[0001] 本申请涉及油脂技术领域，更具体地说，它涉及一种1，3‑二油酸‑2‑棕榈酸甘油三酯的制备方法及其应用。

[0002] 随着现代食品工业的快速发展，人们对食品营养和健康的要求越来越高。1,3‑二油酸‑2‑棕榈酸甘油三酯(OPO)作为一种公认的营养强化剂，因其在母婴领域的显著健康益处而受到广泛关注。OPO能够模拟母乳中的脂肪酸结构，提高脂肪酸和钙的吸收效率，减少营养流失，并具有改善婴幼儿便秘和促进骨骼发育等功效。

[0003] 然而，OPO的应用并不局限于母婴领域。近年来，研究人员开始探索OPO在其他食品领域的应用潜力，尤其是作为强化剂在植物油中的应用。花生油作为一种广泛使用的食用油，以其独特的风味和营养价值受到消费者的青睐。但是，花生油在储存和使用过程中存在易受氧化，影响油品的稳定性和安全性，难于储存的问题，容易发生分层和沉淀。

[0004] 针对上述中的相关技术，发明人发现，传统的OPO制备方法中，为了提高反应速率，常常需要在较高温度下进行，这往往以牺牲脂肪酶的稳定性和活性为代价，不利于脂肪酶活性的发挥。此外，高温还可能导致副反应的产生，影响最终产品的品质。因此，如何在保证OPO产率和质量的同时，减少高温对脂肪酶活性的不利影响，是当前OPO的制备工艺中亟待解决的问题。

[0028] 以下实施例对本申请作进一步详细说明。

[0029] 原料本申请中制备例、实施例和对比例所用原料除特殊说明外，均为市售产品，具体为：
实施例中的反应脂肪酶与制备例中的脂肪酶粉相同，均选自诺维信，
Sustine110IM，固体脂肪酶粉；
大孔树脂，选自天津允开树脂科技有限公司，D101大孔吸附树脂；
棕榈硬脂，滑动熔点为58℃，选自南京新实力食品科技有限公司；
油酸，为90％油酸，选自武汉欧米嘉生物医药有限公司；
甲酸钠为食用甲酸钠，选自国药集团化学试剂有限公司；
柠檬酸、磷酸均为食品级；
葵花籽油，选自欧利亚提，一级葵花籽油；
橄榄油，选自维多利亚橄榄油；
花生油，选自金龙鱼花生油；
乙醇为95％乙醇；
蔗糖脂肪酸酯，选自深圳市星凯越生物科技有限公司，SE‑11；
单甘油脂肪酸酯，选自西安浩天生物工程有限公司；
卵磷脂，选自东莞市鼎圣生物科技有限公司，大豆卵磷脂。

[0030] 固定化脂肪酶制备例制备例1
固定化脂肪酶，其制备方法包括以下步骤：
S1：将脂肪酶粉分散在甘氨酸‑氢氧化钠缓冲液中形成反应液，调节反应液的pH为
8，静置2h后离心，取上清液为原酶液；
S2：将大孔吸附树脂在95％乙醇溶液中浸泡5h，水洗抽滤得到预处理大孔吸附树脂，后将原酶液加入至预处理大孔树脂中，所述原酶液与所述预处理大孔树脂的质量比为
5:1，在30℃的水浴摇床中振荡，抽滤除去原酶液、洗涤、冻干即得。

[0031] 制备例2固定化脂肪酶，其制备方法包括以下步骤：
S1：将脂肪酶粉分散在甘氨酸‑氢氧化钠缓冲液中形成反应液，调节反应液的pH为
10，静置1h后离心，取上清液为原酶液；
S2：将大孔吸附树脂在乙醇溶液中浸泡4h，水洗抽滤得到预处理大孔吸附树脂，后将原酶液加入至预处理大孔树脂中，所述原酶液与所述预处理大孔树脂的质量比为6:1，在
35℃的水浴摇床中振荡，抽滤除去原酶液，抽滤、洗涤、冻干即得。
实施例

