[0002] 本发明涉及中药技术领域，尤其涉及一种治疗绝经后骨质疏松症的中药颗粒剂及其制备方法。

[0003] 绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是女性绝经后卵巢合成激素功能下降，引起的代谢性骨病。其特征是全身性骨量减少和骨的微观结构改变，以致骨脆性增高，极易于发生骨折。骨质疏松症已成为严峻的公共健康问题，其发病率一直居高不下。骨质疏松症骨折是最常见的并发症，好发于前臂腕部、锥体和髋部骨折，其中以髋部骨折最为严重。髋部骨折患者行动不便，在1年内有12％～40％可能死于各种并发症，严重影响患者生存质量，巨额的医疗支出和护理成本，加重患者经济负担。在绝经期早期，单纯使用抗骨吸收药物能够达到骨保护的目的，但在绝经期晚期，需要同时使用促骨合成药物长期治疗才能部分缓解骨丢失。

[0004] 绝经后骨质疏松症的诊疗指南推荐的治疗方案主要包括运动疗法、物理治疗和药物治疗。药物疗法主要有抑制骨吸收的药物如：雌激素、降钙素、双腾酸盐类等；以及促进骨形成的药物如：氟化物、生长激素、维生素K等。中医中药治疗绝经后骨质疏松症的研究争相被报道，从临床经验出发，总结出有效的治疗方药，是目前中医药治疗骨质疏松症的重要途径。临床上对于绝经后骨质疏松症常见治法治则包括补肝肾，强筋骨，概以补肾阴肾阳为主，往往忽略了因虚致实引发的肾浊停留不袪。

[0005] 基于此，提出本发明。

[0042] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0043] 实施例1

[0044] 一种治疗绝经后骨质疏松症的中药颗粒剂—贞荣颗粒的制备方法，包括以下步骤：

[0045] 将25g的女贞子、10g的巴戟天、10g的骨碎补、5g的泽泻置于圆底烧瓶中，以质量比为1：9加入体积分数为30％的乙醇溶液在**℃下回流提取0.5h后，将提取液在0.1MPa、60℃下浓缩至相对密度为1.25g/mL，得到中药，将中药与糊精以1：0.8的质量比混匀制成软材，用10目筛搓颗粒，在在0.1MPa、45℃下干燥35h，过9目筛，制得中药颗粒剂—贞荣颗粒。

[0046] 实施例2

[0047] 一种治疗绝经后骨质疏松症的中药颗粒剂—贞荣颗粒的制备方法，包括以下步骤：

[0048] 将35g的女贞子、20g的巴戟天、20g的骨碎补、15g的泽泻置于圆底烧瓶中，以质量比为1：11加入体积分数为70％的乙醇溶液在**℃下回流提取3次，每次1.5h，提取完成后将提取液在0.2MPa、70℃下浓缩至相对密度为1.30g/mL，得到中药，将中药与糊精以1：1.1的质量比混匀制成软材，用14目筛搓颗粒，在0.2MPa、55℃下干燥37h，过12目筛，制得中药颗粒剂—贞荣颗粒。

[0049] 实施例3

[0050] 一种治疗绝经后骨质疏松症的中药颗粒剂—贞荣颗粒的制备方法，包括以下步骤：

[0051] 将30g的女贞子、15g的巴戟天、15g的骨碎补、10g的泽泻置于圆底烧瓶中，以质量比为1：10加入体积分数为50％的乙醇溶液在**℃下回流提取2次，每次1h，提取完成后将提取液在0.1MPa、65℃下浓缩至相对密度为1.28g/mL，得到中药，将中药与糊精以1：1的质量比混匀制成软材，用12目筛搓颗粒，在0.1MPa、50℃下干燥36h，过10目筛，制得中药颗粒剂—贞荣颗粒。

[0052] 实验例1

[0053] 1、含药血清的制备

[0054] 取实施例3得到的中药颗粒200g，加入体积分数为50％的乙醇1.5L回流提取2次(提取2次的时间为1h)，合并两次得到的滤液浓缩制得相对密度为0.9g/mL的灌胃液—贞荣汤(按照临床剂量折算成大鼠灌胃给药剂量每天2.2g/(kg·d))。

