[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是一种穿山甲鳞片重组角蛋白keratin‑α/β的制备方法。

[0002] 皮肤创伤是临床上较为常见的一类疾病，主要表现为皮肤组织的损伤，严重的可能引起全身性继发感染甚至死亡。因此，如何促进伤口快速愈合避免继发感染和并发症的出现是国内外研究的热点问题。近年来许多天然药物在促进皮肤创伤愈合方面取得了良好的临床效果。并且随着分子生物学的飞速发展和临床新技术的广泛应用，国内外学者越来越重视天然药物外用治疗皮肤创伤的修复机制。

[0003] 皮肤创伤修复是一个十分复杂的生物学过程，而中药材依靠其天然成分及副作用小等优点被广泛用于临床治疗，但仍需要更加客观、全面、深入地研究。而近年来动物毛发或鳞片的角蛋白，作为一种天然的生物材，依靠其良好的止血和促进伤口愈合的特性，在治疗严重烫伤、烧伤、瘀血性溃疡以及糖尿病足等方面被广泛使用。目前还尚未有关于穿山甲鳞片中角蛋白与伤口愈合等方面的研究。但我们前期研究发现穿山甲鳞片提取物对烫伤和创伤面具有较好的修复效果。

[0004] 角蛋白在动物上皮组织中具有较高的含量，主要是来源于外胚层分化细胞的结构蛋白。根据角蛋白是否纤维化，可以将角蛋白分为软角蛋白和硬角蛋白，这两种角蛋白的区别就在于含硫氨基酸量的差异。软角蛋白通常出现在皮肤和其它一些细胞组织中。纤维化的硬角蛋白则广泛存在于人和动物的表皮以及蛋壳的内膜中。毛发、羽毛、蹄、壳、爪、角、鳞片等的主要成分就是硬角蛋白组成。

[0005] 角蛋白具有独特的α‑螺旋和β‑折叠结构，分子内及分子间的二硫键使其稳定性和坚硬性更高，同时具有很好的生物相容性、细胞亲和性和生物可降解性的特点，所以在生物医用高分子材料具有广阔的应用前景。目前已被应用于铬鞣革填充物，动物饲料、橡胶乳、化妆品及护发产品等添加剂，伤口敷料，以及膜，水凝胶，等生物材料的制备，也可用于伤口的治疗等。

[0006] 角蛋白依靠其可快速止血、消炎和促进细胞增殖的特性，被广泛用于组织修复。目前科学家已利用羽毛中的角蛋白，制备了一系列的角蛋白基水凝胶，并以大鼠为治疗模型，证实其具有组织修复能力、生物相容性和低的细胞毒性。

[0007] 在我国动物中药材有着上千年的应用历史，其中动物的鳞片或角类因其确切的治疗作用，从古至今被广泛使用。而为了更好的保护和利用穿山甲资源，有必要探究其主要的药用成分，寻找有效的替代品用于临床疾病的治疗。

[0016] 为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。

[0017] 下述实施例中所用原料、试剂、试剂盒、设备等除特殊说明外，均为市购所得；其中：CHO‑K1细胞，购自ATCC）；DMEM完全培养基，购自Gibco；胎牛血清FBS，购自上海生工；0.25% 胰蛋白酶‑EDTA消化液（0.25%Trypsin‑EDTA），购自Gibco；GlutaMAX(100X)，购自Gibco；NEAA(100X)，购自海星生物；减血清培养基Opti‑MEM，购自Gibco；磷酸氯喹啉Chloroquine diphosphate，购自Sigma‑Aldrich；嘌呤霉素Puromycin Dihydrochloride，购自Biosharp；DL10000 Ladder，购自上海生工；细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，购自诺唯赞；FastPure Plasmid Mini Kit质粒提取试剂盒，购自诺唯赞；Omega /Endo‑free plasmid Mini Kit II‑fast无内毒素质粒提取试剂盒，购自Omega 公司；PCR产物回收试剂盒，购自诺唯赞；BCA试剂盒，购自雅酶。