[0032] 实施例11，3‑二油酸‑2‑棕榈酸甘油三酯的制备方法，包括以下步骤：
S1：将质量比为1:5的棕榈硬脂和高油酸葵花籽油混合，在100℃真空干燥1h后加入甲醇钠，反应70min，得到中间产物A，甲醇钠的质量为棕榈硬脂和高油酸油脂总重的
0.5％；
S2：向中间产物A中添加柠檬酸或磷酸，反应30min后在110℃下真空干燥2h，得到中间产物B，柠檬酸的添加量为2％；
S3：按照质量比为1:2，将中间产物B与油酸混合，在50℃水浴加热的环境下搅拌均匀，加入反应脂肪酶，通入CO2在超临界的条件下进行酶法酸解5h，得到中间产物C，所述反应催化酶的质量为所述中间产物B的3％；
S4：按照质量比为1:7，将中间产物C与正己烷混合，调节pH至7，萃取后洗涤、蒸发即得。

[0033] 实施例21，3‑二油酸‑2‑棕榈酸甘油三酯的制备方法，包括以下步骤：
S1：将质量比为1:6的棕榈硬脂和高油酸花生油混合，在110℃真空干燥1.5h后加入甲醇钠，反应70min，得到中间产物A，所述甲醇钠的质量为棕榈硬脂和高油酸油脂总重的
0.1％；
S2：向中间产物A中添加柠檬酸或磷酸，反应20min后在100℃下真空干燥2.5h，得到中间产物B，柠檬酸或磷酸的添加量为4％；
S3：按照质量比为1:1.5，将中间产物B与油酸混合，在45℃水浴加热的环境下搅拌均匀，加入反应脂肪酶，通入CO2在超临界的条件下进行酶法酸解7h，得到中间产物C，所述反应催化酶的质量为所述中间产物B的2％；
S4：按照质量比为1:9，将中间产物C与正己烷混合，调节pH至7，萃取后洗涤、蒸发即得。

[0034] 实施例31，3‑二油酸‑2‑棕榈酸甘油三酯的制备方法，包括以下步骤：
S1：将质量比为1:6的棕榈硬脂和高油酸橄榄油混合，在110℃真空干燥1.5h后加入甲醇钠，反应70min，得到中间产物A，所述甲醇钠的质量为棕榈硬脂和高油酸油脂总重的
1％；
S2：向中间产物A中添加柠檬酸或磷酸，反应20min后在110℃下真空干燥2h，得到中间产物B，柠檬酸的添加量为1‑4％；
S3：按照质量比为1:2.5，将中间产物B与油酸混合，在50℃水浴加热的环境下搅拌均匀，加入反应脂肪酶，通入CO2在超临界的条件下进行酶法酸解6h，得到中间产物C，所述反应催化酶的质量为所述中间产物B的2.5％；
S4：按照质量比为1:8，将中间产物C与正己烷混合，调节pH至6，萃取后洗涤、蒸发即得。

[0035] 实施例41，3‑二油酸‑2‑棕榈酸甘油三酯的制备方法，与实施例1的区别在于，反应脂肪酶为固定化脂肪酶，由制备例1制得，其他步骤均与实施例1相同。

[0036] 实施例51，3‑二油酸‑2‑棕榈酸甘油三酯的制备方法，与实施例1的区别在于，反应脂肪酶为固定化脂肪酶，由制备例2制得，其他步骤均与实施例1相同。

[0037] 对比例对比例1
1，3‑二油酸‑2‑棕榈酸甘油三酯的制备方法，包括以下步骤：
S1：将质量比为1:6的棕榈硬脂与油酸混合，后置于间歇式夹层酶反应釜中，搅拌转速设置为290r/min，温度为65℃，待反应底物完全熔化，加入10％反应脂肪酶，在60℃下反应12h，得到中间产物；
S2：将中间产物按照质量比为1:7与正己烷混合，调节pH为7，萃取、洗涤、蒸发即得。