[0055] 取6周龄雄性SD大鼠10只，以2.2g/kg剂量灌胃贞荣汤，连续给药7d，在第7d末次给药后15min后取材。异氟烷麻醉机麻醉后，取腹主动脉血，至无添加剂采血管中，采血量5mL，于常温静置1h离心(4℃3000rpm，10min)，移取上层含药血清装入冻存管，放入‑80℃超低温冰箱备用。另取10只大鼠，按照上述贞荣汤给药方案进行空白生理盐水灌胃，分离得空白血清，‑80℃存放备用。

[0056] 血清样品制备：将‑80℃冻存的含药血清2mL精确吸入离心管，加10mL的甲醇，斡旋2min，在10000r/min，离心10min，取出上清，在室温用N2吹干，残渣用500μL、体积分数为
50％的乙醇进行超声波(500w超声5min)复溶后，置于高速离心机10000r/min，离心10min，取出上清，即为贞荣汤含药血清供试品。用同样方法处理空白血清制备空白血清供试品。

[0057] 5％含药血清：取50μL含药血清供试品加入250μL甲醇进行醇沉，离心取上清，氮气吹干，分别用1mL的α‑MEM培养基或1mL的DMEM培养基复溶；

[0058] 10％含药血清：取100μL含药血清供试品加入250μL甲醇进行醇沉，离心取上清，氮气吹干，分别用1mL的α‑MEM培养基或1mL的DMEM培养基复溶；

[0059] 20％含药血清：取200μL含药血清供试品加入250μL甲醇进行醇沉，离心取上清，氮气吹干，分别用1mL的α‑MEM培养基或1mL的DMEM培养基复溶。

[0060] 其中利用1mL的α‑MEM培养基复溶的含药血清用于原代成骨细胞，利用1mL的DMEM培养基复溶的含药血清用于RAW264.7细胞

[0061] 2、原代成骨细胞试验

[0062] 2.1、原代成骨细胞培养及鉴定

[0063] 选择出生72h的SD乳鼠，提取颅骨成骨细胞。快速脱颈处死后，用75％乙醇消毒，移入生物安全柜内，剪断颈部，分离头盖骨，浸泡在浓度为7.4M的PBS里面，剪刀镊子在酒精灯上灼烧，冷却30s后将头盖骨表面的组织清除干净；转置新的含有PBS的培养皿中，将头盖骨尽量剪碎，弃去PBS加入6mL、体积分数为0.25％的胰酶，37℃培养箱消化10min后，移液枪吹打，弃去胰酶，加入6mL 0.2％Ⅰ型胶原酶，再次放入37℃培养箱消化60min，中间每隔10min吹打混匀一次，60min后，将胶原酶液收集到离心管中，12000rpm离心3min。离心后能看到沉淀。弃去上清，用α‑MEM(购自Gibco公司货号41061037、已加10％FBS+1％青链霉素)重悬，放入37℃培养箱培养12h后，如图1中A所示，可看到细胞贴壁为梭形，锥形和多边形。继续培养12h，可见少数贴壁细胞，然后换液，PBS清洗后加入α‑MEM继续在37℃下培养至第三天，如图
1中B所示，细胞数目增多，逐渐汇合；培养至第五天，如图1中C所示，细胞逐渐形成“铺路石”样生长趋势，细胞汇合率达90％以上，可以进行细胞传代；传至第三代的时候，如图1中D所示，取该状态下的细胞进行细胞进行茜素红染色，如图1中E所示，经茜素红染色的细胞，可见结节；将细胞培养至第10天时，再次染色，如图1中F所示，细胞出现明显的钙化结节。

[0064] 2.2、CCK8测定各组含药血清干预浓度

[0065] 通过CCK8试剂盒检测贞荣汤对颅骨源性成骨细胞活性的影响，在2.1培养的颅骨2
源性成骨细胞(传代第三次的贴壁细胞)培养瓶(康宁corning T25cm)中分别加入5ml按照第1部分制备得到的空白血清供试品(0％)、5％、10％、20％浓度的含药血清，于诱导分化培养基(购自于海星生物)中，在37℃、5％CO2下培养96h。结果如图2所示，发现5％、10％在不同时间点(24h、48h、72h、96h)对细胞无明显毒性，在此前提下，选择5％、10％进行后续的成骨细胞刺激的诱导实验。

