，青霉素浓度为100U/ml，链霉素为0.1mg/ml，待细胞进入对数生长期时，使用PBS清洗3次，然后用胰酶消化，待细胞变圆之后，重新加入培养液终止消化，反复吹打为单细胞悬液；
4
2）嘌呤霉素的工作浓度筛选：上述单细胞悬液在24孔板内以6 x 10 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验；细胞孵育过夜，准备筛选培养基‑含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（0‑15μg/mL，至少5个梯度）；细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞；每3天更换新鲜的筛选培养基，每日监测细胞观察存活细胞比例；最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1‑4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度；结果表明嘌呤霉素对BMSCs的最佳工作浓度为2ug/ml;
4
将BMSCs以6 x 10 cells/孔的密度接种到24孔板，孵育过夜，移去培养液，将携带有hBMP7的表达基因的慢病毒载体加到孔板中，6小时后补加完全培养基，24小时后更换新鲜的完全培养基，48小时后加入嘌呤霉素工作液（2ug/ml），待细胞长满后，对其进行传代，培养液中持续加入嘌呤霉素，传三代后，荧光显微镜观察，待不发光的细胞全部死光即可，即得转染携带有hBMP7的表达基因的慢病毒载体的大鼠BMSCs，进行扩大培养冻存；其荧光检测示意图如图3所示，结果显示，重组的hBMP7慢病毒成功的插入到BMSC细胞的染色体中。

[0022] （5）RT‑PCR检测转染细胞hBMP7基因水平表达收集BMSCs的hBMP7过表达组和空白对照组细胞总RNA，进行QPCR检测hBMP7的表
达，携带有hBMP7的表达基因的慢病毒载体转染大鼠BMSCs后hBMP7基因水平表达情况示意图如图4所示，结果表明，稳转株细胞中，hBMP7能够稳定的过表达，较空白对照组过表达126倍。

[0023] （6）westernblot检测转染后的hBMP7蛋白水平的表达Western blot法检测三组细胞（过表达组、空载组、正常对照组）中hBMP7的表达情况，携带有hBMP7的表达基因的慢病毒载体转染大鼠BMSCs后hBMP7蛋白的表达示意图如图5所示，其中，总蛋白上样量：20μg；1道：正常空白组；2道：空载组；3道：转染组；由图5可知，3组均可见大小约为55 kD的单一蛋白免疫反应条带，与文献报道的hBMP7蛋白分子大小一致。以43 kD大小β‑actin为内参照，3 组的相对于β‑actin的表达量行灰度分析并统计学分析得出：实验组(1.169±0.013)相对于阴性对照组(0.011±0.004) 和空白对照组(0.010±0.003)高表达BMP7蛋白，差异均有统计学意义(P<0.05)，空载组与空白组相比较差异无统计学意义(P>0.05)。上述结果说明含hBMP7目的基因病毒转染大鼠BMSCs后在BMP7蛋白水平有高表达，对照组的骨髓间充质干细胞BMP7分泌量极低。

[0024] 实施例2用于筛选具有壮骨作用活性物质的细胞膜色谱柱的制备：
（1）如实施例步骤（4），将携带有hBMP7的表达基因的慢病毒载体转染大鼠BMSCs（骨髓间充质干细胞），筛选得到稳定表达hBMP7的细胞株；
（2）培养稳定表达hBMP7的细胞株，得细胞培养液，细细胞培养液中细胞浓度为4×
7
10个/mL；
（3）将步骤（2）中的细胞培养液用PBS洗涤3次，在‑20 ℃反复冻融3次，加PBS进行一次离心（1000r/min离心10min）得到细胞悬浮液，弃去沉淀，上清液进行二次离心（4℃下
10000r/min离心20min），离心后取沉淀与PBS涡旋制备成细胞膜悬液，细胞膜悬液的浓度为
0.5 1.5 mg/mL。
~

[0025] （4）细胞膜悬液填充到C18色谱柱（Water ACQUITY UPLC HSS C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)）中，细胞膜磷脂双层自融合形成固定相，孵育12h，即得用于筛选具有壮骨作用活性物质的细胞膜色谱柱，4℃条件下保存，备用。

[0026] 实施例3利用用于筛选具有壮骨作用活性物质的细胞膜色谱柱（实施例2）从鹿角胶中筛选具有壮骨药效的活性物质。

[0027] （1）鹿角胶样品的制备把鹿角片捣碎后放在圆底烧瓶中，加入5倍量蒸馏水，煎煮；每隔3小时取一次胶汁，加水再煮，共煎煮两次，合并胶汁，过滤残渣，用50℃真空减压浓缩；冷却到室温即为鹿角胶，采用辐射灭菌，4℃保存。取制备好的鹿角胶置高速万能粉碎机，过120目筛得鹿角胶粉末；精密称定鹿角胶粉末50mg，放置25mL容量瓶中，加蒸馏水定容后，用超声提取15min，用蒸馏水补足失重，即得鹿角胶水溶液(2mg/mL)。