[0038] 对比例21，3‑二油酸‑2‑棕榈酸甘油三酯的制备方法，包括以下步骤：
S1：将质量比为1:5的棕榈硬脂和高油酸葵花籽油混合，在100℃真空干燥1h后加入甲醇钠，反应70min，得到中间产物A，甲醇钠的质量为棕榈硬脂和高油酸油脂总重的
0.5％；
S2：向中间产物A中添加柠檬酸或磷酸，反应30min后在110℃下真空干燥2h，得到中间产物B，柠檬酸的添加量为2％；
S3：按照质量比为1:2，将中间产物B与油酸混合，在50℃水浴加热的环境下搅拌均匀，加入反应脂肪酶进行酶法酸解5h，得到中间产物C，所述反应催化酶的质量为所述中间产物B的3％；
S4：按照质量比为1:7，将中间产物C与正己烷混合，调节pH至7，萃取后洗涤、蒸发即得。

[0039] 应用例本申请的一种1，3‑二油酸‑2‑棕榈酸甘油三酯的制备方法所制备的1，3‑二油酸‑
2‑棕榈酸甘油三酯，应用于制备食用油，如花生油、大豆油、菜籽油、葵花籽油、玉米油、橄榄油、椰子油和芝麻油等。此处以本申请的1，3‑二油酸‑2‑棕榈酸甘油三酯应用于制备花生油为例进行说明。

[0040] 应用例1一种花生油，其制备方法包括以下步骤：
S1：将花生粒在通风干燥处晾晒30‑40天，得到含水量为12％的花生粒，脱去外壳后，在80℃下干燥30min，得到预处理花生仁；
S2：将预处理花生仁进行粉碎、研磨成浆料后按照质量比为1:4与营养液混合，超声2h后得到共混物；
营养液由1，3‑二油酸‑2‑棕榈酸甘油三酯和乳化剂分散于乙醇中均质获得，营养液中各组分按质量分数计，包括55％的实施例1获得的1，3‑二油酸‑2‑棕榈酸甘油三酯和
5％的乳化剂，余量为乙醇，乳化剂为卵磷脂；
S3：将共混物在45℃下进行物理低温压榨，离心后得到上清油；
S4：向上清油中加入磷脂酶，在45℃酶解15min后灭酶，离心即得。

[0041] 应用例2一种花生油，其制备方法包括以下步骤：
S1：将花生粒在通风干燥处晾晒30‑40天，得到含水量为15％的花生粒，脱去外壳后，在90℃下干燥20min，得到预处理花生仁；
S2：将预处理花生仁进行粉碎、研磨成浆料后按照质量比为1:3与营养液混合，超声3h后得到共混物；
营养液由1，3‑二油酸‑2‑棕榈酸甘油三酯和乳化剂分散于乙醇中均质获得，营养液中各组分按质量分数计，包括35％的实施例2获得的1，3‑二油酸‑2‑棕榈酸甘油三酯和
1％的乳化剂，余量为乙醇，乳化剂为单甘油脂肪酸酯；
S3：将共混物在50℃下进行物理低温压榨，离心后得到上清油；
S4：向上清油中加入磷脂酶，在50℃酶解10min后灭酶，离心即得。

[0042] 应用例3一种花生油，其制备方法包括以下步骤：
S1：将花生粒在通风干燥处晾晒30‑40天，得到含水量为14％的花生粒，脱去外壳后，在85℃下干燥15min，得到预处理花生仁；
S2：将预处理花生仁进行粉碎、研磨成浆料后按照质量比为1:6与营养液混合，超声2h后得到共混物；
营养液由1，3‑二油酸‑2‑棕榈酸甘油三酯和乳化剂分散于乙醇中均质获得，营养液中各组分按质量分数计，包括45％的实施例3获得的1，3‑二油酸‑2‑棕榈酸甘油三酯和
3％的乳化剂，余量为乙醇，乳化剂为蔗糖脂肪酸脂；
S3：将共混物在40℃下进行物理低温压榨，离心后得到上清油；
S4：向上清油中加入磷脂酶，在40℃酶解15min后灭酶，离心即得。