[0066] 2.3、ALP法检测成骨细胞培养基上清中碱性磷酸酶的含量

[0067] 将原代成骨细胞接种于24孔板中，待细胞汇合度达80％，加入无血清培养基饥饿12h，弃去培养基，分别加入生理盐水空白血清、5％、10％含药血清(第1部分制备得到)，继续培养72h，收集细胞上清培养液，1300r/min，离心10min，取上清测定碱性磷酸酶的含量。
(按照ALP试剂盒(A059‑2，购自南京建成生物工程研究所)配置对应的试剂，再经公式ALP(金氏单位/100mL)＝(测定样品OD/标准品OD)×标准品含酚的量×(100mL/0.05mL)换算得到ALP含量(重复5孔))。结果如表1所示，在培养72h后，5％贞荣汤含药血清碱性磷酸酶含量开始高于生理盐水空白血清组，10％贞荣汤含药血清ALP含量更为显著(P<0.05)。说明本发明的贞荣汤可促进成骨细胞的碱性磷酸酶表达。

[0068] 表1贞荣汤对成骨细胞ALP活性的影响(n＝6， )

[0069]组别 ALP含量(mg/mL)
生理盐水空白血清 0.027±0.0093
贞荣汤含药血清(5％) 0.1213±0.02*
贞荣汤含药血清(10％) 0.1507±0.06*

[0070] 2.4、贞荣汤含药血清促进成骨细胞的成熟和分化

[0071] 图1中F成骨分化晚期出现了矿物质沉积(钙结节)，为检测钙结节形成情况，在2.2部分的成骨诱导后，对空白血清组(control)、5％(ZRD‑5)、10％(ZRD‑10)、含药血清组的细胞进行21d的培养，培养期间3d换液一次，共七次，培养结束后进行茜素红染色并进行半定量分析。结果如图3所示，贞荣汤含药血清促进成骨细胞钙结节的形成，5％贞荣汤含药血清开始高于生理盐水空白血清组，10％贞荣汤含药血清钙化结节更为显著(P<0.05)。这与2.3部分的ALP法检测的结果一致(碱性磷酸酶的增加和钙化结节的产生均说明了该药物具有促进成骨生成的能力)，贞荣汤同样能够增加钙化结节。

[0072] 2.5、qPCR检测骨形成相关因子RUNX2、Osterix、ALP、OPG/RANKL mRNA表达结果[0073] 按照2.2的结果，在5％、10％的含药血清干预成骨细胞72h后，采用qPCR检测control、ZRD‑5、ZRD‑10组骨形成相关因子RUNX2、Osterix、ALP、OPG/RANKL mRNA表达，结果如图4所示，与生理盐水空白血清(control)相比，ZRD‑5、ZRD‑10组中与成骨细胞形成相关的RUNX2、Osterix、ALP、OPG/RANKLmRNA表达量升高，推测贞荣汤含药血清是通过调节以上因子发挥对成骨细胞的增殖作用。

[0074] 2.6、Western Blot检测骨形成相关因子RUNX2、Osterix、ALP、OPG、RANKL蛋白表达结果

[0075] (1)按照2.2的结果，将成骨细胞种植于6孔板后(1×105个)，以0、5％和10％含药血清进行细胞培养，每孔2ml，在干预给药72h后，弃去α‑MEM培养基(含有10％FBS+1％PS)，每孔细胞加300μL RIPA裂解液+10μLPMSF，冰上裂解细胞，14000rpm，4℃，离心30min，提取蛋白，测定蛋白浓度后进行后续实验。

[0076] (2)SDS‑PAGE胶的配置及上样：在通风橱内将所需浓度的分离胶和浓缩胶分别配置，将分离胶缓慢加入厚度1.0的干净玻璃板间，无水乙醇压平分离胶分界面，待分离胶凝固完全后，弃无水乙醇，吸干，缓慢加入5％堆积胶，轻柔快速的将加样梳插入上层胶内，保持静置，不要挪动，待胶凝固。将胶板固定于电泳夹，加入电泳缓冲液，垂直取出加样梳，观察加样孔情况，在一端加蛋白预染Marker 3μL，以20μg蛋白量上样。

