[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于治疗圆锥角膜的类病毒状阳离子钌基纳米颗粒的制备和使用方法。

[0002] 圆锥角膜患者表现为角膜中央变薄并向前形成锥形突出，已经成为临床常见的致盲性眼病，每400‑2000人就存在1名圆锥角膜患者，且多发于青年人。基于核黄素的去角膜上皮胶原交联术作为圆锥角膜有前途的治疗方法，是通过紫外线激发核黄素生成单线态氧或自由基，与胶原纤维上的氨基酸残基建立官能团之间的共价交联键连接。然而，核黄素对角膜上皮基质的渗透率很低，为避免刮除角膜上皮带来诸如感染和角膜融解等多种并发症，通过辅以促渗剂可以更高效地实现跨角膜上皮交联。例如，意大利专利MI2007A002162利用苯扎氯铵作为促渗剂，可以将核黄素渗透进角膜基质中交联角膜胶原；CN102470120A提出氨基酸、辅酶Q、维生素E、L‑脯氨酸、甘氨酸、赖氨酸盐酸盐、L‑亮氨酸、L‑精氨酸以及用于刺激金属蛋白酶MMP9产生的化合物可以作为渗透增强剂，与核黄素‑葡聚糖溶液组成眼用溶液来实现跨角膜上皮交联治疗圆锥角膜；CN102164592B公开了可与核黄素一起使用的增强剂，包括与氨基丁三醇联合的EDTA、与氨基丁三醇联合的EDTA钠和与氨基丁三醇联合的EDTA钾的单独使用或混合使用，用于改善核黄素的吸收来提高圆锥角膜的治疗效果；CN115177729B公开了一种肾上腺素受体激动剂作为圆锥角膜交联促渗剂，可以有效促进核黄素渗透入角膜基质。此外，治疗过程中眼睛需较长时间(共约30分钟)暴露于紫外线下，这增加了造成角膜上皮不可逆损伤和角膜水肿、永久性角膜混浊、角膜内皮衰竭等多种术后并发症。因此，一种可跨角膜上皮进入角膜基质中、不依赖紫外光介导交联的高渗透交联剂，对于实现无创治疗圆锥角膜具有重要意义。

[0003] 钌基衍生物在可见光催化下的单电子转移效应可以有效交联角膜糖蛋白或胶原纤维中的酪氨酸基团，可以作为替代核黄素，成为可见光介导交联治疗圆锥角膜有希望的药物。另外，病毒由于其丰富的细胞表面功能基团、拓扑结构和纳米尺度而具备自然界中最高效的跨膜转运机制，受病毒启发的类病毒纳米颗粒(＜100nm)通过表面修饰模仿病毒的生物拓扑结构和表界面功能，有望促进钌基衍生物渗透入角膜基质。此外，针对角膜上皮细胞表面的负电性，表面带正电荷的纳米颗粒可以通过吸附介导效应来进一步提高其跨角膜上皮的递送效率。因此，开发一种表面带正电荷的类病毒状阳离子钌基纳米颗粒作为高渗透交联剂，有望实现可见光下高效跨角膜上皮交联治疗圆锥角膜。

[0004] 为了进一步阐释本发明的特点，申请人进一步做了相关检索，下面进行初阐释：

[0005] 现有技术WO2024054165A1，公开了一种用于治疗眼部疾病的钌化合物可见光诱导角膜交联的方法和药物组合物，其包含治疗有效量的钌化合物和过硫酸钠；药学上可接受的载体；

[0006] WO2017095240A1中，提到钌和SPS(过硫酸钠)化合物一起用作光聚合过程的光引发剂。所使用的波长范围在400‑700nm之间，更优选400‑450nm。据称，使用可见光和钌‑SPS混合物的方法对细胞的光毒性较小，可用于组织工程。但该现有技术主要用来制作水凝胶。

[0007] 通过上述现有技术的阐释，本领域技术人员可知，目前用于治疗圆锥角膜的相关药品具有如下特点：

[0008] 1、大部分现有技术以核黄素为基础，通过紫外线激发核黄素生成单线态氧或自由基，与胶原纤维上的氨基酸残基建立官能团之间的共价交联键连接；

[0009] 2、以WO2024054165A1为代表的，钌化合物可见光诱导角膜交联的方法和药物组合物。

[0010] 但这两种技术各存在如下缺陷：

[0011] (1)核黄素对角膜上皮基质的渗透率很低，治疗过程中眼睛需较长时间(共约30分钟)暴露于紫外线下，容易造成这增加了造成角膜上皮不可逆损伤和角膜水肿、永久性角膜混浊、角膜内皮衰竭等多种术后并发症；