[0028] （2）取鹿角胶水溶液(2mg/mL) 5mL，用0.22μm微孔滤膜滤过，缓慢上样至C18色谱柱（2.1mm×100mm，1.8μm），依次用10mL水和10mL乙腈洗脱，收集水洗脱液和乙腈洗脱液，置于锥形瓶中，将洗脱液减压浓缩，分别用水和乙腈定容于5mL容量瓶中，0.22μm微孔滤膜滤过，即得鹿角胶水溶液样品和鹿角胶乙腈溶液样品。

[0029] （3）UPLC‑Q‑ExactiveOrbitrapMS实验条件色谱条件:实施例2中的用于筛选具有壮骨作用活性物质的细胞膜色谱柱，流动相乙腈(A)‑0.1%乙酸水溶液(B)，梯度洗脱(0min，95%B；3min，95%B；9min，50%B；28min，5%B；
28.1min，95%B；31min，0%B)，流速0.3mL·min‑1，进样量40μL，柱温35℃。

[0030] 质谱条件:离子源为加热电喷雾离子源(HESI)，扫描模式为一级质谱全扫描结合自动触发二级质谱扫描模式(FullMS/dd‑MS2)，扫描范围m/z80 1500，一级质谱分辨率~70000，二级质谱分辨率17500，正离子模式毛细管电压3.8kV，负离子模式毛细管电压3kV，毛细管温度和气化温度均为350℃，鞘气和辅助气均为N2，鞘气流速和辅助气流速分别为
45arb和15arb，高压环形离子导入装置电压(S‑LensRFLevel)为55。阶梯碰撞能量20、40、
60eV。

[0031] 实施例4鹿角胶中促成骨化活性成分的筛选和鉴定
1）软件分析
利用Xcalibur4.3(Thermo Fisher Scientific，USA)软件进行谱图分析。

[0032] 2）Maxquant参数设置将Xcalibur产生的RAW原始数据使用Maxquant软件(版本2.4.0.0)搜库。以
Uniprot数据库收录至马鹿和梅花鹿蛋白库Red deer(reviewed，32条序列，2023‑05‑05下载)和Sika deer(reviewed，14条序列，2023‑05‑05下载)为检索数据库，实验参数设置为No Fraction和Label free quantification，其他参数均为默认值。

[0033] 3）Perseus参数设置将Maxquant产生的proteinGroups.txt和peptides.txt数据使用Perseus软件(版本2.0.10.0)处理。过滤污染蛋白(Potential contamiant)和unique peptide>1的蛋白，以期得到独立肽段。

[0034] 4）鹿角胶肽段生物信息学分析通过在线网站PeptideRanker(http://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/)可以预测肽段的生物活性概率。通过在线网站ToxIBTL(https://server.wei‑group.net/ToxIBTL/ProcessServlet)可以预测肽段毒性。利用在线网站Hemopred(http://codes.bio/hemopred/)可以对肽段进行溶血性预测，利用在线网站Algpred2.0(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/algpred/submission.html)可以对肽段进行致敏性预测；
通过在线预测网站(https://pepcalc.com‑Peptide calculator)可以预测鉴定得到的肽段的水溶性；利用Expasy ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam)可以预测肽段的不稳定性指数及pI值，还可以得到肽段的化学分子式。不稳定指数可以初步判断肽段在实验中稳定与否，结果小于40为稳定，结果大于40则可能不稳定。

[0035] 5）药效物质质谱检测：在正负离子模式下，鹿角胶水溶液和乙腈溶液的总正离子流图和总负离子流图分别如图6和图7所示，利用Maxquant鉴定谱图中的肽段，Maxquant鉴定所得肽段具体见表2。

[0036] 表2鹿角胶肽段鉴定信息图使用Perseus去除常见Potential contaminant以及unique peptide>1的肽段后，得到肽段GDTPTLQLEEVDPK，FDR在1%以下，鉴定可信度良好。经Uniprot数据库中已经过人工核验的马鹿和梅花鹿蛋白序列库鉴定该肽段属于蛋白P51745序列的一部分。除此之外，在未经过人工验证的马鹿和梅花鹿蛋白序列库中还发现了另一拥有该肽段的蛋白，其Protein ID为D5KXX5。肽段GDTPTLQLEEVDPK在蛋白P51745和D5KXX5上的序列信息见图8。经PDB蛋白质结构数据库鉴定P51745为白细胞介素‑1β，而D5KXX5未得到鉴定结果。
GDTPTLQLEEVDPK质谱图见图9。

[0037] 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。