[0077] (3)电泳：75V电压电泳30min，使样本整齐电泳入浓缩胶内，140V电压电泳40min后，注意观察目的蛋白清晰分离后停止电泳。

[0078] (4)转膜：电泳即将结束后，取出4℃保存的转膜液倒至搪瓷方盘中，取下玻璃胶板，靠近玻璃胶板一侧，用胶铲小心撬起短玻璃板，截取目的蛋白所在的胶的位置，弃去其余部分，裁取略大于胶面积的0.22um PVDF膜，置于甲醇中活化30s后置于转膜液中，全程保持湿润。取三明治转膜夹，将滤纸在转膜液里面浸透后，按照白色夹板－海绵垫－滤纸－膜－胶－滤纸－海绵垫－黑色夹板顺序对齐放置好，特别确保胶和膜之间无气泡，用滚轮赶出气泡，即可合上转膜夹。将转膜夹按照正负极方向插入转膜槽内，加入预冷转膜液，为防止产热量过大，转膜槽外放上冰块以达到快速降温的目的，设定电压100V，时间为30min，可按照分子量大小调整。

[0079] (5)封闭：转膜完毕后，取出PVDF膜，置于封闭液孵育盒内，摇床上(转速50转/分钟)封闭2h。

[0080] (6)一抗二抗免疫反应：封闭结束后，加入稀释后的一抗。4℃摇床(转速60转/分钟)过夜，次日回收一抗，将PVDF膜摇床上(转速90转/分钟)TBST摇洗4次X5 min，根据一抗种属来源按1：10000加入相对应的二抗。室温摇床(转速60转/分钟)孵育90min，去除二抗后摇床上(转速90转/分钟)TBST摇洗10min/次，3次。

[0081] 其中，一抗和二抗的相关信息如表2和表3所示：

[0082] 表2一抗的相关信息

[0083] 一抗 产品编号 生产商ALP抗体 sc‑271431 Santacruz
Osterix抗体 sc‑393325 Santacruz
RANKL抗体 sc‑377079 Santacruz
RUNX2抗体 12556S CST
OPG抗体 sc‑390518 Santacruz
NFATc1抗体 A00340‑1 Boster
TRAF6抗体 ab137452 abcam
MMP9抗体 10375‑2‑AP proteintech
c‑FOS抗体 66590‑1‑Ig proteintech
GAPDH抗体 60004‑1‑Ig proteintech

[0084] 表3二抗的相关信息

[0085]二抗 产品编号 生产商
鼠二抗(驴抗鼠) SA00001‑8 proteintech
兔二抗(驴抗兔) SA00001‑9 proteintech

[0086] (7)化学发光成像：化学发光成像仪预先预热，打开imagelab 6.0软件，1:1将显影液A、B液混合均匀，PVDF膜放置在显影盒内，均匀滴加显影液，使显影液完整覆盖膜表面，赶走表面气泡，关闭暗门，软件设置曝光时间，运行仪器进行成像，分析实验结果。

[0087] 利用Western Blot法检测各组之间成骨形成相关蛋白的变化。结果如图5所示，与Control(CON)组相比，贞荣汤含药血清组Osterix、RUNX2、ALP蛋白表达量明显增加，且OPG/RANKL比值也升高(图5中E)。

[0088] 3、贞荣汤含药血清抑制RANKL诱导的破骨细胞的分化

[0089] 3.1骨髓单核巨噬细胞的培养

[0090] RAW264.7细胞(RAW264.7细胞购买自武汉生物公司，货号：CL‑0190)体积较小，类圆形，轻轻落于瓶底，在细胞培养过程中，不需要使用胰酶消化，动作轻柔，切忌暴力吹打，6 2
将其以1×10的浓度接种于25cm培养瓶内，加入10％FBSDMEM培养液5mL，在37℃下培养1d。
注意每日观察培养基颜色及细胞生长状态，及时换液，防止分化。