[0043] 应用例4‑7一种花生油，与应用例1的区别在于，营养液中的1，3‑二油酸‑2‑棕榈酸甘油三酯来源如表1所示，其他步骤均与应用例1相同。

[0044] 表1应用例8
一种花生油，与应用例1的区别在于，营养液中的未添加1，3‑二油酸‑2‑棕榈酸甘油三酯，替换为同等质量的乙醇，其他步骤均与应用例1相同。

[0045] 性能检测试验测试例1
对实施例1‑5和对比例1‑2的制备方法所获得的1，3‑二油酸‑2‑棕榈酸甘油三酯，根据GB 30604—2015的要求测定SN‑2位棕榈酸(PA)的含量，使用反相高效液相色谱仪(RP‑HPLC)测定OPO的含量，记录结果如表2。

[0046] 表2组别 Sn‑2PA(％) OPO(％)
实施例1 56.82 39.97
实施例2 54.83 36.84
实施例3 55.33 37.24
实施例4 61.84 43.25
实施例5 60.61 42.70
对比例1 46.37 26.42
对比例2 50.95 31.64
根据表2中实施例1‑5和对比例1的性能检测结果可以看出，本申请的制备方法能够有效提高1，3‑二油酸‑2‑棕榈酸甘油三酯的产率和纯度，这是由于本申请的制备方法中先采用化学酯交换，降低了棕榈硬脂的熔点，使得在脂肪酶进行酶解时能够在更加适宜的温度下进行催化作用，更加有效的发挥脂肪酶的活性，与对比例1中直接采用高温进行酶解的方法相比，本申请的制备方法有效提升了1，3‑二油酸‑2‑棕榈酸甘油三酯的产率和纯度。

[0047] 根据实施例1‑5和对比例2的性能检测结果可以看出，在超临界CO2的条件下能够促进底物在反应脂肪酶催化结构中的传递，超临界状态下流体CO2同时起到溶剂和催化剂的作用，促进酶活性的发挥，由于CO2是非极性分子，可避免其它方法出现中毒和催化剂失活的现象，能够高效催化OPO的制备。

[0048] 根据实施例1‑3和实施例4‑5的性能检测结果可以看出，采用固化脂肪酶能够更加高效的催化酶法酸解反应的进行，在固定化的过程中，进一步提升了脂肪酶的稳定性和使用寿命，进一步减少了高温对脂肪酶活性的不利影响，保证了1，3‑二油酸‑2‑棕榈酸甘油三酯的产率和纯度。

[0049] 测试例2将应用例1‑8所获得的花生油于180℃进行加热，记录加热前和加热24h后花生油的过氧化值以及反式脂肪酸含量的变化，必将检测结果记录于表3。

[0050] 参照GB 5009.227‑2016测定其过氧化值；参照GB 5009.257‑2016测定其反式脂肪酸含量。

[0051] 表3根据表3的性能检测结果可以看出，随着加热时间的延长，花生油中的过氧化值逐渐增加，但是当于180℃加热24h后，应用例1‑7花生油中的过氧化值仍不超过2.0g/100g，这说明本申请的制备方法所制备的1，3‑二油酸‑2‑棕榈酸甘油三酯在应用于制备花生油时能够提升花生油的抗氧化能力，使得花生油具有更加稳定的性能，提升花生油的品质。

[0052] 测试例3将应用例1‑8所获得的花生油置于‑5‑0℃的水浴环境中，放置48h，观察油脂的状态，状态包括澄清透明、朦胧状态、凝胶状、絮状结晶、完全浑浊、少量晶核、严重发朦等几种情况，并将观察结果记录于表4。

[0053] 表4根据表4的性能检测结果可以看出，与应用例6高温酶解所制备的1，3‑二油酸‑2‑棕榈酸甘油三酯相比，本申请的制备方法所制备的1，3‑二油酸‑2‑棕榈酸甘油三酯在应用于制备食用油时表现出更稳定的性能。与未添加1，3‑二油酸‑2‑棕榈酸甘油三酯的组别相比，1，3‑二油酸‑2‑棕榈酸甘油三酯在应用于制备花生油时能够提升花生油的低温抗冻性能，长时间放置仍然是澄清透明，使得所制备的花生油性能更加稳定，低温下仍能保持良好的性能。

[0054] 本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。