[0018] S1、通过慢病毒包装方法将穿山甲鳞片重组角蛋白keratin‑α/β在CHO细胞上表达；S11、从Genbank获取keratin‑α/β基因序列，并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成含FLAG标签的keratin‑α/β基因序列，基因序列如下：
ATGGCTACCCAGATCTGCAGCCCAGTGTTCAGCAGTGGCAGCGTGAAGGGCCTGTGCGGGACCGCCGGAAGTCTGAGCAGAGTGACTTCTGTGAGGAGCCTGGGCTCTTGCAGGGTGCCTTCCCTGGCCGGCGCTGTGGGGTCCGCTTCCTCCATCAGGCTCGGACTGAGCGGCTTCGGTTCCTGCCTGCCAGGCCCATACCTGTCTACCGGGTGCTACCCCTCTGGGTTCGGTAGCGGCGGCCTGTTCTTCGAGGGCGCCTTCAATGGAAGCGAGAAGGAGACGATGCAGTTCCTCAATGACAGGCTGGCTAGCTACCTGGAGAAGGTGAGACAGCTGGAGAGGGAGAACGCCGAACTGGAGAGGCGCATCAGAGAGTGGTACGAGGCCCAGATCCCATATATCTGTCCAGACTACCAGTCTTACTACAAGACCATTGAGGAGCTGCAGCAGAAGATCCTGCTGACCAAGGCTGAGAACGCCCGCCTGGTGCTGCAGATTGACAACGCCAAACTGGCCGCCGATGACTTTCGCACCAAGTACGAGACCGAGCTGGGCCTGAGACAGCTGGTGGAGGCCGACATCAACGGCCTGAGGCGCATCCTCGACGAGCTGACACTGTGTAGGGCCGATCTGGAGATGCAGGTGGAGTCTCTCAAGGAGGAACTGCTGTGTCTGAAGAAGAACCATGAAGAAGAGGTGAACGCCCTGCGGGGACAGCTCGGCGACCGCCTGAACGTGGAGGTGGACGCCGCCCCAACAGTGGATCTGAATAAGATTCTGGACGACATGAGATGCCAGTACGAGACACTGGTGGAGAACAATAGAAGAGACGTGGAAGCCTGGTTCAACACACAGACTGAGGAGCTGAACCAGCAGGTGGTGTCTAGCAGCGAACAGCTGCAGTCCTGTCAGACCGACATCATCGAGCTGCGCCGCACCGTGAACGCCCTGGAGATCGAACTGCAGGCGCAGCACAGCATGCGGTCCAGCCTGGAAAGCACCCTGACAGAGACCGAAGCTAGATACAGCTCTCAGCTGAGCCAGCTGCAGTTCATGATCACAAACGTGGAGAGCCAGCTGGCAGAGATCAGATGCGACCTGGAGCGGCAGAACCAGGAGTACCAGGTCCTGTTGGACGTGAAGGCTCGCCTGGAGTCTGAGATCGCCACATACCGGCGGCTCCTGGAGGGCGAAGACTCCAAGCTGCCTCCTCACCCATGTGCTACCGAGTGCAAGCCCGCCATCCGGGTGCCTTACATCCCTGCTGTGCCTTGTGCCCCCACCGTGCCATGTGCCCCCGGCCCACAGATCAGCACCCAGATCAGAACCATCACTGAGGAGATCAGGGACGGTAAGGTGATCTCCTCTCGGGAGCACCTGCAGCCTTGTCCCCTGAGGAGAAAGAGGGGCTCCGGCGGCGCAACAAACTTCTCTCTGCTGAAACAAGCCGGAGATGTCGAAGAGAATCCTGGACCGATGAGCTGCAGGTCTTACCGTGTGAGCTCCGGAAGACAGATTGGCAACTTTTCTTCCTGTTCCGCCGTGATGCCTCAGAGCCTGTCTCGTTTCAGAGCCAGTTCCGTCTCCTGCCGGAGCGGCCCAGGATTTAGAGGACTGGGCGGGTTCGGGTCTCGCAGCGTGATCGCCTTTGGCAGCTGTCCTCCTCGAATGGCTGCAGTGGGACCACGCCCCATCAGGTGCGGCGTGGGGTTCTCTGCCGGGAGCGGGCTGGCCTTCGGCCTCGGCGACTCTTGCGGCGCCGGCCTGGGCTTCGGAACCGGCTCTGGACTGGGCTACGGCTTTGGGGGACCCGGGTTTGGATATAGGATCGGCGGAGTGGGGGTGCCTGCCGCCCCTTCCATCACCGCCGTGACCGTCAACCAGTCCCTGCTGACTCCACTGAATCTGGAGATTGATCCCAACGCACAGCGCGTCAAGAGGGACGAGAAGGAGCAGATCAAGACCCTGAACAACAAGTTCGCCAGCTTCATCGACAAGGTGAGATTTCTGGAGCAGCAGAACAAGCTGCTGGAGACCAAGTGGAACTTCCTGCAGGATCAGAAGGGGGTGCAGTCCAACCTGGAGCCACTGTTCGAGAACTACGTGGCCAACCTCAGAAGGCAGCTGGACATTGTGAGCTCTGATCAGGCTAGACTGGAAACTGAAAGGAACAACATGCAGGACGTTCTGGAGGGGTTCAAGAAGAAGTATGAGGAGGAGGTGGTGTTCAGAGCCAACGCCGAGAACGAGTTCGTGGCCCTGAAAAAGGACGTGGACGCAGCTTTCCTGAACAAGTCTGATCTGGAGGCTAACGTGGATGCTCTGATCCAGGAGATTGATTTCCTGAAGAACCTGTATATGGCTGAGATTCAGCTGCTGCAGAGTCACATCAGCGACACTAGCGTGATCGTGAAGATGGACAATTCCAGGGATCTGAACTTCGACGGCATCATCGCTGAGGTGAAGGCCCAGTACGAGGAGGTGGCTCGGAGATCCCGCGCCGACGCCGAGGCCTGGTATCAGACAAAGTATGAGGAAATGAGAATGACCGCCGGCCAGCACTCCGATAACCTGCGGAACACTAGAGACGAAATCAACGAGCTCACCCGGGTGATTCAGCGCCTGAAGGCCGAGATTGAGCATACTAAGGCTCAGCGCGCCAAGCTGGAAGCCGCCATTGCCGAGGCTGAGCAGCAGGGAGAGGCTGCCCTGAACGACGCCAAGTGCAAGCTGGCCGATCTGGAGGCCGCCCTGCAGCAGGCCAAGCAGGACATGGCCCGGCAGCTGAGGGAATATCAGGAGCTGATGAACATCAAGCTGGCCCTGGACATTGAGATCGCCACCTACAGAAGGCTGCTGGAGGGCGAAGAGATCAGAATCTGCGAGGGAGTGGGCCCTGTGAATATCTCCGTTTCTTCCTCCAGAGGAGGCGTGGTGTGCGGCCCTGAGCCATTGCTGACCTCAAGTACCCTGTCCCGGGGGGGCGTGACCTTCTCTGGCGGGAGTTCCATTCGCTCCTCCGGGGCCTGCGGCCTGAGTCTGGGGGGGTCTCGGGTGGTGGCTGCTGGTGGCGATGTGCTCAGCGCCGGGTCCAGAGGTGGCAGCGTCCTGGTGGGCGACGCCTGCGCCCCATCCATCCCATGTCCTCTGCCCACCGACGGCGGATTCAGCAGTTGCAGCGGCGGACGCTCAAGCCTGGGCAGCTCCGTGAGATTTGTGTCTACCACTACATCCAGAAGGACCAAATACGGCGGATCCGGCGACTATAAAGATCATGACGGAGATTATAAGGATCATGACATTGATTACAAAGATGATGATGACAAGTGA；
利用ClonExpress II One Step Cloning Kit（诺唯赞克隆试剂盒）将keratin‑α/β基因克隆至pLenti‑CMV‑P2A‑Puro（购自广州艾迪基因）载体上，在超净工作台中取50μL DH5α，加入10 μL连接产物吹打混匀，冰浴半小时；然后放入42℃水浴锅90S，再冰浴1 min；
再超净台中加900 μL LB培养液放入37℃摇床50min后5000rpm离心，吸取上清液剩250μL均匀涂布于含Amp抗性LB平板中， 37℃培养18h；
S12、取10mL LB平板中的菌液室温5000rpm离心收集菌体，去除上清；
S13、加入3mL溶液P1（含RNaseA）（来源于Omega /Endo‑free plasmid Mini Kit II‑fast无内毒素质粒提取试剂盒），重悬细菌沉淀；
S14、加入3mL溶液P2（来源于Omega /Endo‑free plasmid Mini Kit II‑fast无内毒素质粒提取试剂盒），立即温和地上下翻转6‑8次，室温放置5min；
S15、加入3mL溶液P4（来源于Omega /Endo‑free plasmid Mini Kit II‑fast无内毒素质粒提取试剂盒），立即温和地上下翻转6‑8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀，然后室温放置10min左右，12000rpm离心10min，收集上清液；
S16、将收集的上清液分次加入过滤柱CS，12000 rpm离心2min，收集滤液；
S17、向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP4中；
S18、室温12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
S19、向吸附柱CP4中加入500µL去蛋白液PD，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中；