[0091] 3.2、确定各组含药血清干预RAW264.7细胞的浓度及TRAP染色结果RAW264.7是破骨细胞前体，细胞体积较小，圆形或不规则形，可有伪足，核小而圆，绝大多数为单核，偶有2～3个核。

[0092] RAW264.7细胞加入50ng/mL RANKL诱导第一天，如图6中A所示，细胞开始变大，伪足较多，核变大，呈椭圆形；经RANKL诱导3天后，如图6中B所示，细胞开始融合成3个核以上的大细胞；经RANKL诱导5天后，如图6中C所示，出现许多多核巨细胞，细胞大小几十到几百微米不等，呈不规则形，经RANKL诱导第6天，如图6中D所示，在细胞中心清晰可见多核细胞，空腔逐渐增大，有大量伪足，可达几十个细胞核。RANKL诱导第7天，如图6中E所示，随着细胞不断融合，多核巨细胞内空腔随之增大，边界更为明显；RANKL诱导第7天时对细胞进行TRAP染色，如图6中F所示，染色为阳性，表明已成功分化出成骨细胞，细胞呈酒红色或紫红色，以核周和胞膜下染色较深。

[0093] 在含RANKL培养基加入不同浓度(5％、10％、20％)的贞荣汤含药血清，进行RAW264.7细胞诱导，分别在诱导的第24h、48h、72h、96h使用CCK‑8测定细胞活性，结果如图7所示。从图7中可以看出，当贞荣汤含药血清浓度为5％、10％时RAW264.7细胞活性与只含RANKL培养基时的细胞活性相当，当浓度达到20％时抑制了RAW264.7细胞的活性，故此选用5％和10％浓度进行实验。

[0094] 3.3、贞荣汤含药血清抑制骨吸收相关标记因子的基因表达

[0095] 对3.2部分贞荣汤处理72h的细胞利用qPCR检测破骨细胞吸收相关因子的c‑fos、NFATc1、CTSK、Trap、Integrinαvβ3和MMP‑9表达结果，结果如图8所示，与对照组(control)相比，5％、10％的贞荣汤含药血清均可有效降低c‑fos、NFATc1、CTSK、Trap、Integrinαvβ3和MMP‑9的基因表达水平，抑制骨吸收。

[0096] 3.4、贞荣汤含药血清抑制破骨细胞骨吸收相关标记因子的蛋白表达

[0097] NFATc1和c‑fos是前体破骨细胞融合与通过转录调控许多前体破骨细胞相关基因的表达形成所必需的两种转录因子。

[0098] 检测3.2部分贞荣汤处理72h的细胞中相关基因TRAF6、MMP‑9、c‑fos和NFATc1的蛋白表达情况，结果如图9所示，RANKL(50ng/mL)诱导下，贞荣汤含药血清干预72h后降低TRAF6的表达，同时降低了NFATc1和c‑Fos的蛋白表达水平。检测3.2部分贞荣汤处理72h的细胞中PI3K和AKT的磷酸化水平，结果如图10所示，观察到贞荣汤含药血清给药后，P‑PI3K和P‑AKT的磷酸化水平有所降低，表明贞荣汤含药血清通过抑制RANKL/RANK信号通路的激活，可能影响到下游PI3K/AKT的活化，抑制破骨细胞的分化。

[0099] 4、贞荣汤对去卵巢大鼠干预作用

[0100] 4.1、建立雌性SD大鼠PMOP模型及动物分组

[0101] 90只SPF级SD雌性大鼠，三月龄，动物适应喂养(正常饮食饮水)7天，分SHAM(假手术组)组18只，OVX(模型组)组72只，OVX组摘除双侧卵巢，假手术组仅去除卵巢周围脂肪，术后连续3天给予青霉素8UI/只，常规抗感染，无大鼠死亡情况。动物分组：假手术组(SHAM)(生理盐水)(1mL/100g)18只，模型组(OVX)(生理盐水)(1mL/100g)18只，阳性对照组(OVX‑EV)(0.1mg/(kg·d))18只，贞荣汤低剂量组(OVX‑ZRDL)(2.2g/(kg·d))18只，贞荣汤高剂量组(OVX‑ZRDH)(4.4g/(kg·d)18只，给药体积1mL/100g。给药12周，进行骨组织形态、骨强度等指标的观察。阳性对照组给予戊酸雌二醇片(EstradiolValerate Tablets,EV)1mg/片，产品批号：558A。