[0012] (2)WO2024054165A1虽然以钌化合物和过硫酸钠为基础，但两者的协同作用仍然较小，并且该技术未解决对角膜上皮机制的渗透率低下问题，在使用时需要刮除眼角膜上皮层，容易造成如感染和角膜融解等多种术后并发症；

[0013] (3)目前大部分现有技术都只交联了角膜胶原，未能通过两重交联机制实现更紧密的角膜交联治疗(交联角膜基质中的糖蛋白和角膜胶原纤维)；

[0014] (4)目前，大部分现有技术未能注意到制备类病毒纳米颗粒的技术研发路线，也没有注意到利用纳米尺度和生物拓扑结构来促进跨角膜上皮效率，同时也没有注意到利用类病毒状阳离子钌基纳米颗粒表面的阳离子与角膜上皮细胞表面的负电性通过吸附介导效应实现跨角膜上皮高效渗透入角膜基质中。

[0045] 下文将结合附图以及具体实施案例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当了解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

[0046] 参见图1，本发明提供的一种类病毒状阳离子钌基纳米颗粒，可以用于无创治疗圆锥角膜，如图1所示，主要由三羧基吡啶钌10％～20％，氨基化聚合物40％～50％、羧基化聚合物40％～50％、羧基苯硼酸1％～2％、和聚乙烯醇1％～5％组成，其余组分为药学上可接受的载体。本领域技术人员可以明了，此处为质量分数。

[0047] 本发明提供的一种类病毒状阳离子钌基纳米颗粒主要通过以下步骤制备得到：

[0048] 步骤一，制备阳离子钌基聚合物

[0049] 主要由下述组分制备而成：三羧基吡啶钌、氨基化聚合物、EDC和NHS。将EDC和NHS混合制得EDC/NHS混合溶液，将三羧基吡啶钌与氨基化聚合物加入上述制得的EDC/NHS混合溶液中进行脱水缩合反应，制得阳离子钌基聚合物；如图2所示为三羧基吡啶钌、阳离子钌基聚合物的傅里叶红外光谱图；

[0050] 步骤二，制备阳离子钌基空心纳米核

[0051] 主要由下述组分制备而成：阳离子钌基聚合物、EDC/NHS混合溶液、二氧化硅纳米颗粒、羧基化聚合物、无水乙醇和1％氢氟酸溶液。首先分别用所述无水乙醇溶解阳离子钌基聚合物和羧基化聚合物，分别制得阳离子钌基聚合物溶液和羧基化聚合物溶液；其次将二氧化硅纳米颗粒分散于阳离子钌基聚合物溶液中，充分搅拌后在≥12000转/分钟的转速下离心，得到的阳离子钌基聚合物包覆的二氧化硅纳米颗粒放入到羧基化聚合物溶液中，充分搅拌后得到[羧基化聚合物/阳离子钌基聚合物]1包覆的二氧化硅纳米颗粒，重复上述步骤n次后放入EDC/NHS混合溶液中进行核壳交联，制得[羧基化聚合物/阳离子钌基聚合物]n包覆的二氧化硅纳米颗，具体的，所述n≥3；最后将上述制得的[羧基化聚合物/阳离子钌基聚合物]n包覆的二氧化硅纳米颗粒分散于1％氢氟酸溶液中进行10‑25分钟的刻蚀后，制得去除了二氧化硅的阳离子钌基空心纳米核，在≥12000转/分钟的转速下离心收集；如图2所示为制得的阳离子钌基空心纳米核的傅里叶红外光谱图

[0052] 步骤三，制备类病毒状阳离子钌基纳米颗粒

[0053] 主要由下述组分制备而成：阳离子钌基空心纳米核、EDC/NHS混合溶液、羧基苯硼酸、聚乙烯醇和去离子水。先将阳离子钌基空心纳米核和羧基苯硼酸放入上述制得的EDC/NHS混合溶液中反应60‑90分钟，制得由羧基苯硼酸修饰表面的阳离子钌基空心纳米核；具体的，羧基苯硼酸用于靶向角膜基质，与角膜基质中的糖蛋白交联；再将上述制得的由羧基苯硼酸修饰表面的阳离子钌基空心纳米核分散到去离子水中，并在上述溶液中加入聚乙烯醇，搅拌100‑360分钟后制得类病毒状阳离子钌基纳米颗粒，如图1所示为制得的类病毒状阳离子钌基纳米颗粒的透射电子显微镜图，如图2所示为制得的类病毒状阳离子钌基纳米颗粒的傅里叶红外光谱图；