S110、向吸附柱CP4中加入600µL漂洗液PW，12000 rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中；
S111、向吸附柱CP4中加入600µL漂洗液PW，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；
S112、将吸附柱CP4重新放回收集管中，12000rpm离心2min，置于室温放置数分钟，晾干吸附材料中残余的漂洗液；
S113、将吸附柱CP4置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100µL洗脱缓冲液TB，室温放置2min，12000rpm离心1min，得到pLenti‑CMV‑Ha6‑P2A‑Hb4‑
3xFLAG‑EF1a‑Puro质粒溶液，收集到离心管中，‑20℃保存或送测序鉴定，其质粒图谱如图1所示；鉴定正确的重组质粒用于后续实验；
S114、使用加入了10% 胎牛血清的DMEM完全培养基在温度为37℃及CO2浓度为5%的培养箱中培养人胚胎肾细胞HEK293T（购自ATCC），使其处于贴壁生长，密度达到80%，形态为上皮样的生长旺盛状态；
S115、病毒包装前，弃去旧培养液，加入新的含10�S的DMEM完全培养基（购自Gibco公司），在培养箱中继续培养5h；
S116、使用5 µg pLenti‑CMV‑Ha6‑P2A‑Hb4‑3xFLAG‑EF1a‑Puro质粒溶液、4 µg慢病毒包装质粒psPAX、1.5 µg慢病毒包装质粒pMD2.G，添加减血清培养基Opti‑MEM至250 µL配制成质粒混合液；使用31.2 µL聚醚酰亚胺PEI，添加减血清培养基Opti‑MEM至250 µL配制成聚醚酰亚胺转染减血清培养基PEI‑Opti‑MEM；将聚醚酰亚胺转染减血清培养基PEI‑Opti‑MEM加入质粒混合液中，轻弹管壁混匀，室温静置孵育15min；
S117、将步骤S116的混合液滴加到步骤S115的培养液中，轻轻晃动摇匀，在温度为
37℃及CO2浓度为5%的培养箱中继续培养；
S118、18h后吸去培养基，加入5mL新配制的含10% FBS的DMEM完全培养基（购自Gibco公司）；
S119、48h后收集培养上清，离心，用0.45µm滤膜过滤，液氮速冻，得到重组病毒液，‑80℃保存；
S120、从液氮罐中取出冻存的CHO‑K1细胞，在37℃水浴中迅速摇晃解冻，将解冻后的CHO‑K1细胞转移到含有5mL DMEM完全培养基的离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清液，补加4‑6mL完全培养基后吹匀，接种于T25培养瓶中，在温度为37℃及CO2浓度为5%的培养箱中培养过夜，第二天换液并检查细胞密度，细胞密度达到80%‑90%时，加入1mL胰酶消化
1分钟，使CHO‑K1细胞分离成单个，终止消化；离心，弃上清，加入含50% F‑12K培养基及10% FBS的DMEM完全培养基重悬CHO‑K1细胞，计数；
5
S121、在六孔板中加入500µL的重组病毒液，随后立即加入1×10个CHO‑K1细胞摇
5
匀；于培养箱中静置培养48h，作为实验组；同时在六孔板中加入1×10个CHO‑K1细胞摇匀；
于培养箱中静置培养48h，作为对照组；
S122、待实验组和对照组的细胞培养48h后，更换含8μg/mL的嘌呤霉素、含F‑12K培养基及10�S的DMEM完全培养基，随后每48h更换一次；
S123、筛选5d后，至对照组CHO‑K1细胞全部死亡，此时实验组未死亡的CHO‑K1细胞即为阳性CHO‑K1细胞，阳性细胞的显微镜图如图2所示；
S2、通过反应器放大培养和镍柱亲和层析方法获得高纯度穿山甲鳞片重组角蛋白keratin‑α/β；
S21、将获得的阳性CHO‑K1细胞用含F‑12K培养基及10�S的完全培养基（购自Gibco公司）进行扩大培养，得到穿山甲鳞片重组角蛋白keratin‑α/β培养液；
S22、利用GST标签蛋白的纯化亲和预装柱纯化对穿山甲鳞片重组角蛋白keratin‑α/β培养液进行纯化，得到高纯度穿山甲鳞片重组角蛋白keratin‑α/β。

[0019] Western Blot验证1)用RIPA裂解液提取过表达多克隆、单克隆细胞及野生型细胞的总蛋白，BCA法测定样品蛋白浓度；
2)蛋白上样量：20μg；
3)配制10%分离胶与5%浓缩胶，进行SDS‑PAGE电泳，转膜；
4)免疫杂交：一抗MonoclonalANTI‑FLAG®M2CloneM21:1000，3%脱脂奶粉溶液；二抗（羊抗鼠）1:10000，5%脱脂奶粉溶液；
5) ECL化学发光显色。

[0020] 得到CHO‑K1细胞基因过表达稳转细胞株WB出现预期结果的目的蛋白条带如图3所示，W10为CHO‑K1对照细胞提取蛋白组，W11 为重组keratin‑α/β后的CHO‑K1细胞提取的蛋白组，由图3可知，过表达多克隆CHO‑K1细胞株构建成功，且能产生穿山甲鳞片重组角蛋白keratin‑α/β。

[0021] 本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。