[0102] 4.2、骨组织形态观察

[0103] 取4.1中给药12周的各组大鼠的胫骨样本进行Masson染色，如图11所示，同时对大鼠胫骨Masson染色骨小梁相对面积比进行统计，结果如表4。从图11和表4可知，SHAM组12周时骨小梁排列紧密，分布均匀，呈网状连接，间隙小，连续无断裂；OVX组在卵巢去除12周后出现骨小梁减少，分布散乱无规则，骨小梁断裂增多，骨小梁之间宽度增加；与OVX组相比，OVX‑ZRDH组骨小梁形态和结构完整性好，数量多，间隙小，断裂少(P＜0.01)，OVX‑ZRDL组，疗效较OVX‑ZRDH稍差，但与OVX组相比，有明显改善骨小梁稀疏情况，均有明显差异(P＜0.05)。

[0104] 表4大鼠胫骨Masson染色骨小梁相对面积比统计结果( n＝6)

[0105]

[0106] 注：a：与OVX相比，*P＜0.05，**P＜0.01；b：与SHAM组相比，##P＜0.01。

[0107] 4.3、microCT扫描测量大鼠胫骨干骺端骨密度结果

[0108] 通过micro‑CT三维重建图像观察4.2中胫骨微观结构的变化并分析得到微观参数的变化，如图12、13所示，发现OVX模型组胫骨小梁结构发现改变，而OVX‑ZRDH和OVX‑ZRDL，都减少了因OVX引起的结构改变。

[0109] 图13中骨密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)显著升高。

[0110] 4.4、大鼠骨强度测量结果

[0111] 测定各组胫骨最大载荷量，如表5及图15所示，去卵巢大鼠12周后，胫骨最大载荷下降，SHAM组与OVX无明显差异，贞荣汤给药组(OVX‑ZRDL、OVX‑ZRDH)与SHAM组和OVX组相比，胫骨最大载荷升高明显。

[0112] 表5胫骨最大载荷(单位：Kn)(n＝6， )

[0113]

[0114] 注：a：与OVX相比，*P＜0.05；b：与SHAM组相比，#P＜0.05。

[0115] 4.5、各组大鼠血清代谢标志物的变化

[0116] 测定各组血清骨代谢生化指标的含量可以从反映出骨稳态的情况，其中包括与骨形成相关的骨特异性碱性磷酸酶BALP；与骨吸收相关的抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP5b、CTK、β‑CTX；IL‑6、IL‑1β、TNF‑α；以及雌激素E2。

[0117] 结果如表6及图15所示，在卵巢切除术后(OVX)，骨碱性磷酸酶(BALP)浓度出现明显下降(P<0.01)，显著升高了抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP5b)浓度(P<0.01)，说明去势大鼠随着雌激素水平的下降，对破骨细胞活性的抑制减轻，骨吸收大于骨形成，骨稳态失衡。贞荣汤给药后，能升高血清中骨磷酸酶的含量(P<0.01)，减低血清抗酒石酸酸性磷酸酶5b的含量(P<0.01)，维持骨稳态平衡。CTK、β‑CTX是破骨细胞成熟发挥功能的相关因子，在贞荣汤给药后CTK，β‑CTX水平降低(P<0.01)，贞荣汤抑制破骨细胞成熟，减少骨吸收。此外，贞荣汤能够降低血清中炎症因子TNFα、IL‑6、LI‑1β含量。

[0118] 表6贞荣汤对去卵巢大鼠血液生化指标的影响(n＝6， )