[0054] 具体的，聚乙烯醇用于包裹类病毒状阳离子钌基纳米颗粒的表面，避免类病毒状阳离子钌基纳米颗粒粘附角膜上皮。

[0055] 在本发明的优选实施例中，所述步骤一至步骤三中的EDC和NHS按质量比为7:2、7:1、8:1或4:1的比例混合制得EDC/NHS混合溶液。

[0056] 在本发明的优选实施例中，所述氨基化聚合物包括聚赖氨酸、聚酰胺、尿素和聚乳酸等中的至少一种。

[0057] 在本发明的优选实施例中，所述羧基化聚合物包括聚乙烯酸、聚丙烯酸、丙烯酸乙烯酯共聚物和马来酸共聚物等中的至少一种。

[0058] 本发明提供的一种用于治疗圆锥角膜的类病毒状阳离子钌基纳米颗粒的使用方法，还包括过硫酸铵1％‑2％。先将类病毒状阳离子钌基纳米颗粒分散于去离子水中，再将过硫酸铵加入到上述溶液中，充分搅拌至过硫酸铵完全溶解后制得类病毒状阳离子钌基纳米颗粒眼用溶液1，将类病毒状阳离子钌基纳米颗粒眼用溶液1滴在圆锥角膜眼表约30分钟后，用可见光2照射5‑10分钟，重复2‑5次，每次间隔5‑10分钟；具体的，可见光2波段范围为400‑650nm，强度为2‑5W/cm2；

[0059] 具体的，类病毒状阳离子钌基纳米颗粒眼用溶液1滴在眼表上后，与角膜通过下述两重交联机制协同治疗圆锥角膜：

[0060] 第一重交联机制，类病毒状阳离子钌基纳米颗粒表面的阳离子与角膜上皮细胞表面的负电性通过吸附介导效应实现跨上皮渗透入角膜基质中，聚乙烯醇降解，所述羧基苯硼酸暴露并解除角膜基质中的多糖分子，通过硼酸酯键交联角膜基质中的糖蛋白；

[0061] 第二重交联机制，在过硫酸根铵和可见光的催化下，类病毒状阳离子钌基纳米颗粒中的阳离子钌基聚合物通过二酪氨酸基团交联角膜胶原纤维。

[0062] 下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。

[0063] 实施例1提供了所述类病毒状阳离子钌基纳米颗粒的一种具体制备案例，包括以下三个步骤：

[0064] 步骤一，制备阳离子钌基聚合物

[0065] 将EDC和NHS按7:1比例混合制得EDC/NHS混合溶液，将20mg三羧基吡啶钌与100mg聚赖氨酸加入上述制得的20mL的EDC/NHS混合溶液中进行脱水缩合反应，制得阳离子钌基聚合物；

[0066] 步骤二，制备阳离子钌基空心纳米核

[0067] 分别取100mg阳离子钌基聚合物和100mg聚丙烯酸，用10mL无水乙醇溶解制得阳离子钌基聚合物溶液和聚丙烯酸溶液；

[0068] 将100mg二氧化硅纳米颗粒分散于阳离子钌基聚合物溶液中，充分搅拌后在14000转/分钟的转速下离心，得到的阳离子钌基聚合物包覆的二氧化硅纳米颗粒放入到所述聚丙烯酸溶液中，充分搅拌后得到[聚丙烯酸/阳离子钌基聚合物]1包覆的二氧化硅纳米颗粒，重复上述步骤3次后放入所述EDC/NHS混合溶液中进行核壳交联，制得[聚丙烯酸/阳离子钌基聚合物]3包覆的二氧化硅纳米颗粒；

[0069] 将上述制得的[聚丙烯酸/阳离子钌基聚合物]3包覆的二氧化硅纳米颗粒分散于20mL的1％氢氟酸溶液中进行20分钟的刻蚀反应，在14000转/分钟的转速下离心收集，制得去除了二氧化硅的阳离子钌基空心纳米核；

[0070] 步骤三，制备类病毒状阳离子钌基纳米颗粒

[0071] 取步骤二制得的10mg阳离子钌基空心纳米核和100mg羧基苯硼酸放入EDC/NHS混合溶液中反应60分钟，制得由羧基苯硼酸修饰表面的阳离子钌基空心纳米核；

[0072] 将上述制得的由羧基苯硼酸修饰表面的阳离子钌基空心纳米核分散到50mL的去离子水中，并在上述溶液中加入100mg聚乙烯醇，搅拌120分钟后制得类病毒状阳离子钌基纳米颗粒。

[0073] 实施例2提供了所述类病毒状阳离子钌基纳米颗粒的一种具体制备案例，包括以下三个步骤：

[0074] 步骤一，制备阳离子钌基聚合物

[0075] 将EDC和NHS按4:1比例混合制得EDC/NHS混合溶液，将15mg三羧基吡啶钌与50mg尿素加入上述制得的EDC/NHS混合溶液中进行脱水缩合反应，制得阳离子钌基聚合物；