[0119]   SHAM OVX OVX‑EV OVX‑ZRDL OVX‑ZRDH##
BALP(ng/mL) 2.50±0.22 1.60±0.20 2.30±0.21* 2.0±0.12 2.20±0.13*
TRAP5b(U/L) 5.10±0.32 8.59±0.57## 5.11±0.10** 7.32±0.25* 5.27±0.17**
CTK(pg/mL) 2.03±0.32 3.76±0.15## 2.15±0.20** 3.15±0.11** 2.2±0.13**
β‑CTX(ng/mL) 12.13±101 28.59±1.57## 13.15±0.99** 22.29±0.96* 15.37±1.52**TNF‑α(pg/mL) 9.57±1.21 18.46±2.05## 10.98±1.03** 15.05±0.66* 10.47±1.08**IL‑6(pg/mL) 39.9±3.22 77.80±4.00## 45.65±5.51** 60.87±3.56* 51.14±2.44**IL‑1β(pg/mL) 73.23±4.90 98.80±6.39## 74.98±3.54** 91.72±2.43* 81.14±2.2**[0120] 注：a：与OVX相比，*P＜0.05，**P＜0.01；b：与SHAM组相比，##P＜0.01。

[0121] 4.6、qPCR检测大鼠股骨中成骨细胞形成相关因子Runx2、RANKL、OPG表达[0122] 取各组大鼠股骨组织检测成骨形成相关因子基因表达情况，如图16所示，与SHAM组相比，OVX组RANKL的mRNA水平显著升高，OPG和Runx2的mRNA表达明显受到抑制，贞荣汤给药后，Runx2和OPG mRNA表达量升高，与OVE‑EV组一致。不影响RANKLmRNA的表达。说明贞荣汤可能上调OPG蛋白表达，提高OPG/RANKL的比值，发挥骨保护的作用。

[0123] 4.7、WesternBlot检测大鼠股骨中骨形成相关因子OPG、RANKL、RUNX2表达[0124] 取大鼠股骨检测成骨形成相关蛋白表达，如图17所示，与SHAM组相比，OVX组中RANKL蛋白表达量增多(P＜0.05)，OPG和RUNX2蛋白表达减少(P＜0.01)，OVE‑EV组和贞荣汤给药12周后，低剂量组开始升高OPG和RUNX2蛋白的表达(P＜0.05)，高剂量组升高OPG蛋白的表达更为显著(P＜0.01)。不影响RANKL蛋白的表达。说明贞荣汤可上调OPG蛋白/RANKL蛋白的比值发挥骨保护的作用。

[0125] 4.8、qPCR检测大鼠股骨中破骨细胞形成和分化相关因子NFATc1、c‑Fos表达量[0126] 在去卵巢大鼠中，因雌激素水平的急剧下降，其对破骨吸收的抑制减弱，破骨细胞开始活跃，采用qPCR检测大鼠股骨中破骨细胞形成和分化相关因子NFATc1、c‑Fos表达量，结果如图18所示，观察到OVX组c‑fos、NFATc1二者的转录水平明显升高(P＜0.01)。在贞荣汤组和OVX‑EV组，c‑Fos、NFATc1 mRNA的表达明显下降。说明贞荣汤能抑制骨吸收相关因子的表达。

[0127] 4.9、WesternBlot检测大鼠股骨破骨细胞分化相关因子TRAF6、c‑FOS、NFATc1表达[0128] 在4.8的基础上，观察到破骨分化RANKL/RANK相关通路蛋白的变化。如图19所示，OVX组因雌激素水平下降导致破骨细胞活跃，TRAF6、c‑fos、NFATc1蛋白表达增加，OVX‑EV组和贞荣汤干预后显著下降。表明贞荣汤能抑制骨吸收相关蛋白表达。

[0129] 由实验例1可知，本发明的贞荣汤可促进成骨细胞的碱性磷酸酶表达，增加钙化结节，升高成骨相关细胞因子RUNX2、ALP、Osterix基因表达和蛋白表达水平，在分子和蛋白水平均能升高OPG/RANKL比值。贞荣汤给药后发现破骨细胞相关的转录因子减少，抑制了RANKL诱导的NFATc1和c‑Fos的激活作用，贞荣汤干预后PI3K/Akt磷酸化水平有所下降低。贞荣汤治疗能够改善OVX大鼠的骨量流失和骨微结构紊乱，进而延缓绝经后骨质疏松症的疾病进程。进一步机制研究发现，贞荣汤可能上调OPG蛋白表达，提高OPG/RANKL的比值，发挥骨保护的作用，下调RANKL/RANK信号通路下游骨吸收相关因子的表达，参与调节骨代谢平衡，达到防治PMOP疗效。

[0130] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。