[0076] 步骤二，制备阳离子钌基空心纳米核

[0077] 分别取50mg阳离子钌基聚合物和40mg马来酸共聚物，用5mL无水乙醇溶解制得阳离子钌基聚合物溶液和马来酸共聚物溶液；

[0078] 将50mg二氧化硅纳米颗粒分散于所述阳离子钌基聚合物溶液中，充分搅拌后在15000转/分钟的转速下离心，得到的阳离子钌基聚合物包覆的二氧化硅纳米颗粒放入到所述马来酸共聚物溶液中，充分搅拌后得到[马来酸共聚物/阳离子钌基聚合物]1包覆的二氧化硅纳米颗粒，重复上述步骤5次后放入所述EDC/NHS混合溶液中进行核壳交联，制得[马来酸共聚物/阳离子钌基聚合物]5包覆的二氧化硅纳米颗粒；

[0079] 将上述制得的[马来酸共聚物/阳离子钌基聚合物]5包覆的二氧化硅纳米颗粒分散于10mL的1％氢氟酸溶液中进行20分钟的刻蚀，在15000转/分钟的转速下离心收集，制得去除了二氧化硅的阳离子钌基空心纳米核；

[0080] 步骤三，制备类病毒状阳离子钌基纳米颗粒

[0081] 取步骤二制得的10mg阳离子钌基空心纳米核和100mg羧基苯硼酸放入EDC/NHS混合溶液中反应90分钟，制得由羧基苯硼酸修饰表面的阳离子钌基空心纳米核；

[0082] 将上述制得的由羧基苯硼酸修饰表面的阳离子钌基空心纳米核分散到去离子水中，并在上述溶液中加入200mg聚乙烯醇，搅拌180分钟后制得类病毒状阳离子钌基纳米颗粒。

[0083] 实施例3提供了所述类病毒状阳离子钌基纳米颗粒联合可见光2介导治疗离体兔角膜3的一种具体使用方法和治疗情况：

[0084] 称取1mg类病毒状阳离子钌基纳米颗粒放入1mL去离子水中，放入超声清洗机中超声分散360秒，再加入10μg过硫酸铵，充分搅拌至过硫酸铵完全溶解，制得类病毒状阳离子钌基纳米颗粒眼用溶液1，常温下孵育30分钟。如图3所示，用滴管每次吸取300μL眼用溶液并逐滴滴在离体兔角膜3眼表30分钟后，用强度3W/cm2的480nm可见光2照射10分钟，重复3次，每次间隔10分钟。为了评估类病毒状阳离子钌基纳米颗粒对离体兔角膜3的治疗情况，将经类病毒状阳离子钌基纳米颗粒治疗后的离体兔角膜3分别浸入20mL的0.1％胶原纤维溶解酶溶液中，如图4和图5所示，经类病毒状阳离子钌基纳米颗粒联合可见光2介导治疗的离体兔角膜3能够抵抗胶原纤维溶解酶的降解作用，在12小时后仍保留有50％的角膜。

[0085] 比较例1提供了去离子水联合可见光2介导治疗离体兔角膜3的治疗情况：

[0086] 取1mL去离子水常温下孵育30分钟，用滴管每次吸取300μL去离子水用溶液并逐滴滴在离体兔角膜3眼表30分钟后，用强度3W/cm2的480nm可见光2照射10分钟，重复3次，每次间隔10分钟。将去离子水联合可见光2介导治疗的离体兔角膜3放入20mL的0.1％胶原纤维溶解酶溶液中，如图4和图5所示，经去离子水联合可见光2介入治疗的离体兔角膜3在12小时后被完全降解掉。

[0087] 比较例2提供了使用核黄素联合紫外光治疗离体兔角膜3的治疗情况：

[0088] 取1mg核黄素分子溶解于1mL去离子水中制得核黄素眼用溶液，常温下孵育30分钟，用滴管每次吸取300μL核黄素眼用溶液并逐滴滴在离体兔角膜3眼表30分钟后，用强度3W/cm2的365nm紫外光照射10分钟，重复3次，每次间隔10分钟。将核黄素分子联合紫外光介入治疗的离体兔角膜3放入20mL的0.1％胶原纤维溶解酶溶液中，如图4和图5所示，经核黄素分子联合紫外光介入治疗的离体兔角膜3在12小时后被完全降解掉。

[0089] 此外，本领域技术人员可以明了的是，本发明中各个组分或者是质量分数或者是体积分数，其余未提及的组分是药学上可接受的组分或辅料，此处不再赘述。最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。